ＴＧＦ－β／Ｓｍａｄｓ通路與增生性瘢痕肌成纖維細(xì)胞分化

臨床上常見皮膚增生性瘢痕的攣縮影響皮膚的正常外觀和功能，是皮膚整形外科后期治療的一大難題。這種攣縮是由肌動(dòng)蛋白為主要成分的微絲和細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子等構(gòu)成的非肌性細(xì)胞收縮系統(tǒng)作用的結(jié)果。在攣縮過程中，瘢痕成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MFB)分化，進(jìn)而構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)收縮系統(tǒng)，帶動(dòng)胞外膠原纖維位移使瘢痕發(fā)生攣縮。肌成纖維細(xì)胞胞漿內(nèi)含有豐富的肌動(dòng)蛋白微絲，稱為平滑肌肌動(dòng)蛋白a(a－SmoothMuscle Actin，a－SMA)。后來的研究發(fā)現(xiàn)，肌成纖維細(xì)胞是成纖維細(xì)胞在創(chuàng)傷愈合或攣縮過程中的一種終極表型，轉(zhuǎn)型的過程中表達(dá)其特征性蛋白a－SMA。成纖維細(xì)胞的分化受到許多因素的影響，而其中TGF－β/smads通路對增生性瘢痕攣縮過程中肌成纖維細(xì)胞的分化起重要的作用。本文綜述如下。

1 TGF－β/Smads通路的組成

TGF－β/Smads通路的特點(diǎn)是其受體具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，因此又被稱為受體藕聯(lián)絲氨酸/蘇氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。轉(zhuǎn)導(dǎo)信號分子主要有TGF－β超家族、TGF－β受體家族及其受體底物Smad蛋白家族。TGF－β是一個(gè)分泌性的多肽信號分子，廣泛存在于從線蟲到哺乳動(dòng)物中。最早于1978年，Delarco等在小鼠肉瘤病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞條件培養(yǎng)基中鑒定出SGF(Sarcoma Growth Factor)，因其具有轉(zhuǎn)化細(xì)胞特性，又被稱為轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming Growth Factor，TGF)，包含兩個(gè)部分：α和β。二者在分子組成、受體結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性上有很大差異，分屬不同的蛋白家族。TGF－β超家族主要包括TGF－βs、激活素(Activins)、抑制素(Inhibins)、骨形態(tài)形成蛋白(BoneMorphogenetic Proteins，BMPs)、生長和分化因子(Growth and Differentiation Factor，GDFs)等幾大類40多個(gè)成員(見表1)，其中研究最多的TGF－βs有六種異構(gòu)形式，哺乳動(dòng)物體內(nèi)只有TGF－β₁－TG－β₃。

TGF－β受體家族包含五型，其中哺乳動(dòng)物含有7種Ⅰ型受體和5種Ⅱ型受體。TβRI、TβRII可通過其結(jié)構(gòu)區(qū)分，如TβRI有一個(gè)短的胞內(nèi)片段和一個(gè)與激酶區(qū)域緊緊相連的GS區(qū)域。在這段約30個(gè)氨基酸的區(qū)域中包含一個(gè)甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的序列TISGSGSG，Gs區(qū)域的磷酸化和TβRⅠ、TβRⅡ的激活在TGF－β信號中有非常重要的作用。除Ⅰ、Ⅱ型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能性受體外，Tβ RⅢ(也稱輔助受體，包括B－glycan和Endoglin)等不參與TGF－β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。TβRⅢ是由853個(gè)氨基酸組成的蛋白多糖，具有特征性的膜鑲嵌結(jié)構(gòu)，不含胞內(nèi)信號模體，可作為TGF－β的胞外儲(chǔ)存庫，增強(qiáng)TGF－β與信號受體的結(jié)合。

TβRⅠ的直接底物是Smad蛋白，是將配體與受體作用的信號由細(xì)胞漿轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的中介分子。1995年Sekelsky等在尋找果蠅(Drosophilamelanogaster)Dpp的下游轉(zhuǎn)導(dǎo)分子時(shí)，發(fā)現(xiàn)了Mad(Mother against dpp)及Medea基因，1996年Savage等研究尼采蠅(Caenorhabditis elegans)時(shí)發(fā)現(xiàn)了相同功能的Smad基因，兩者合稱為Smad(Sma and Mad Homologue)蛋白家族。迄今在人類已發(fā)現(xiàn)9個(gè)與Mad及Sma同源的基因(Smad1－Smad9)，分為三類：①受體調(diào)節(jié)型Smad(Receptor activated Smad，R－Smad)：包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8、Smad9；②共同介質(zhì)型Smad(Common Smad，Co－Smad)：哺乳動(dòng)物中僅有Smad4；③抑制型Smad(Inhibitory Smad，I－Smad)：包括Smad6、Smad7。

