人肉芽組織內(nèi)周皮細(xì)胞ＣＤ１３和Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ⅰ的表達(dá)

[摘要]目的：觀察人肉芽組織內(nèi)周皮細(xì)胞CD13和Collagen Ⅰ的表達(dá)情況。方法：采用免疫組織化學(xué)雙染的方法觀察周皮細(xì)胞與新生血管的關(guān)系以及CD13和Collagen Ⅰ的表達(dá)，并用Image c圖像分析軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果：內(nèi)徑在14－19μm的新生血管周圍無周皮細(xì)胞的表達(dá)，而內(nèi)徑在22－65μm的新生血管存在周皮細(xì)胞。人肉芽組織新生血管周圍的周皮細(xì)胞表達(dá)CD13、Collagen Ⅰ和Desmin，肉芽組織內(nèi)的新生血管周圍不存在CD13-/Desmin⁺細(xì)胞，且CD13陽(yáng)性細(xì)胞僅存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍。結(jié)論：人肉芽組織內(nèi)的周皮細(xì)胞表達(dá)CD13和collagen Ⅰ；肉芽組織內(nèi)血管新生過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移先于周皮細(xì)胞的分化；周皮細(xì)胞的前體細(xì)胞自骨髓入血后與肉芽組織內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附并遷移到血管腔外，并緊鄰血管內(nèi)皮細(xì)胞分化為周皮細(xì)胞；周皮細(xì)胞參與了肉芽組織細(xì)胞外基質(zhì)的合成，且Collagen Ⅰ參與了新生血管的穩(wěn)定與改建。

[關(guān)鍵詞]周皮細(xì)胞；血管內(nèi)皮細(xì)胞；血管新生；細(xì)胞分化

[中圖分類號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008－6455(2007)07－0878－03

血管新生(angiogenesis)參與了機(jī)體眾多的病理及生理過程。存在血管新生的生理過程包括創(chuàng)面愈合、胎盤生長(zhǎng)等。存在血管新生的病理過程包括實(shí)質(zhì)性腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移、關(guān)節(jié)炎、麻風(fēng)病、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成等。在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成以及腫瘤的研究中，血管新生的研究受到了極大重視。

由于周皮細(xì)胞對(duì)血管腔的形成、新生血管的穩(wěn)定、血管的改建和血管功能方面均有重要作用，因而針對(duì)周皮細(xì)胞的基礎(chǔ)研究對(duì)于揭示血管新生相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床治療具有重要意義。目前已經(jīng)證明周皮細(xì)胞來源于骨髓，但其具體的前體細(xì)胞及其分化的機(jī)理仍不清楚。為進(jìn)一步揭示周皮細(xì)胞的分化機(jī)理，我們進(jìn)行了系列研究，本文僅涉及周皮細(xì)胞CD13和Collagen Ⅰ的表達(dá)。本文通過觀察CD13在肉芽組織內(nèi)的表達(dá)，研究周皮細(xì)胞的前體細(xì)胞在血管新生過程中的遷移過程；并通過觀察Collagen Ⅰ的表達(dá)，觀察血管新生過程中周皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)系。

1 材料和方法

1．1 人燒傷創(chuàng)面肉芽組織的取材：燒傷創(chuàng)面肉芽組織來源于6名燒傷患者，男性3名，女性3名。年齡22－35歲，平均(27.5+4.85)歲。燒傷深度均為深Ⅱ度，燒傷部位為手背燒傷3例，前臂燒傷2例，胸部燒傷1例。所有患者除存在深Ⅱ度燒傷外，無其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病。燒傷創(chuàng)面總面積為體表的8％－15％，半均(11.0+2.90)％。在傷后29－42天(平均36.2+4.79天)創(chuàng)面植皮時(shí)，收集2mm×2mm×1cm肉芽組織。標(biāo)本分為兩部分，一部分肉芽組織立即進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)(細(xì)菌數(shù)為3.2×10³－2.1×10⁴CFU/g組織，細(xì)菌數(shù)指數(shù)平均為3.91+0.292)，一部分肉芽組織用4％多聚甲醛固定，常規(guī)包臘塊。

