強(qiáng)脈沖光對(duì)培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞表達(dá)ＭＭＰ－１和ＴＩＭＰ－１的影響

[摘要]目的：觀察強(qiáng)脈沖光照射對(duì)體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP-1)的影響，探討IPL嫩膚作用的分子生物學(xué)機(jī)制。方法：采用能量密度分別為20、25、30J/cm²的強(qiáng)脈沖光對(duì)培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞進(jìn)行照射，于照射后24h及48h應(yīng)用ELISA法測(cè)定上清液中MMP-1和TIMP-1的表達(dá)并與對(duì)照組比較。結(jié)果：照射24h后25及30J/cm²組上清液中檢測(cè)到的MMP-1、TIMP-1含量輕度升高；48h時(shí)各能量組MMP-1均升高，但各組間并無(wú)顯著性差異。TIMP-1隨能量的升高而含量增高。結(jié)論：強(qiáng)脈沖光照射成纖維細(xì)胞后可引起MMP-1，TIMP-1表達(dá)的增加，但是TIMP-1的增加遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于MMP-1的增加，提示IPL嫩膚作用的生物學(xué)機(jī)制可能與成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的TIMP-1增加有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]強(qiáng)脈沖光；成纖維細(xì)胞；MMP-1；TIMP-1

[中圖分類號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008－6455(2007)07－0885－03

細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular mattix，ECM)在維持正常組織與功能及細(xì)胞生長(zhǎng)、分化過(guò)程中起著非常蓖要的作用，它處于不斷新陳代謝、降解重塑的動(dòng)態(tài)平衡中?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metal－loproteiEases，MMP)是降解ECM的重要酶類，幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分。而組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metallopro－teiEase，TIMP)是MMP的天然抑制物，是一組能抑制MMP活性的多功能因子。MMP和TIMP之間的平衡關(guān)系在調(diào)節(jié)ECM的穩(wěn)定中有重要作用。

臨床實(shí)踐證明強(qiáng)脈沖光(IPL)可有效改善面部皮膚光老化，但生物學(xué)機(jī)制尚不完全清楚。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道IPL通過(guò)光熱解效應(yīng)對(duì)組織產(chǎn)生一定程度熱損傷而啟動(dòng)損傷修復(fù)機(jī)制達(dá)到組織重塑的目的，但在對(duì)組織修復(fù)機(jī)制的研究中，MMP-1和TIMP-1在其中作用的研究報(bào)道少見(jiàn)。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)觀察IPL作用于培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞后，上清液中表達(dá)MMP-1和TIMP-l動(dòng)態(tài)變化的影響，從蛋白水平研究IPL在治療皮膚光老化過(guò)程中MMP-1和TIMP-l所起的作用，以探討強(qiáng)脈沖光(IPL)治療作用的生物學(xué)機(jī)制。

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材料和方法

1．1 試驗(yàn)儀器：IPL Quantum SR光子嫩膚儀(Lume－nis公司)，臺(tái)式高速離心機(jī)，恒溫水浴箱，酶標(biāo)儀(美國(guó)450型酶聯(lián)檢測(cè)儀)。

1．2 細(xì)胞準(zhǔn)備及實(shí)驗(yàn)分組

1．2．1 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)：取正常兒童包皮組織，應(yīng)用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)，培養(yǎng)成功后傳代培養(yǎng)，試驗(yàn)時(shí)用第三代至第五代細(xì)胞。

1．2．2 實(shí)驗(yàn)分組

1．2．2．1 實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組為空白，實(shí)驗(yàn)組照射參數(shù)參照臨床常用治療參數(shù)，即波長(zhǎng)選擇為560－1200nm脈沖類型為雙脈沖，脈寬為34ms(第一子脈沖3.0ms，延遲25ms，第二脈沖6.0ms)，分為三組，能量密度分別為20J/cm²，25j/cm²，30J/cm²。

