血管緊張素Ⅱ?qū)υ錾择：鄢衫w維細(xì)胞細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶活性的影響

[摘要]目的：本研究觀察血管緊張素Ⅱ(angiotens in Ⅱ，Ang Ⅱ)對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal－regulated kinase，ERK)活性的影響，旨在探討其影響增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的信號機(jī)制。方法：取自愿捐獻(xiàn)的增生性瘢痕組織標(biāo)本，采用膠原酶法行成纖維細(xì)胞培養(yǎng)。用免疫熒光組織化學(xué)法檢測細(xì)胞AT1和AT2受體的表達(dá)。取第3－4代細(xì)胞，并按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別加入10^-2Tmol/L Ang Ⅱ，10^-2mol/L Ang Ⅱ+10 μmol/L Valsartan，10^-2mol/L Ang Ⅱ+10μ ol/L PDl23319，10~mol/L Val sartan，10μmol/L PDl2 3319共5組；對照組僅加入等量DMEM。以Western Blot法檢測培養(yǎng)的細(xì)胞細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ext racellular signal－regulated kinases，ERK)活性變化，觀察在阻斷AT1或AT2受體情況下Ang Ⅱ?qū)ε囵B(yǎng)的瘢痕成纖維細(xì)胞ERK磷酸化的影響。結(jié)果：免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果顯示培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞同表達(dá)AT1和AT2受體。Ang Ⅱ可增加培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞ERK磷酸化。在一定劑量范圍內(nèi)，Ang Ⅱ濃度增加，細(xì)胞ERK磷酸化程度增加。與對照組比較10^-7mol/L Ang Ⅱ顯著增加瘢痕成纖維細(xì)胞ERK磷酸化，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。10μmol/L AT2受體拮抗劑PDl233191可顯著增強(qiáng)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞ERK磷酸化(P＜0.05)；10μmol/L的AT1受體拮抗劑Val sartan可顯著抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞ERK磷酸化；Valsartan或PD1233191單獨(dú)刺激細(xì)胞并未明顯影響ERK磷酸化(P＞0.05)。應(yīng)用抗ERK抗體顯示各組ERK含量一致。結(jié)論：Ang Ⅱ通過其受體AT1和AT2可調(diào)控增生性瘢痕成纖維細(xì)胞ERK磷酸化，Ang Ⅱ?qū)υ錾择：鄢衫w維細(xì)胞ERK活性的影響可能是Ang Ⅱ調(diào)控增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為可能的信號機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞]血管緊張素Ⅱ；增生性瘢痕；成纖維細(xì)胞；細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶；受體

[中圖分類號]R619.6 R364.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)07－0874－04

研究表明，許多細(xì)胞因子在瘢痕形成中可改變在創(chuàng)傷修復(fù)中起重要作用的成纖維細(xì)胞的增殖與遷移，引起組織細(xì)胞對損傷的過度反應(yīng)，導(dǎo)致瘢痕過度增生。因此研究細(xì)胞因子對成纖維細(xì)胞增殖、分化、演變及凋亡的調(diào)控，是目前研究增生性瘢痕形成機(jī)制的熱門課題。最新的研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)是一個(gè)重要的致纖維化因子，且與皮膚的纖維增殖性病變有密切關(guān)系。我們最近也報(bào)道了Ang Ⅱ可促進(jìn)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖和膠原的合成，然而其影響增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的信號機(jī)制尚未闡明。本研究我們采用體外培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，觀察Ang Ⅱ?qū)?xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)活性的影響，旨在探討其作用的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1．1 主要材料和試劑：實(shí)驗(yàn)所需增生性瘢痕組織標(biāo)本取自我科住院患者手術(shù)切除的增生性瘢痕組織。增生性瘢痕形成不超過一年，取材部位未經(jīng)任何治療，不伴有腫瘤或其他結(jié)締組織疾病。未曾服用抑制血管緊張素系統(tǒng)的藥物。

DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清(美國Gibco公司)，胰蛋白酶(日本W(wǎng)ako公司)，Dispase(日本Sanko公司)。AT1受體阻斷劑Valsartan，AT2受體拮抗劑PDl2339(日本三共公司)，抗細(xì)胞外信號激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)和pERK的抗體，兔抗人ATl受體多克隆抗體，羊抗人AT2受體多克隆抗體均購自Santa Cruz公司。德克薩斯紅(Dexas Red)標(biāo)記的鼠抗兔IgG，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗羊IgG均由第四軍醫(yī)大學(xué)全軍神經(jīng)科學(xué)研究所提供。

1．2 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)：應(yīng)用膠原酶法行成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，用0.125％的胰蛋白酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)所用成纖維細(xì)胞為第3－4代。