1．2 人肉芽組織中周皮細(xì)胞內(nèi)Desmin的表達(dá)：標(biāo)本常規(guī)包臘塊，制成5μm切片。采用北京中山生物工程有限公司的HistostainTM－DS雙染試劑盒，按說明書對(duì)標(biāo)本內(nèi)的Desmin和yon willebrand因子(vWF)進(jìn)行染色。第一抗體為小鼠抗Desmin單克隆抗體(福建邁新生物科技公司)，第二抗體為兔抗vWF多克隆抗體(福建邁新生物科技公司)。染色后采用Nikon TE2000S顯微鏡(400×視野)、DS－SMC Camera Head、Nikon Digital Sight DS－U1和ACT-2U軟件對(duì)切片的8個(gè)400×視野進(jìn)行采圖，用Image C軟件對(duì)血管內(nèi)徑進(jìn)行測(cè)量，分別計(jì)算Desmin陰性血管內(nèi)徑平均值和有Desmin陽(yáng)性血管內(nèi)徑平均值。

1．3 人肉芽組織周皮細(xì)胞對(duì)CD13和Collagen Ⅰ的表達(dá)：將每個(gè)標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)5μm切片。每個(gè)標(biāo)本各選取3張連續(xù)切片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用北京中山生物工程有限公司的HistostainTM－Ds雙染試劑盒，按說明書對(duì)分別標(biāo)本內(nèi)的CD13和vWF、Desmin和vWF、collagen Ⅰ和vWF進(jìn)行染色。第一張切片的第一抗體為小鼠抗CD13單克隆抗體(福建邁新生物科技公司)，第二抗體為兔抗vWF多克隆抗體。第二張切片的第一抗體為小鼠抗desmin單克隆抗體，第二抗體為兔抗vWF多克隆抗體。第三張切片的第一抗體為兔抗Collagen Ⅰ多克隆抗體(武漢博士德生物科技有限公司)，第二抗體為兔抗vWF多克隆抗體。按說明書進(jìn)行染色，染色后對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。染色后采用Nikon TE2000S顯微鏡(400×)、DS－5MC Camera Head、Nikon Digital Sight DS－U1和ACT－2U軟件對(duì)切片進(jìn)行采圖。

2 結(jié)果

2．1 周皮細(xì)胞在肉芽組織內(nèi)的分布：肉芽組織淺層存在一些內(nèi)徑在14－19μm(平均為16.42+1.95μm)的新生血管，這些血管周圍無周皮細(xì)胞(Desmin陽(yáng)性細(xì)胞)包裹，且這些細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞(vWF陽(yáng)性)。這些血管周圍無與血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密接觸的Desmin陰性細(xì)胞。直徑為22－65μm(平均為42.82+19.31μm)的新生血管周圍存在周皮細(xì)胞包裹。

2．2 CD13和Collagen Ⅰ在新生血管內(nèi)的表達(dá)：內(nèi)徑在14－19μm的新生血管周圍無Desmin陽(yáng)性細(xì)胞，也無CD13和Collagen Ⅰ陽(yáng)性細(xì)胞。而內(nèi)徑在22－65μm的新生血管周圍存在周皮細(xì)胞，且表達(dá)CD13和Collagen Ⅰ。肉芽組織內(nèi)存在Desmin陰性而Collagen Ⅰ陽(yáng)性細(xì)胞，但不存在Desmin陰性CD13陽(yáng)性細(xì)胞。

3 討論

周皮細(xì)胞在血管新生的過程中及隨后血管的穩(wěn)定、改建和功能等方面均發(fā)揮重要作用，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：微血管水平的血流速度取決于周皮細(xì)胞的收縮與舒張；當(dāng)周皮細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞包裹受阻礙時(shí)，如Tie－2、angiopoietin－1或組織因子缺失的小鼠胚胎內(nèi)，血管新生和血管的改建均發(fā)生異常改變；周皮細(xì)胞能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，而當(dāng)周皮細(xì)胞缺失時(shí)則會(huì)出現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、微動(dòng)脈瘤形成、血管擴(kuò)張、血管改建異常和水腫。由于周皮細(xì)胞在血管新生過程中具有重要作用，因而針對(duì)周皮細(xì)胞的基礎(chǔ)研究對(duì)于揭示血管新生相關(guān)疾病(腫瘤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩等)的發(fā)病機(jī)理和臨床治療具有重要意義。

目前周皮細(xì)胞的研究還不多見，主要原因是體內(nèi)周皮細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞距離很近，兩者的生物學(xué)行為難以區(qū)分，另外周皮細(xì)胞在體外具有多樣性。當(dāng)前，大多周皮細(xì)胞的文獻(xiàn)均采用細(xì)胞標(biāo)記物來識(shí)別周皮細(xì)胞，比較常用的有Desmin、NG2、calponin等。本實(shí)驗(yàn)采用的是Desmin，它在成熟的周皮細(xì)胞已經(jīng)分化各個(gè)階段的周皮細(xì)胞均有表達(dá)，是研究周皮細(xì)胞分化的理想細(xì)胞標(biāo)記物。另外本實(shí)驗(yàn)中還采用von willebrand因子(vWF)標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，力圖通過周皮細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的位置關(guān)系，間接的標(biāo)記周皮細(xì)胞。