1．2．2．2 樣品準(zhǔn)備：①每孔2×10⁵個(gè)細(xì)胞接種于3.5cm培養(yǎng)板中，細(xì)胞生長(zhǎng)至亞融合時(shí)給予IPL照射。將亞融合狀態(tài)的培養(yǎng)細(xì)胞分為照光組(6個(gè))和對(duì)照組(1個(gè))，每次共7皿，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)4次。照射前細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)換液，使PBS剛好覆蓋細(xì)胞，室內(nèi)消毒1h，槍頭用75％酒精擦拭，采用Quantum SR光子嫩膚儀，每個(gè)培養(yǎng)皿照射5次， 能量密度分別為20j/cm²，25J/cm²，30j/cm²，每組能量?jī)蓚€(gè)培養(yǎng)皿。照射后棄去覆蓋液PBS，在成纖維細(xì)胞中加入DMEM培養(yǎng)基，并全部放回孵箱繼續(xù)培養(yǎng)，對(duì)照組除未給予IPL照射外，其余與照光組處理相同。②24h及48h后分別收集培養(yǎng)液的上清液置Ep管中，放置于-20℃冰箱冷藏備用。

1．3 上清液中MMP-1和TIMP-1的檢測(cè)：采用雙抗體夾心ABC－ELISA法，在492nm處測(cè)OD值，MMP－1濃度與OD值成正比，可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中MMP-1濃度。人TIMP-1酶聯(lián)免疫測(cè)定步驟及結(jié)果判斷同上。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)采用x ±s表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，q檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

在體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞分別用20J/cm²，25J/cm²，30J/cm²IPL照射，24h及48h后上清液檢測(cè)MMP-1和TIMP-1表達(dá)。

2．1 IPL照射后體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞上清液檢測(cè)MMP-1：在培養(yǎng)24h后上清液檢測(cè)MMP-1，與對(duì)照相比檢測(cè)到的MMP-1在20J/cm²組沒(méi)有變化，25j/cm²，30j/cm²組MMP-1含量升高。方差分析顯示，F(xiàn)=5.812，P＜0.05，q檢驗(yàn)顯示，24h－MMP對(duì)照組1與2，2與3，3與4之間相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，余各組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。培養(yǎng)48h后上清液檢測(cè)MMP-1，與對(duì)照相比上清液中檢測(cè)到的各組MMP-1含量均增高，但MMP-1并不隨照射能量增加而升高。方差分析顯示，F(xiàn)＝10.614，P＜0.01，q檢驗(yàn)顯示，48h-MMP時(shí)2與3，2與4，3與4之間相比無(wú)顯著性差異(P＞0.01)，余各組相比均有顯著性差異(P＜O.01)。

2．2 IPL照射后體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞上清液檢測(cè)TIMP-1：培養(yǎng)24h后上清液檢測(cè)TIMP-1，與對(duì)照相比上清液中檢測(cè)到的TIMP-1在20J/cm²亦無(wú)變化，而25J/cm²，30J/cm²組TIMP-1含量升高。方差分析顯示，F(xiàn)＝8.074，P＜0.01；q檢驗(yàn)顯示，24h-TIMP時(shí)對(duì)照組1與2，2與3，3與4之間相比無(wú)顯著性差異(P＞0.01)，余各組相比均有顯著性差異(P＜0.01)。培養(yǎng)48h后上清液檢測(cè)TIMP-1，與對(duì)照組相比上清液中檢測(cè)到的TIMP-1隨能量增加，而TIMP-1含量升高。方差分析顯示，F(xiàn)＝259.464，P(0.01；q檢驗(yàn)顯示，48h－TIMP時(shí)各組相比均有顯著性差異(P＜0.01)。

2．3 各能量組不同時(shí)間之間MMP-1與TIMP-1含量的t檢驗(yàn)：各能量組之間MMP-1含量的變化并不隨時(shí)間推移而增加。各能量組之間TIMP-1含量的變化隨時(shí)間推移而明顯增加。

