辣椒素脂質(zhì)體在兔耳增生性瘢痕組織中的透皮吸收研究

[摘要]目的：探討脂質(zhì)體包裹的辣椒素對(duì)兔耳增生性瘢痕組織的透皮吸收能力。方法：在兔耳增生性瘢痕模型上進(jìn)行透皮擴(kuò)散，比較辣椒素脂質(zhì)體及其普通商用軟膏劑對(duì)瘢痕皮膚的滲透能力。結(jié)果：在體瘢痕透皮試驗(yàn)12h后，脂質(zhì)體組瘢痕組織中的辣椒素單位面積透皮藥量顯著高于軟膏組(40.03±3.2 vs 9.01±2.02μg/cm²，p＜0.01)。結(jié)論：在體瘢痕組織透皮試驗(yàn)中，脂質(zhì)體劑型均表現(xiàn)出優(yōu)于軟膏劑型的促進(jìn)辣椒素透皮的能力。

[關(guān)鍵詞]脂質(zhì)體；辣椒素；增生性瘢痕模型；透皮擴(kuò)散；

[中圖分類號(hào)]R94 R622 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008－6455(2007)07－0881－04

目前在瘢痕的藥物治療研究中發(fā)現(xiàn)，多種藥物在體外對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞均有顯著抑制作用，但臨床上此類藥物的常用外用劑型如軟膏、霜?jiǎng)┑?，局部?yīng)用卻不能達(dá)到較好效果，這與皮膚的特殊結(jié)構(gòu)一角質(zhì)層以及瘢痕缺乏皮膚附件而阻礙了藥物進(jìn)入皮膚有關(guān)。因此找到一種療效好、全身毒副反應(yīng)小、又能導(dǎo)入瘢痕皮內(nèi)并保持較長作用時(shí)間的藥物和方法是瘢痕防治的關(guān)鍵。

辣椒素(capsaicin，CAP)是一種天然的植物堿，是辣椒中的主要生物活性成分。作為神經(jīng)肽P物質(zhì)(substance P，SP)的耗竭劑，新近的研究報(bào)道辣椒素具有顯著的抗纖維化作用，可用于瘢痕的防治。

脂質(zhì)體(liposome，Lip)作為一種透皮給藥新劑型，具有皮膚組織靶向性、緩釋性和無毒性的特點(diǎn)。已有的關(guān)于辣椒素脂質(zhì)體制劑在瘢痕組織離體透皮實(shí)驗(yàn)中，已顯示了其優(yōu)于常規(guī)局部軟膏制劑的促滲透能力的特點(diǎn)。因此，Lip非常有望成為增生性瘢痕局部治療藥物的良好載體。本實(shí)驗(yàn)以兔耳增生性瘢痕模型為對(duì)象，對(duì)辣椒素的普通軟膏制劑和脂質(zhì)體制劑的透皮能力進(jìn)行比較，為尋找一種安全、有效、方便的外用抗瘢痕藥物提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

1．1 材料：新西蘭大白兔；辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品(美國SIGMA公司)；辣椒素原料藥(廈門大學(xué))；0.075％(質(zhì)量比)辣椒素脂質(zhì)體(自制)；0.075％(質(zhì)量比)辣椒素軟膏(貴州康運(yùn)藥業(yè))；甲醇、乙氰(均為色譜純)；其他試劑為分析純。

1．2 儀器：Waters高效液相色譜儀(美國Water公司)，包括Waters 515型泵，Rheonyde7725i進(jìn)樣器，2487雙波長紫外檢測(cè)器，ChromStationTM色譜數(shù)據(jù)處理工作站；T18勻漿機(jī)(德國IKA公司)；DL－360超聲儀(浙江象山縣石浦海天電子儀器廠)；TGL－16G臺(tái)式高速離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)。

