聚丙烯酰胺水凝膠中丙烯酰胺單體提取及ＨＰＬＣ測定

[摘要]目的：建立聚丙烯酰胺水凝膠(PAMG)中丙烯酰胺(AM)單體提取及檢測的高效液相色譜(HPLC)分析方法。方法：用水做提取劑對PAMG中的AM進行提取，采用Oasis HLB 6cc和Varian Bond Elut－Accucat固相萃取柱對樣品進行純化，以HPLC測定其含量。結(jié)果：未植入人體PAMG中AM含量為0.2－0.8μg/ml，從人體中取出PAMG中AM含量均低于最小檢出限0.05μg/ml。結(jié)論：本方法適用于PAMG中AM單體含量的檢測，具有操作簡單、靈敏、準確等優(yōu)點。

[關(guān)鍵詞]聚丙烯酰胺水凝膠；丙烯酰胺；高效液相色譜

[中圖分類號]R92 7 [文獻標識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)07－0888－03

聚丙烯酰胺水凝膠(PAMG)于1997年由烏克蘭引入我國后，廣泛應用于注射隆乳。而后由于出現(xiàn)移位、硬結(jié)、疼痛、無菌性炎癥等多種術(shù)后并發(fā)癥，國家食品藥品監(jiān)督管理局于2006年4月全面禁止醫(yī)用PAMG在國內(nèi)的生產(chǎn)與銷售。有研究表明聚丙烯酰胺在多種條件下可以發(fā)生一定程度的降解，如光降解、熱降解、化學降解、生物降解等，而人體組織是一種復雜的生物有機環(huán)境，因此考慮PAMG在人體中可能發(fā)生降解。由于合成PAMG的丙烯酰胺(AM)單體已被證明對人體具有神經(jīng)毒性及可能的生殖毒性、致癌性，因此分析植入人體內(nèi)PAMG中AM的含量就變得至關(guān)重要。

1 材料和方法

1．1 樣品來源：從5位患者體內(nèi)抽出的醫(yī)用PAMG(奧美定，吉林富華醫(yī)用高分子材料有限公司)；患者均為女性，2006年就診于西京醫(yī)院整形外科，因注射隆乳術(shù)后發(fā)生術(shù)后并發(fā)癥要求手術(shù)取出植入物，年齡29－38歲，PAMG植入時間2－5年，并發(fā)癥有單側(cè)或雙側(cè)乳房的疼痛、硬結(jié)、移位等，抽出物均為淡黃色、半透明、凝膠狀顆粒。

1．2 儀器與試劑：HP1100型高效液相色譜儀(Agi－lent公司，美國)；AL204電子天平(上海梅特勒－托利多儀器有限公司)；BR4i高速臺式離心機(Thermo Electro公司，美國)；MTN－2800D氮吹濃縮儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；Oasis HLB6cc (200mg)固相萃取柱(Waters公司，美國)：Bond Elut－Accucat (mixed mode，C8，SAX andSCX)3ml固相萃取柱(Varian公司，美國)；大旋轉(zhuǎn)過濾管，0.45txmPVDF(Alltech公司，美國)；SKY－100B恒溫培養(yǎng)搖床(上海蘇坤實業(yè)有限公司)。丙烯酰胺(99.5％，優(yōu)級純，陜西中美生物科技有限公司)；甲醇(色譜級，F(xiàn)isher scientific公司，美國)。

1．3 提取及凈化方法：準確稱取0.1g醫(yī)用PAMG產(chǎn)品于15ml離心管中(從人體取出的PAMG需稱取1g，原因見結(jié)果與討論)，加入蒸餾水至10ml，置于37℃恒溫培養(yǎng)搖床中振蕩72h后，取出離心(9000r/min)30min，取上清液2ml，經(jīng)0.45μm濾膜(9000r/min)離心過濾5min，使液體完全通過濾膜；然后取1.5ml分別經(jīng)Oasis HLB 6cc和Varian Bond E－lut－Accucat同相萃取柱(使用前均需活化)萃取凈化，最終得到1ml洗脫液；經(jīng)氮吹儀吹干后加入50μl蒸餾水重新溶解，供液相色譜測定。

1．4 HPLC分析條件：色譜柱：Angilent TC－C18，4.6mm×150mm，粒度5μm；流動相：100％水；流速1ml/min；柱溫為室溫；檢測波長210nm；進樣量20μl。

2 結(jié)果與討論

2．1 檢測方法的選擇：近年來在食品行業(yè)中，由于食品中的AM含量受到全世界的廣泛關(guān)注，目前已經(jīng)建立了多種微量AM的提取及檢測方法，主要有GC－MS/MS，LC－MS/MS等，這些檢測方法的特點是成本高、操作復雜；另外，PAMG大分子的交聯(lián)結(jié)構(gòu)決定了它無法溶于水，從而導致對其分子結(jié)構(gòu)的分析方法有限，也使得提取PAMG中可能含有的AM單體比較困難。因此，本實驗采用高效液相色譜(HPLC)來檢測PAMG中的AM，HPLC是一種常規(guī)的化合物檢測方法，特點是操作簡便、參數(shù)易于調(diào)整、經(jīng)濟適用，有利于PAMG中AM提取條件的摸索。國內(nèi)已有部分學者用HPLC對PAMG中的AM進行了提取及檢測，但這些方法存在一些不足，如AM的提取過程復雜、HPLC圖雜質(zhì)峰較多等，且從人體中取出的PAMG由于與體液進行交換而含有多種復雜化學成分，影響AM的純化。本文借鑒食品中AM的提取方法，摸索適合于PAMG中AM的提取及檢測方法。

