黃芩苷和川芎對ＵＶＢ輻射皮膚成纖維細(xì)胞的影響

[摘要]目的：研究中藥活性成分黃芩苷，川芎對中波紫外線(UVB)輻射損傷成纖維細(xì)胞保護(hù)作用的影響及相關(guān)作用機(jī)制。方法：采用0mJ/cm²，30mJ/cm²，60mJ/cm²，90mJ/cm²劑量UVB照射培養(yǎng)的原代人皮膚成纖維細(xì)胞，同時加入黃芩苷和川芎干預(yù)處理，觀察細(xì)胞損傷的形態(tài)學(xué)變化，以MTT法檢測細(xì)胞活性，以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測IL－10，IL－12和TNF－a的分泌量。結(jié)果：UVB照射后，細(xì)胞損傷程度與照射劑量呈正相關(guān)，增殖活性下降；此外，UVB照射后IL－10等細(xì)胞因子分泌增加，而加入所試中藥干預(yù)可明顯抑制細(xì)胞損傷和相關(guān)細(xì)胞因子分泌。結(jié)論：黃芩苷、川芎有一定的光保護(hù)作用，抑制炎癥細(xì)胞因子IL－10，IL－12，TNF－a的分泌可能是其減輕UVB光損傷的機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞]紫外線；成纖維細(xì)胞；黃芩苷；川芎；IL－10；IL－12；TNF－a；光損傷；光保護(hù)

[中圖分類號]Q256 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號] 1008－6455(2007)07－0977－03

紫外線的輻射(包括UVA，UVB)是導(dǎo)致人體皮膚日曬傷、光老化及皮膚癌的主要因素。高紫外線暴露人群皮膚老化危險性比低暴露人群高一倍，老化發(fā)生提前10年。皮膚光老化不僅有損于人的美容，而且與皮膚病的發(fā)生有著病因?qū)W的聯(lián)系。中波紫外線(UVB)輻射可引起皮膚老化的發(fā)生，外觀出現(xiàn)干燥，粗糙，失去彈性，產(chǎn)生皺紋，皮膚的彈性蛋門和膠原蛋白的含量出現(xiàn)變化。成纖維細(xì)胞是UVB敏感的靶細(xì)胞，經(jīng)UVB輻射后，可以釋放一些具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，引發(fā)一系列的信號傳導(dǎo)，最終可以導(dǎo)致皮膚老化的發(fā)生。

IL－10，IL－12，TNF－a均是由皮膚成纖維細(xì)胞合成的土要細(xì)胞因子，參與紫外線引起的皮膚炎癥反應(yīng)過程及免疫調(diào)節(jié)，并在紫外線介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起著重要作用。傳統(tǒng)中藥黃芩中的活性成分黃芩苷，及川芎等可抑制紫外線照射所致的皮膚脂質(zhì)過氧化，防治皮膚的光損傷。本文通過體外培養(yǎng)人原代表皮成纖維細(xì)胞，用一定劑量的UVB照射，并分別以所選中藥處理，旨在證實(shí)所選藥物可緩解UVB照射的損傷作用。

1 材料和方法

1．1 材料：健康青少年男性包皮環(huán)切術(shù)切除的包皮，生理鹽水，0.5％的中性蛋白酶(sigma公司)，表皮消化液(0.25％的胰蛋白酶和0.1％的EDTA，Amresco公司)，DS培養(yǎng)基(DMEM加10％小牛血清，GIBCO公司)，四甲基偶氮唑(sigma公司)，黃芩苷(中國藥品檢驗(yàn)所)，川芎(中國藥品檢驗(yàn)所)，96孔培養(yǎng)板。

1．2 方法

1．2．1 原生代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)：將包皮剪成0.5cm×0.5cm的皮片，碘伏浸泡5min后用含青霉素(10萬u/L)和鏈霉素(100mg/L)的生理鹽水漂洗3次，加入0.5％中性蛋白酶，在4℃下消化18－20h，將皮片的真、表皮進(jìn)行分離，真皮部分以表皮消化液在37℃下消化5min后，加入DS培養(yǎng)基，輕輕吹打，200目尼龍網(wǎng)過慮，過濾后的細(xì)胞液1500r/min離心5min，棄去上清，加入DS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

以0.25％胰酶和0.02％EDTA消化上述細(xì)胞，調(diào)整其密度為1×10⁶/ml定量接種于96孔板，培養(yǎng)24h，待其貼壁后用于細(xì)胞活性檢測和細(xì)胞因子水平檢測。