2 方法

2．1 檢測(cè)方法

2．1．1 色譜條件以及標(biāo)準(zhǔn)曲線：色譜柱：C18柱；流動(dòng)相：乙氰：水=60:40，(V:V)；流速：1.2ml/min；檢測(cè)波長：280nm：進(jìn)樣量：20μl；室溫操作。精取辣椒素5mg，置于5ml容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻得1×10³ mg/L辣椒素儲(chǔ)備液。精密量取該液25、50、100、200、400μl分別置于10ml容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，得到2.5、5、10、20、40 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液。進(jìn)樣20μl，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線形回歸。

2．1．2 回收率與精密度：精密量取線性試驗(yàn)下的中間三個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，依法各自進(jìn)樣3次測(cè)定并計(jì)算回收率和精密度。

2．2 制作瘢痕模型

2．2．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用健康成年新西蘭大白兔12只，兔耳健全，雌雄不拘，體重3.0－3.5kg，分籠飼養(yǎng)。

2．2．2 參照Morris氏方法并加以改良建立兔耳增生性瘢痕模型：①用速眠新0.1ml/kg肌注全身麻醉；②嚴(yán)格無菌操作技術(shù)下，在兔耳腹側(cè)面做1cm×1cm大小創(chuàng)面，去掉兔耳全層皮膚及軟骨膜，創(chuàng)緣用烙鐵適當(dāng)燒灼處理，每只兔耳做4個(gè)創(chuàng)面，共96個(gè)創(chuàng)面；③術(shù)后創(chuàng)面暴露，保持干燥待創(chuàng)面自行愈合，一般需要18－21天。

2．3 在體瘢痕透皮實(shí)驗(yàn)及其檢測(cè)

2．3．1 手術(shù)后約19天創(chuàng)面完成上皮化時(shí)，伴有瘢痕增生，才達(dá)到在體透皮擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)的要求。用游標(biāo)卡尺對(duì)創(chuàng)面瘢痕進(jìn)行測(cè)量，以標(biāo)化用藥面積。

2．3．2 隨機(jī)將12只兔的一側(cè)耳設(shè)定為辣椒素脂質(zhì)體用藥組，另一側(cè)用辣椒素軟膏作對(duì)照組。每一側(cè)的四個(gè)標(biāo)本中隨機(jī)選取三個(gè)用藥，余下一個(gè)作陰性對(duì)照。在每個(gè)用藥的瘢痕上分別均勻地涂抹等量兩種制劑，并確保最終辣椒素的用量為100μg，于首次用藥后間隔6h復(fù)用等量的藥物一次，共用2次。涂藥范圍嚴(yán)格掌握在瘢痕邊緣內(nèi)1mm處。

2．3．3 末次給藥6h后處死動(dòng)物，取軟骨以上瘢痕皮膚和鮮血為待檢測(cè)標(biāo)本。

2．3．4 瘢痕標(biāo)本后處理：①透皮擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，瘢痕皮膚先用沾有甲醇的試紙搽拭2次后，再用純水沖洗數(shù)次，盡量去除皮膚表面殘留的藥物；修剪瘢痕組織，確保最后送檢組織為瘢痕標(biāo)本表面預(yù)標(biāo)記所對(duì)應(yīng)的實(shí)際用藥的瘢痕組織；②然后用相同長度的3M膠帶粘拉表皮面9次，使角質(zhì)層與活性表皮層和真皮層分離，分別將3M膠帶連同上面粘附的角質(zhì)層記作標(biāo)本1(即：角質(zhì)層部分皮膚)和余下皮膚作為標(biāo)本2(即：非角質(zhì)層部分皮膚，簡稱非角質(zhì)層)；③分別將標(biāo)本1和標(biāo)本2剪碎后置于不同的玻璃器皿中，然后加入蒸餾水2ml用高速勻漿機(jī)勻漿處理，至皮膚被研磨成漿，再轉(zhuǎn)移至10ml離心管中，加入甲醇8ml超聲萃取5min，離心(10000r/min，10min)取上清液，用0.5μm孔徑的濾膜過濾后備測(cè)；④角質(zhì)層和其余皮膚中辣椒素含量的測(cè)定：將標(biāo)本1、2和血清液各20μl用HPLC法按“2．1．1”項(xiàng)下條件檢測(cè)CAP的含量。