3 討論

強(qiáng)脈沖光(IPL)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的治療皮膚光老化的一種新方法，其波長(zhǎng)為＞500nm的非相干紅光和紅外光，因此可以透過(guò)表皮穿透到真皮和皮下組織。臨床實(shí)踐已證實(shí)能有效改善皮膚色素增加性病變和血管性增生性病變，同時(shí)能改善皮膚的質(zhì)地、細(xì)小皺紋。Negishi等對(duì)治療后患者皮膚行免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)脈沖光不僅增加Ⅰ型膠原合成，而且也增加Ⅲ型膠原合成。Raulin等認(rèn)為，IPL通過(guò)選擇性光熱解作用，導(dǎo)致膠原損傷，啟動(dòng)損傷修復(fù)過(guò)程使膠原含量增加。近年來(lái)在研究有關(guān)ECM合成和降解的代謝平衡調(diào)解中，MMP和TIMP兩個(gè)酶系統(tǒng)的作用引人注目。現(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)26種MMP，稱為MMP家族。MMP能通過(guò)破壞基質(zhì)的降解平衡而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞突破基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的組織屏障作用，從而侵襲周圍組織。MMP的表達(dá)在未受刺激的細(xì)胞中較低，但是部分在各種細(xì)胞外刺激因素誘導(dǎo)下(包括生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子腫瘤促進(jìn)劑，紫外線和紅外線輻射)，含量升高。組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metal-loproteinase，TIMP)是MMP的天然抑制物，是一組能抑制MMP活性的多功能因子。TIMP是阻斷ECM降解，抑制MMP活性的一組分泌糖蛋白，它參與組織結(jié)構(gòu)的建立與維持，可間接影響依賴ECM進(jìn)行的細(xì)胞信號(hào)傳遞，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)TIMP有4個(gè)家庭成員。TIMP-1可由多種細(xì)胞分泌，它可優(yōu)先抑制MMP-1。

目前有關(guān)IPL引起皮膚熱損傷修復(fù)機(jī)制的研究中，對(duì)MMP和TIMP的作用研究報(bào)道較少。王明利等曾觀察過(guò)強(qiáng)脈沖光(IPL)對(duì)大鼠皮膚MMP-1和TIMP-1表達(dá)的影響，結(jié)果在照射大鼠皮膚后，第1天MMP-1即見(jiàn)表達(dá)，第7天表達(dá)至高峰，第15天表達(dá)開(kāi)始減弱，而第1天TIMP-1無(wú)表達(dá)，第3天出現(xiàn)表達(dá)并逐漸增強(qiáng)，第15天時(shí)達(dá)到高峰。本實(shí)驗(yàn)顯示，亞融合狀態(tài)的成纖維細(xì)胞在分別接受20J/cm²、25J/cm²、30J/cm²強(qiáng)脈沖光照射后，在培養(yǎng)24h后20J/cm²組上清液未檢測(cè)MMP-1及TIMP-1變化，而25J/cm²、30J/cm²組MMP-1和TIMP-l含量輕度升高。在培養(yǎng)48h后則各能量組MMP-1均增高，但并不隨照射能量增加而升高。然而，在培養(yǎng)48h后發(fā)現(xiàn)TIMP-1隨IPL照射能量增加而含量升高，并且各組相比均有顯著性差異，表明在IPL照射后早期MMP-1和TIMP-1二者升高幅度無(wú)差別，而照射后48h則各能量組TIMP-1均明顯較MMP-l含量增高。這一結(jié)果與王明利等的研究結(jié)果有一定差異，可能是因?yàn)樽饔玫膶?duì)象以及檢測(cè)的方法和時(shí)間不同而有差異。

基于TIMP的功能，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IPL對(duì)組織熱損傷的修復(fù)和重塑作用在照射后48h開(kāi)始啟動(dòng)并與照射能量成正相關(guān)，提示IPL嫩膚作用的生物學(xué)機(jī)制可能與成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的TIMP-1增加有關(guān)。