1．2．2 實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為量效組和加藥組，每組均設(shè)OmJ/cm²為對照組，量效組接受30mJ/cm²，60mJ/cm²，90mJ/cm²UVB照射后孵育24h，加藥組加入黃芩苷、川芎預(yù)處理后，接受30mJ/cm²，60mJ/cm²及90mJ/cm² UVB輻射孵育24h，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果選用黃芩苷濃度為15μg/ml，川芎濃度為50μg/ml。

1．2．3 紫外線照射：接種于培養(yǎng)板中的細(xì)胞生長至70％融合時給予UVB照射，照射前先棄去各孔細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗二遍后加少量PBS覆蓋底面，置紫外線輻射儀(上海sigma技術(shù)有限公司生產(chǎn)，發(fā)射峰310nm)照射，細(xì)胞與燈管距離15cm，然后棄覆蓋液換回DMEM培養(yǎng)基。

1．2．4 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞增殖活性：照射細(xì)胞后24h向每100μl培養(yǎng)基中加入20μl濃度為5mg/ml的MTT，孵育4h后棄上清，加入120μl二甲基亞砜(DMSO)，室溫震蕩15min，用128c酶標(biāo)儀(奧地利CliniBio公司)在570nm波長處測吸光度OD值，空白試劑孔調(diào)零，讀取吸光度值。

1．2．5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測細(xì)胞因子分泌量：上述細(xì)胞照射后24h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，凍存于－70℃冰箱。使用ELISA試劑盒(BPBBiomedical，Inc)嚴(yán)格按說明書操作。簡要步驟：離心檢測標(biāo)本取上清和標(biāo)準(zhǔn)品一起加入相應(yīng)孔中，(每個標(biāo)本設(shè)3個復(fù)孔)，加入生物素化抗體工作液孵育45min，洗板后加入酶標(biāo)記液孵育45min，洗板后加入底物孵育15min，然后加入終止液，混勻即用酶標(biāo)儀測OD450值。

1．2．6 統(tǒng)計方法：以spss11.0統(tǒng)計軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)P＜0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 UVB對成纖維細(xì)胞光損傷的形態(tài)學(xué)影響：成纖維細(xì)胞在接受不同計量(3OmJ/cm²，60mJ/cm²，90mJ/cm²)UVB照射后24小時，細(xì)胞均受到不同程度的損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、細(xì)胞碎片增多且部分漂浮于培養(yǎng)液中。以90mJ/cm² UVB損傷作用最強(qiáng)，60mJ/cm²的損傷作用次之，30mJ/cm²則較弱。

2．2 UVB對細(xì)胞增殖活性的影響：量效組在接受照光后24小時檢測細(xì)胞活性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。加藥組中，OmJ/cm²組24h細(xì)胞活性檢測與對照組無明顯差異，表明所加藥物在該濃度對細(xì)胞活性無明顯影響。不同劑量UVB照射24h細(xì)胞活性下降，其下降幅度與UVB照射劑量相關(guān)，有顯著性差異。UVB加藥組處理的細(xì)胞活性均較UVB單純照射組有所恢復(fù)，其中在低劑量照射組恢復(fù)程度高于高劑量組照射組的恢復(fù)程度(表1)。

2．3 受試藥物及UVB對細(xì)胞因子分泌水平的影響：隨著UVB輻射劑量的增加(OJ/cm²、30J/cm²)、60J/cm²、90mJ/cm²)，成纖維細(xì)胞分泌IL－10，IL－12及TNF－a的量也逐漸增多。加入工具藥物干預(yù)后，黃芩苷和川芎在每個UVB劑量水甲均可抑制上述細(xì)胞因子的分泌(P＜0.05)(表2)：

3 討論

來自日光的紫外線對皮膚曬傷、皮膚炎癥、皮膚老化與皮膚癌的發(fā)生有重要影響。到達(dá)地球表面引起人皮膚損傷的紫外線包括UVB(280－315nm)和UVA(315－400nm)，而同等劑量下UVB對皮膚的損傷強(qiáng)度比UVA約大1000倍。成纖維細(xì)胞是真皮的主要功能細(xì)胞和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是紫外線輻射的重要靶位之一。本試驗(yàn)結(jié)果表叫UVB照射可損傷成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞成長受到抑制，且成纖維細(xì)胞的損傷程度與UVB照射的劑量呈正相關(guān)。