1．3 免疫熒光組織化學(xué)檢測AT1和AT2受體表達(dá)：利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞中AT1和AT2受體表達(dá)情況。操作按試劑盒說明進(jìn)行，將培養(yǎng)的細(xì)胞用40g/L多聚甲醛固定10min，PBS緩沖液洗滌，1％BSA封閉30min，分別加入工作濃度為1:50的相應(yīng)抗體，4 ℃下保持在濕盒中孵育36h。洗滌后，加入兩種熒光素混合液(工作濃度分別為FITC標(biāo)記1:30，得克薩斯紅標(biāo)記1:100)，室溫孵育3h。經(jīng)得克薩斯紅標(biāo)記后，AT1受體呈紅色熒光(激發(fā)波長514nm)，F(xiàn)ITC標(biāo)記后，AT2受體呈綠色熒光(激發(fā)波長488nm)當(dāng)細(xì)胞同時(shí)標(biāo)記到兩種熒光素時(shí)則表現(xiàn)為黃色熒光。通過計(jì)算機(jī)采集共聚焦顯微鏡所得圖像。

1．4 實(shí)驗(yàn)分組：選擇生長狀態(tài)良好3－4代的成纖維細(xì)胞，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，2％血清培養(yǎng)液培養(yǎng)48h，無血清培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組分為5組，并按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別加入10^-7mol/L Ang Ⅱ，10^-7mol/L Ang Ⅱ+10pμmol/L Valsartan，10^-7mol/L Ang Ⅱ+10μmol/L PDl23319，10μmol/L Valsartan，10μmol/L PD123319，對照組僅加入等量的DMEM。于相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

1．5 Western blot分析細(xì)胞外信號激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)活性：取各組細(xì)胞按試劑盒說明書操作。具體方法如下：實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)取細(xì)胞溶解物、離心、提取總蛋白。取25μg蛋白，變性后上樣于10％的聚丙烯酰胺凝膠，經(jīng)電泳分離后，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，加入一抗即：抗ERK或pERK的抗體(工作濃度1:1000)，加入辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗，ECL化學(xué)法光試劑盒檢測信號。通過美國NIH圖像分析系統(tǒng)(美國國家衛(wèi)生研究院研究服務(wù)中心)，對各條帶的灰度值進(jìn)行測定比較。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，統(tǒng)計(jì)處理應(yīng)用SPSS軟件，組間比較采用方差分析，兩兩比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞Ang Ⅱ受體AT1和AT2的表達(dá)：對培養(yǎng)的3－4代的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞免疫熒光組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，增生性瘢痕成纖維細(xì)胞同時(shí)表達(dá)AT1和AT2受體，陽性標(biāo)記主要位于細(xì)胞膜。AT1受體的陽性標(biāo)記似乎較AT2受體陽性標(biāo)記強(qiáng)。

2．2 Ang Ⅱ?qū)υ錾择：鄢衫w維細(xì)胞ERK磷酸化的影響：在無血清培養(yǎng)的條件下，AngⅡ(10^-6mol/L)的刺激引起培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞ERK磷酸化增加，在Ang Ⅱ刺激后5min，ERK磷酸化程度達(dá)到峰值。在一定劑量范圍內(nèi)，刺激物Ang Ⅱ濃度增加，細(xì)胞ERK磷酸化程度增加

2．3 AT1和AT2受體在Ang Ⅱ誘導(dǎo)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞ERK磷酸化中的作用：與對照組比較，1×10^-7mol/L Ang Ⅱ顯著增加成纖維細(xì)胞ERK磷酸化，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。10μmol/L AT2受體拮抗劑PD1233191與10^-7mol/L Ang Ⅱ同時(shí)刺激成纖維細(xì)胞，PD123319l可顯著增強(qiáng)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞ERK磷酸化，與單純Ang Ⅱ組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；10μmol/L的AT1受體拮抗劑Valsartan與10^-7mol/L Ang Ⅱ同時(shí)刺激細(xì)胞，Valsartan可顯著抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞ERK磷酸化，與單純Ang Ⅱ組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；Valsartan或PD1233191單獨(dú)刺激細(xì)胞并未明顯影響ERK磷酸化，應(yīng)用抗ERK抗體顯示各組ERK含量一致。