有研究發(fā)現(xiàn)周皮細(xì)胞來源于骨髓，但這些骨髓來源細(xì)胞在分化成周皮細(xì)胞之前是先遷移到創(chuàng)面內(nèi)還是直接遷移到血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍目前還不清楚。為研究這一問題，我們采用骨髓細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)記物CD13，對(duì)創(chuàng)面內(nèi)的骨髓來源細(xì)胞進(jìn)行示蹤。當(dāng)然，CD13/APN(氨基肽酶N)廣泛分布于多種體細(xì)胞表面，包括造血器官的基質(zhì)細(xì)胞、腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞、各種上皮細(xì)胞(腎近曲小管上皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、小腸刷狀緣上皮細(xì)胞等)、問葉細(xì)胞腫瘤細(xì)胞等的表面。但是肉芽組織內(nèi)不包含上述細(xì)胞。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CDl3陽(yáng)性細(xì)胞僅存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍，且表達(dá)Desmin。由于周皮細(xì)胞來源于骨髓，因而周皮細(xì)胞的前體細(xì)胞(CD13陽(yáng)性)的分化過程可能為：從骨髓釋放入血后，與創(chuàng)面肉芽組織內(nèi)的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附，遷移到血管腔之外，隨即在血管內(nèi)皮細(xì)胞外周分化成周皮細(xì)胞。但也有可能燒傷創(chuàng)面的肉芽組織不同于其他創(chuàng)面的肉芽組織。另外也有可能周皮細(xì)胞的前體細(xì)胞由骨髓釋放入血后CD13表達(dá)減弱(免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)不到)或不表達(dá)，進(jìn)入肉芽組織后又重新趨化到血管內(nèi)皮細(xì)胞表面并上調(diào)CD13的表達(dá)。但從進(jìn)化角度上來說，第一種假說更節(jié)省能量，更合理。

已經(jīng)證明血管新生的過程中，細(xì)胞外基質(zhì)的降解和合成具有重要作用。因?yàn)槿庋拷M織內(nèi)的新生血管必須附著在細(xì)胞外基質(zhì)上，作為處在新生血管外周的周皮細(xì)胞必定與細(xì)胞外基質(zhì)具有緊密聯(lián)系。Collegen Ⅰ是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。在肉芽組織內(nèi)，它主要由成纖維細(xì)胞合成。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)周皮細(xì)胞合成Collegen Ⅰ。這表明周皮細(xì)胞是肉芽組織細(xì)胞外基質(zhì)代謝的重要參與者。然而值得我們深思的問題是：血管的基底膜成分是Collegen Ⅳ(主要為周皮細(xì)胞合成)，作為血管主要組成部分的周皮細(xì)胞為什么要合成Collegen Ⅰ呢?我們認(rèn)為原因可能有三點(diǎn)：第一種可能為Collagen Ⅰ在生物體內(nèi)具有重要生物學(xué)功能，周皮細(xì)胞是成纖維細(xì)胞合成Collagen Ⅰ的儲(chǔ)備細(xì)胞；第二種可能為血管新生過程中需要Collagen Ⅰ的合成；第三種可能為肉芽組織需要周皮細(xì)胞合成Collagen Ⅰ。我們認(rèn)為Collagen Ⅰ可能參與了血管新生過程中的穩(wěn)定與改建，當(dāng)然這需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)：內(nèi)徑較小的新生血管不存在周皮細(xì)胞包裹，而深層內(nèi)徑較大的新生血管則存在周皮細(xì)胞包裹。這表明血管新生過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移早于周皮細(xì)胞的分化及包裹。

總之，人肉芽組織內(nèi)的周皮細(xì)胞表達(dá)CD13和Collagen Ⅰ；肉芽組織內(nèi)血管新生過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移先于周皮細(xì)胞的分化；周皮細(xì)胞的前體細(xì)胞自骨髓入血后與肉芽組織內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附并遷移到血管腔外，并緊鄰血管內(nèi)皮細(xì)胞分化為周皮細(xì)胞；周皮細(xì)胞參與了肉芽組織細(xì)胞外基質(zhì)的合成，且Collagen Ⅰ參與了新生血管的穩(wěn)定與改建。