2 TGF－β/Smads通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(圖1)

TGF－β/Smads通路主要有三個(gè)步驟：①TGF－β超家族信號的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)；②TGF－β超家族的細(xì)胞漿內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；⑨TGF－β超家族的細(xì)胞核內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

首先，TGF－β超家族配體以無活性的方式分泌，經(jīng)TGF－ｖ激活激酶(TGF－β，ActivatedKinase)激活后與具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的受體TβRⅡ結(jié)合形成異二聚體。TβRⅡ自動(dòng)磷酸化后被TβRⅠ識別并形成TβRⅠ、TβRⅡ和TGF－β配體組成的受體異聚體復(fù)合物。TβRI的GS結(jié)構(gòu)域發(fā)生磷酸化后激活絲氨酸/蘇氨酸激酶，并使TβRⅠ空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。此過程中TβRⅢ(β－glycan)可參與發(fā)揮增強(qiáng)TGF－β同信號受體的結(jié)合。然后，活化的TβRⅠ依次磷酸化Smad2、Smad3羧基端的SSXS模體，從而激活Smad2、Smad3，TβRⅠ的L45環(huán)與Smad2、Smad3的MH2區(qū)， 1.3環(huán)決定了Smad2、Smad3是TβRⅠ的唯一底物?；罨腟mad2、Smad3與Smad4的MH1和MH2介導(dǎo)形成同源異型復(fù)合體(可能是三聚體形式)。 R－Smad(Smad2和Smad3均屬此類)可被一種膜藕聯(lián)相關(guān)蛋-白Smad受體激活相關(guān)蛋白(Smads Anchor forReceptor Activation，SARAs)與受體異聚體復(fù)合物結(jié)合。R－Smad為－含F(xiàn)YVE區(qū)的膜藕聯(lián)蛋白，F(xiàn)YVE區(qū)含兩個(gè)鋅指狀模體，與三磷酸肌醇結(jié)合而將SARAs錨向內(nèi)涵體膜上，SARA通過其Smad結(jié)合區(qū)和C端分別與R－Smad和TβRⅠ結(jié)合。隨后SARA與R－Smad和受體的結(jié)合力下降并解離，再與胞漿中別的R－Smad分子結(jié)合，起遞呈R－Smad的作用。激活后的R－Smad與Smad4形成R－Smad/Smad4復(fù)合物，可攜帶信號轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核。

R－Smad/Smad4復(fù)合物易位于細(xì)胞核后，通過Smad4、Smad3 MH1區(qū)的發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)，與DNA上的Smad蛋白結(jié)合元件(Smad Binding Element，SBE)5’－GTCTAGAC－3’直接結(jié)合。這種結(jié)合很松散，在局部一些轉(zhuǎn)錄共激活因子和/或共抑制因子的影響下，Smad可能通過NH2區(qū)的轉(zhuǎn)錄激活序列與靶基因上游的增強(qiáng)子、抑制子或啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)Smad與DNA的緊密結(jié)合并增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性。另外，Smad可通過與DNA結(jié)合蛋白相互作用來調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，如Smad2、Smad4參與激活素反應(yīng)因子(ARF)的形成，ARF與DNA結(jié)合元件FAST－1的羧基端部分結(jié)合，作用于Mix.2基因的啟動(dòng)子，調(diào)節(jié)Mix.2基因的轉(zhuǎn)錄。

在TGF－β/smads通路中Smad6、Smad7通過與Smad2、Smad3競爭性相結(jié)合TβRⅠ以及干擾Smad2、Smad3和Smad4的結(jié)合來抑制TGF－β信號的傳導(dǎo)。Smad4在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起瓶頸的作用。

3 TGF－β/Smads通路與增生性瘢痕肌成纖維細(xì)胞分化

TGF－β是非常保守的細(xì)胞因子，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、造血調(diào)控、免疫調(diào)節(jié)、創(chuàng)傷修復(fù)、炎癥反應(yīng)等諸多領(lǐng)域均有重要作用，尤其在組織修復(fù)和纖維變性中，TGF－β是關(guān)鍵的介質(zhì)。它廣泛存在于各種正常細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，對于成纖維細(xì)胞的主要作用是刺激細(xì)胞分裂與分化。