3 結(jié)果

3．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率和精密度：標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=1496.5X+2922.1，r=0.998。CAP濃度在2.5－40.0 mg/L內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。；CAP的平均峰面積為：3523.1，RSD為：0.89％，表明本方法具有良好的精密度。

3．2 在體瘢痕透皮實(shí)驗(yàn)：CAP－LIP組和CAP－CRE組瘢痕組織，各自的角質(zhì)層和非角質(zhì)層皮膚中，藥物滯留量之間的差異經(jīng)過SAS8.0軟件作t檢驗(yàn)分析，P＜0.01，提示兩種制劑的CAP單位面積滯留量的差異有顯著性意義。所有同時(shí)抽取之血清和各陰性對(duì)照的瘢痕組織各層中均未見有CAP檢出。

4 討論

許多研究證明神經(jīng)肽對(duì)傷口愈合發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。SP就是其中重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一。作為神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)質(zhì)、神經(jīng)源性炎癥介質(zhì)，免疫調(diào)節(jié)肽可能參與了傷口愈合的全部生理修復(fù)過程，同時(shí)在瘢痕不斷增生的病理過程中也起著重要作用。作為神經(jīng)肽SP的拮抗藥物，CAP在創(chuàng)傷愈合中，可耗竭部分神經(jīng)肽類物質(zhì)，減少其局部濃度，瘢痕的另一典型臨床癥狀是瘙癢，在增生的早期癥狀尤為明顯，可能與肥大細(xì)胞的脫顆粒釋放組織胺等有明顯的關(guān)系。因此，通過運(yùn)用辣椒素來抑制SP的增加，達(dá)到控制瘢痕的發(fā)生和瘙癢癥狀，能從多途徑控制傷口愈合過程和瘢痕的發(fā)生和發(fā)展，從而達(dá)到防治瘢痕形成的目的。

關(guān)于增生性瘢痕的防治，目前乃整形外科的一大難題。臨床上雖有多種防治方法，如手術(shù)切除、壓迫療法、放射治療等，但這些方法不僅時(shí)間長、治療需醫(yī)生實(shí)施、應(yīng)用不方便，而且效果也不甚理想、瘢痕易復(fù)發(fā)。目前在藥物治療研究中發(fā)現(xiàn)，多種藥物如秋水仙堿、青霉胺、β-丙晴酰胺、γ-干擾素等，在體外對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞均有抑制作用，但在口服或靜脈應(yīng)用時(shí)對(duì)瘢痕的作用較小、全身毒副反應(yīng)也較大。臨床上激素類藥物有明顯抑制瘢痕的作用，但需注射于瘢痕內(nèi)效果才明顯，而其常用外用劑型如軟膏、霜?jiǎng)┑?，局部?yīng)用卻不能達(dá)到較好效果，這與皮膚的特殊結(jié)構(gòu)一角質(zhì)層以及瘢痕真皮增厚、缺乏正常皮膚的附屬結(jié)構(gòu)(毛囊、汗腺、皮脂腺)阻礙了藥物進(jìn)入，影響了藥效有關(guān)。因此找到一種療效好、全身毒副反應(yīng)小、又能導(dǎo)入瘢痕皮內(nèi)并保持較長作用時(shí)間的藥物和方法是防治作用的關(guān)鍵，同時(shí)也能方便患者直接用藥。

在藥物透皮新劑型中，Lip的出現(xiàn)是透皮給藥領(lǐng)域的重大進(jìn)展。Lip系將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層形成的微型泡囊中，作為藥物載體Lip在應(yīng)用中具有皮膚組織靶向性、緩釋性、兼溶性、無毒性的特點(diǎn)。因此，Lip與一般促滲劑相比較的一大優(yōu)勢(shì)，就在于Lip促進(jìn)藥物透過角質(zhì)層屏障并在局部富積，而不增加藥物的全身吸收，減少了藥物的毒副作用，為透皮給藥系統(tǒng)提供了一個(gè)安全、高效、局部無刺激的用藥途徑，解決了如何將藥物導(dǎo)入皮內(nèi)并局部蓄積而充分發(fā)揮其作用的關(guān)鍵問題。