2．2 樣品稱取量的確定：由于醫(yī)用PAMG產(chǎn)品仍可吸收大量水而繼續(xù)溶脹，0.1g樣品在10ml水中可以溶脹飽和，形成凝膠、水混合體系；而從人體取出的PAMG吸水性已大大降低，為使其檢測濃度較高，稱取1g樣品即可與10ml水形成凝膠、水混合體系，因此二者稱取量有所區(qū)別。

2．3 提取方法的選擇：由于聚丙烯酰胺是一種三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體，醫(yī)用PAMG含水量超過95％，仍可吸收大量水溶脹成飽和的凝膠體，而AM極易溶于水，因此如何將AM從PAMG中完全提取出成為關(guān)鍵。過去曾采用水做提取劑，然而需通過大量水浸泡較長時間，使大多數(shù)AM分布到水相中，并多次進行此過程，收集每一步的水相并濃縮完成提取過程，這種方法耗時較長。也有用甲醇做提取劑，PAMG不溶于甲醇，AM可隨水從PAMG中提出溶于甲醇，然而加入甲醇后，PAMG立即固縮為白色固體，阻止了AM擴散到甲醇中，盡管在提取過程中不斷攪拌，以及經(jīng)超聲或振蕩，可以增加AM的提取量，但回收率仍不理想，且提取液需經(jīng)多次轉(zhuǎn)移，過程中AM損失較多。而本法經(jīng)過實驗驗證PAMG與水混合恒溫振蕩72h，可認為AM在水相和凝膠相中分布趨于均勻，然后取一定量的水相進行處理檢測，結(jié)果通過比例關(guān)系可推算出全部AM的量。本法處理步驟少、操作簡單、回收率高是其優(yōu)點。

2．3 凈化方法的選擇：在提取丙烯酰胺的過程中，特別是從人體取出的樣品，不可避免地會將人體體液內(nèi)的某些有機和無機成分一起提取出來。這些內(nèi)源性雜質(zhì)如果不經(jīng)過凈化處理，在進入HPLC檢測時，可能會堵塞色譜柱，影響其使用壽命，而且可導致色譜圖干擾峰較多，基線不穩(wěn)定，影響檢測結(jié)果，所以必須通過凈化處理來去除這些雜質(zhì)。本實驗所選用的Oasis HLB和Bond Elut－Accucat固相萃取柱，是美國FDA公布的食品中檢測丙烯酰胺標準方法中所采用的固相萃取柱。通過實驗證明聯(lián)合應用兩種固相萃取柱，可以快速、有效地去除提取液中的雜質(zhì)，色譜峰形好，基線平穩(wěn)，雜質(zhì)峰干擾少，定量準確。

2．4 方法確證

2．4．1 標準曲線的繪制：準確添加AM標準溶液至未植入人體的PAMG中，使其最終濃度分別為0.05、0.5、1.0、10、50、100μg/m1，按1.3節(jié)的方法進行樣品處理，在所選擇的色譜條件下進樣，結(jié)果表明，當AM含量為0.05μg/ml－100μg/ml時，AM峰面積(y)和AM含量(μg/ml)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為：y＝122.59x－18.398，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9997。

2．4．2 方法檢測限：取低濃度丙烯酰胺標準溶液，用水逐級稀釋并進樣測定，以信號噪聲比(S/N)等于3為基準，測得該條件下丙烯酰胺的最小檢測限為0.05μg/ml；以信號噪聲比等于10為基準，測得丙烯酰胺的最小定量限為0.15txg/ml。

2．4．3 精密度試驗：取0.2、1、5μg/ml的丙烯酰胺標準溶液分別代表低、中、高濃度，各濃度溶液分別連續(xù)進樣6次，計算得到三個濃度測定數(shù)值的相對標準偏差(RSD)分別為4.7％、3.3％和2.4％。取聚丙烯酰胺水凝膠樣品一份，按優(yōu)化后的方法進行樣品處理，于1天內(nèi)的6個不同時段進行HPLC分析；同時，分8天連續(xù)測定，取平均值并計算RSD值。其日內(nèi)和日間RSD值分別為5.6％和6.7％。

2．4．4 加樣回收率：對3瓶醫(yī)用PAMG產(chǎn)品，各取3份按1.3節(jié)的方法進行樣品處理并行HPLC檢測；再各取3份按上步檢測得到的濃度由低到高，分別添加AM標準溶液0.2、1.0、5.0μg/ml，用同樣方法進行處理、HPLC測定，得平均回收率＞87％。

2．5 樣品測定：對未植入人體的5份PAMG樣品進行檢測，結(jié)果為0.2－0.8μg/ml；對從人體中取出的5份PAMG樣品進行檢測，結(jié)果均低于最小檢出限。

2．6 結(jié)論：本研究建立的方法較其他方法步驟少、操作簡單、回收率高，適用于PAMG中AM單體含量的檢測。對植入與未植入人體PAMG的檢測結(jié)果提示，植入人體的PAMG在人體內(nèi)未大量降解及局部蓄積，且AM含量低于植入前水平，可能因為PAMG中的水分在人體組織復雜的生物環(huán)境中與體液進行交換，AM自由擴散，被組織吸收、代謝使之含量減少。對于臨床出現(xiàn)的多種并發(fā)癥，可能不是殘留單體單獨作用的原因，可能與其他因素有關(guān)。因此，對于其可能含有的其他化學成分，以及水凝膠大分子結(jié)構(gòu)的微觀變化及其長期的變化仍需進一步探討。由于對從人體中抽出PAMG中的AM檢測結(jié)果均低于最小檢出限，所以有待于對AM更低濃度的檢測方法的建立。