目前已有大量證據(jù)表明TGF－β/Smads誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的分化，表達(dá)a－SMA蛋白。成纖維細(xì)胞a－SMA基因啟動(dòng)子序列中存在兩個(gè)SBE區(qū)域，Smads蛋白與之結(jié)合后激活細(xì)胞，表達(dá)a－SMA，即完成成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)型分化。PAI－1、I型膠原和PDGF－B鏈等許多蛋白基因的啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)都含有SBE，在Smad7的啟動(dòng)子中也有SBE回文序列，表明Smad不僅被多種蛋白調(diào)節(jié)，同時(shí)Smad本身可形成反饋抑制環(huán)。

在TGF－β/Smads通路中影響成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞的最主要因子是TGF－β，及其下游Smad3分子。近來又發(fā)現(xiàn)了非Smad3依賴的TGF－β信號誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞的分化。Adam等在a－SMA基因肩動(dòng)子序列中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)TGF－β調(diào)控位點(diǎn)(TGF－β Control Element，TCE)，提出TGF－β本身可以直接參與到MFB的分化。Tomasek等研究認(rèn)為除了TCE外，TGF－β還作用于內(nèi)源性的CArG[cc(A/T)6GG]控制元件調(diào)控成纖維細(xì)胞的分化。

除了TGF－β外，TGF－β超家族中的其他成員也發(fā)揮誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化的作用，如BMP4通過Smad1和JNK通路誘導(dǎo)胎兒的成纖維細(xì)胞向MFB表型分化，BMP受體Ⅱ(BMPRII)的突變會(huì)引起Smad蛋白不能磷酸化，進(jìn)一步影響成纖維細(xì)胞的增殖與分化。

4 其他影響因子

有人研究認(rèn)為TGF－β₁誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)a－SMA必需在細(xì)胞外基質(zhì)(Extra CellularMatrix，ECM)中含有ED－A序列的纖維粘連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)，F(xiàn)N的沉積要先于a－SMA的表達(dá)，故含ED－A序列的FN和ECM是影響肌成纖維細(xì)胞分化的重要影響因子之一。成纖維細(xì)胞通過整合素與細(xì)胞外基質(zhì)相互傳遞信息，在細(xì)胞外基質(zhì)作用過程中，整合素可以通過粘著斑激酶(FocalAdhesion Kinase，F(xiàn)AK)的激活，將生物信號由胞膜傳向胞核，促進(jìn)a－SMA基岡的表達(dá)使成纖維細(xì)胞合成大量a SMA并向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，通過胞內(nèi)外收縮系統(tǒng)的形成和收縮引起瘢痕的攣縮。細(xì)胞內(nèi)收縮系統(tǒng)受到的機(jī)械張力對細(xì)胞增殖和基因表達(dá)的調(diào)節(jié)也是影響肌成纖維細(xì)胞分化的重要因素。

另外，有人觀察到到皮膚傷口愈合時(shí)，感覺神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)肽可通過激活肥大細(xì)胞脫顆粒上調(diào)a－SMA的表達(dá)，體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞PDGFmRNA的轉(zhuǎn)錄有傷后6小時(shí)和傷后六七天兩個(gè)高峰，正是成纖維細(xì)胞增殖期和肌成纖維細(xì)胞形成期?？梢娋奘杉?xì)胞對肌成纖維細(xì)胞表達(dá)的調(diào)控也有著重要的意義。Y－下擾素可減少成纖維細(xì)胞的a－SMA的表達(dá)，并且其呈劑量依賴性地抑制纖維連接蛋白ED－A在轉(zhuǎn)錄水平的合成。此外，有報(bào)道堿性成纖維細(xì)胞生長因子也可直接抑制TGF－β，誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞中a－SMA的合成。

5 展望

皮膚增生性瘢痕攣縮的組織中大量表達(dá)肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志性蛋白a－SMA，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為肌成纖維細(xì)胞是增生性瘢痕攣縮的源動(dòng)力。然而這種學(xué)說存在問題：不能解釋a－SMA表達(dá)的最高峰與攣縮時(shí)間上的不匹配。為了完善學(xué)說，合理闡述瘢痕攣縮的機(jī)制，從成纖維細(xì)胞到肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的調(diào)控和影響因素研究對于攣縮機(jī)制有十分重要的意義。相信隨著這方面基礎(chǔ)、臨床研究的深入，將來可以通過更多的藥物、基因、分子生物學(xué)方法來減少增生性瘢痕和皮片移植后的攣縮，減少手術(shù)后的功能障礙。