體外促滲透實(shí)驗(yàn)研究中，我們已經(jīng)證實(shí)Lip能夠協(xié)助包被的CAP透過皮膚表面角質(zhì)層進(jìn)入瘢痕組織，并且，獲得局部高濃度；而使用上市的普通軟膏劑型，藥物難以有效地進(jìn)入瘢痕組織內(nèi)，說明辣椒素脂質(zhì)體對(duì)人的離體瘢痕組織具有良好的滲透能力并能在瘢痕組織內(nèi)蓄積。由于體外實(shí)驗(yàn)與在體實(shí)驗(yàn)的差異，體外透皮實(shí)驗(yàn)只能提示藥物所具有的透皮能力，所以不能作為活體實(shí)驗(yàn)的定量指標(biāo)。因此，本實(shí)驗(yàn)中我們采用兔耳瘢痕模型，對(duì)辣椒素脂質(zhì)體的體內(nèi)透皮情況作進(jìn)一步地研究。

創(chuàng)傷后瘢痕愈合是人類特有的一種病理現(xiàn)象，由于在動(dòng)物身上難以再現(xiàn)這種疾病，使得對(duì)其研究受到極大的制約。1997年Morris等以及國內(nèi)學(xué)者李薈元利用兔耳建立了增生性瘢痕模型，并證實(shí)兔耳增生性瘢痕與人類增生性瘢痕的發(fā)生過程及其結(jié)構(gòu)有著較為相似的病理組織學(xué)特征。

在兔耳的瘢痕模型在體透皮實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示：辣椒素脂質(zhì)體在真皮中的透皮量極顯著地高于辣椒素軟膏(近4.5倍)，而且在表皮中的貯存量顯著高于辣椒素軟膏組(近1.5倍)。由此說明，與體外的透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，在體情況下辣椒素的脂質(zhì)體劑型同樣具有優(yōu)于普通軟膏劑的促滲透效果，在瘢痕的活性表皮和真皮組織中，有較高濃度的藥物。對(duì)比人的離體瘢痕的體外透皮實(shí)驗(yàn)和兔耳瘢痕模型的在體透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，同一劑型的藥物在體的透皮藥量均多于離體實(shí)驗(yàn)的透皮藥量。這種差異可能源于人和兔不同種屬動(dòng)物之間本質(zhì)的皮膚滲透性差異、離體和在體的不同環(huán)境和理化條件之間造成藥物動(dòng)力學(xué)的差異，對(duì)它們的理解將有助于我們?cè)诮窈蟮膶?shí)驗(yàn)中，選取更為恰當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型完成透皮觀察和藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。

在瘢痕性疾病的防治上，強(qiáng)調(diào)局部藥物靶向給藥和局部持續(xù)的高藥物濃度，那么本實(shí)驗(yàn)辣椒素的脂質(zhì)體制劑所表現(xiàn)出的良好的促滲透能力，無疑從藥劑學(xué)方向上為經(jīng)皮給藥防治瘢痕性疾病帶來了新的希望。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)僅僅是對(duì)將脂質(zhì)體應(yīng)用到瘢痕透皮給藥的一次初探，不論是在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀盟幍脑O(shè)計(jì)和有關(guān)檢測(cè)方法上有待進(jìn)一步完善，還是從配方組成和工藝流程，達(dá)到改善辣椒素脂質(zhì)體的包封率、穩(wěn)定性優(yōu)化劑型等制劑水平方面入手，都可能會(huì)為提高辣椒素脂質(zhì)體的透皮擴(kuò)散能力和瘢痕局部用藥模型的建立提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。