3 討論

增生性瘢痕主要病理表現(xiàn)是成纖維細(xì)胞異常過度增殖、細(xì)胞膠原代謝異常導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，其形成機(jī)制尚未完全闡明。目前研究已證明，細(xì)胞因子在瘢痕形成中起著重要作用。腎素一血管緊張素系統(tǒng)最重要的活性產(chǎn)物Ang Ⅱ作為一個(gè)重要的應(yīng)激激素和多效應(yīng)生長因子不僅在心血管和腎臟的纖維化病變中起重要作用，而且與皮膚的瘢痕形成和成熟關(guān)系密切。我們也曾報(bào)道了Ang Ⅱ通過其受體調(diào)節(jié)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為。然而其作用的細(xì)胞信號機(jī)制仍未闡明。ERK是哺乳類動(dòng)物和無脊柱動(dòng)物細(xì)胞中最早發(fā)現(xiàn)的絲裂素激活蛋白激酶家族的核心成員，是目前研究比較清楚的刺激轉(zhuǎn)錄增加的一條通路。該通路最主要的激活信號來自生長因子，通過改變靶蛋白的磷酸化在細(xì)胞生長、遷移及分化等信號傳遞中起重要作用。多種細(xì)胞因子包括Ang Ⅱ通過其受體可激活ERK，導(dǎo)致幾個(gè)早期即刻基因c－fos、c－jun、erl－1等表達(dá)增加。陳偉等報(bào)道在增生性瘢痕組織中磷酸化ERK表達(dá)增加。劉傳君等報(bào)道瘢痕疙瘩的成纖維細(xì)胞和正常皮膚的成纖維細(xì)胞ERK磷酸化程度明顯不同陽。上述發(fā)現(xiàn)提示ERK通路的改變可能與增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為改變有關(guān)。為進(jìn)一步探索Ang Ⅱ影響增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制，本研究以觀察Ang Ⅱ?qū)︸：鄢衫w維細(xì)胞ERK活性的影響為切入點(diǎn)，試圖初步闡明其作用可能的信號機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)首先觀察了Ang Ⅱ受體在培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。免疫熒光組織化學(xué)的檢測結(jié)果顯示增生性瘢痕的成纖維細(xì)胞同表達(dá)AT1和AT2受體蛋白，這個(gè)結(jié)果再次證實(shí)我們以前的發(fā)現(xiàn)。為弄清Ang Ⅱ如何調(diào)控增生性瘢痕成纖維細(xì)胞ERK的磷酸化，我們用藥理學(xué)受體阻斷的方法觀察了Ang Ⅱ受體AT1和AT2在成纖維細(xì)胞ERK磷酸化中的作用。本實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ刺激可增加人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞ERK磷酸化，用選擇性AT1受體阻斷劑Valsartan阻斷AT1受體可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞ERK磷酸化，用AT2受體拈抗劑PD123319阻斷AT2受體可促進(jìn)細(xì)胞ERK磷酸化，AT1受體介導(dǎo)的Ang Ⅱ的促牛長信號受到AT2受體否定的調(diào)控，這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：AngⅡ通過其受體AT1和AT2可調(diào)控增生性瘢痕成纖維細(xì)胞ERK磷酸化，Ang Ⅱ?qū)Τ衫w維細(xì)胞ERK活性的影響可能是Ang Ⅱ調(diào)控增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為町能的信號機(jī)制之一。

已證實(shí)正常皮膚成纖維細(xì)胞和增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為存在明顯差異，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)增生性瘢痕中Ang Ⅱ產(chǎn)生增加，AT1和AT2受體表達(dá)增加，而且Ang Ⅱ產(chǎn)生和受體表達(dá)的變化趨勢與瘢痕的成熟過程密切相關(guān)。我們現(xiàn)在的研究再次證實(shí)，Ang Ⅱ作為一個(gè)致纖維化因子不僅在心血管系統(tǒng)起作用，同時(shí)也在皮膚瘢痕形成中起作用，同時(shí)提示Ang Ⅱ?qū)?xì)胞內(nèi)的信號分子如ERK活性的調(diào)控可能是其影響增生性瘢痕形成可能的信號機(jī)制之一。這種調(diào)控作用可能是通過Ang Ⅱ產(chǎn)生量及其受體AT1和AT2表達(dá)量和表達(dá)比例的變化來實(shí)現(xiàn)的，通過抑制Ang Ⅱ產(chǎn)生、阻滯AT1受體或激活A(yù)T2受體，可導(dǎo)致下游信號通路，如ERK通路阻滯，可能對增生性瘢痕產(chǎn)生抑制作用，從而加快瘢痕的成熟。進(jìn)一步研究需要在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)條件下驗(yàn)證上述可能的推測。

另外，神經(jīng)、體液、內(nèi)分泌在組織修復(fù)中的作用已引起國內(nèi)外學(xué)者的重視。皮膚是一個(gè)激素敏感器官，義是Ang Ⅱ作用的靶器官之一。Ang Ⅱ作為細(xì)胞因了在局部組織起作用，同時(shí)也作為全身重要的幾個(gè)激素系統(tǒng)中的一個(gè)發(fā)揮生理作用，它在機(jī)體組織損傷后的重建過程中的作用及其作用的信號機(jī)制是非常復(fù)雜的，需要在今后的研究中進(jìn)一步深入探討并加以揭示。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞同表達(dá)Ang Ⅱ受體蛋白AT1和AT2，Ang Ⅱ通過激活A(yù)T1和AT2受體對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞ERK的磷酸化產(chǎn)生相反的調(diào)控作用，進(jìn)而可能影響成纖維細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。目前AT1受體阻斷劑已商品化，并廣泛用于心血管疾病的治療，供藥理學(xué)研究使用的AT2受體拮抗劑也已開發(fā)成功，現(xiàn)在的研究有可能為此類藥物用于瘢痕的治療或開發(fā)新的抗瘢痕藥物提供線索。