IL－10，IL－12，TNF-a是皮膚免疫系統(tǒng)的重要組成部分。IL－10來源于Th2細(xì)胞，可以抑制巨噬細(xì)胞和Th1細(xì)胞功能，下調(diào)細(xì)胞免疫應(yīng)答，但可刺激B細(xì)胞增殖和產(chǎn)生抗體，上調(diào)體液免疫應(yīng)答。IL－10是一個多效性細(xì)胞因子，具有免疫刺激和免疫抑制雙重作用，其免疫刺激作用主要是提高B細(xì)胞存活率，促進(jìn)B細(xì)胞增殖、促進(jìn)MHCⅡ類抗原表達(dá)以及抗體的分泌。IL－10的免疫抑制作用表現(xiàn)為能抑制Th1細(xì)胞的增殖和某些細(xì)胞因了的合成，其作用機(jī)制可能是IL－10作用于APC，誘導(dǎo)APC產(chǎn)生另一種細(xì)胞因子，改變細(xì)胞內(nèi)信號的傳遞途徑，從而選擇性抑制某些細(xì)胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄，破壞了Th1/rh2的免疫平衡，發(fā)生偏向Th2細(xì)胞的免疫偏離，促進(jìn)Th2細(xì)胞的體液免疫應(yīng)答，抑制Th1及其介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。IL－12米源于Th1細(xì)胞，是一個多功能的免疫調(diào)節(jié)因子，在調(diào)節(jié)T類細(xì)胞因子產(chǎn)生與維持Th1/Tc1應(yīng)答優(yōu)勢過程中具有重要作用。IL－12由單核細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，在免疫過程中介導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)，可以促進(jìn)Th1細(xì)胞的增埴分化，產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子，抑制Th2細(xì)胞的增殖分化。IL－12還具有調(diào)節(jié)Th1與Th2細(xì)胞之間的平衡，可促使ThO/TCO細(xì)胞分化為Th1/Tc1細(xì)胞，促進(jìn)Th1/Tc1細(xì)胞增殖和分化，誘導(dǎo)Th1/Tc1細(xì)胞產(chǎn)生大量的IFN－γ，而IFN－γ反過來又能促進(jìn)IL－12大量產(chǎn)生。TNF－a是調(diào)控機(jī)體免疫反應(yīng)的重要因子，可傳遞細(xì)胞間信息，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，具有抗腫瘤，引起炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)作用。它與UVB輻射引起的皮膚損傷、炎癥反應(yīng)、接觸超敏反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)。UVB照射后皮膚內(nèi)的TNF－a主要由真皮成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。我們研究了UVB對成纖維細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響，結(jié)果提示UVB促進(jìn)了IL－10，IL－12，TNF－a的分泌，分泌量與照射劑量相關(guān)，說明UVB導(dǎo)致的細(xì)胞損傷可能與三種細(xì)胞因子的分泌增加有著密切相關(guān)的聯(lián)系。

黃芩苷是中藥黃芩的活性成分，有吸收紫外線的作用。黃芩苷的主要藥用成分黃酮類具有抗炎，抗氧化等生物學(xué)效應(yīng)，對紫外線引起的紅細(xì)胞膜氧化損傷有保護(hù)作用。川芎中的阿魏酸能有效抑制氧自由基產(chǎn)生，保護(hù)膜脂質(zhì)小被氧化，防止DNA損傷發(fā)生，還可能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖生長。本文的研究顯示川芎和黃芩苷可減輕UVB對成纖維細(xì)胞的損傷，提高細(xì)胞增殖活性，但隨著照射劑量增加，其抵抗損傷作用的能力減弱，說明其光保護(hù)作用是有限的。此外，兩種單體成分均可抑制UVB輻射引起的炎性細(xì)胞因子IL－10，IL－12，TNF－a分泌，與單純照光組相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

綜上所述，UVB對體外培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞有損傷作用，表現(xiàn)為細(xì)胞受損、生長抑制，其損傷程度呈劑量依賴性。UVB可促進(jìn)受照射的細(xì)胞分泌IL－10，IL－12，TNF－a。川芎和黃芩苷可減輕細(xì)胞損傷，部分恢復(fù)細(xì)胞活性而具有光保護(hù)作用，抑制炎性細(xì)胞因子IL－10，IL－12及TNF－a的分泌可能是減輕紫外線輻射損傷的機(jī)制之一。這些結(jié)果為開發(fā)天然光保護(hù)劑提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)參考，也為今后紫外線輻射引起皮膚損傷，中藥防護(hù)及其機(jī)制的進(jìn)一步研究打下了基礎(chǔ)。