• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    硼替佐米對(duì)多發(fā)性骨髓瘤患者Treg細(xì)胞的影響及與腫瘤負(fù)荷、化療療效的關(guān)系*

    2012-01-30 03:58:42黃蓓暉劉俊茹
    中國(guó)病理生理雜志 2012年6期
    關(guān)鍵詞:佐米外周血計(jì)數(shù)

    李 瀅, 李 娟, 黃蓓暉, 劉俊茹, 鄭 冬

    (中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科,廣東廣州510080)

    多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一種惡性克隆性漿細(xì)胞過度增殖的血液系統(tǒng)腫瘤,至今尚不能被治愈[1]。目前MM治療的一線方案包括含新藥(如硼替佐米、沙利度胺)的聯(lián)合方案及傳統(tǒng)方案(長(zhǎng)春新堿、吡柔比星、地塞米松聯(lián)合或不聯(lián)合地塞米松方案,即VADM或DVD方案)。含硼替佐米為主的聯(lián)合方案(硼替佐米、地塞米松聯(lián)合或不聯(lián)合脂質(zhì)體阿霉素,即PAD或VD方案,簡(jiǎn)稱硼替佐米聯(lián)合方案)化療起效快、療效確切、骨髓毒副作用少,是現(xiàn)今MM較為理想的治療方案[2]。研究表明,硼替佐米通過抑制細(xì)胞內(nèi) IκB因子降解,阻斷NF-κB活化,從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖[2-3]。但機(jī)體正常免疫細(xì)胞如T細(xì)胞也需經(jīng)NF-κB通路進(jìn)行活化增殖[4],因此,硼替佐米在抗腫瘤同時(shí)可能影響機(jī)體免疫功能。

    調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T regulatory cells,Treg細(xì)胞)是T細(xì)胞的一個(gè)特殊亞群,具有負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用,在腫瘤免疫逃逸、自身免疫性疾病中起重要作用[4]。目前認(rèn)為Treg細(xì)胞與MM的腫瘤負(fù)荷、疾病生存期有密切關(guān)系[5-7],而具有抗 MM 增殖作用的多種藥物如沙利度胺、環(huán)磷酰胺等對(duì)患者Treg細(xì)胞有抑制作用[7-8]。但新藥硼替佐米對(duì)MM患者Treg細(xì)胞的影響目前國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)化療前后初治MM患者外周血Treg細(xì)胞水平,并對(duì)比接受硼替佐米聯(lián)合方案及傳統(tǒng)方案化療的初治MM患者化療后Treg細(xì)胞變化及與腫瘤負(fù)荷、療效的關(guān)系,以了解MM腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制及硼替佐米對(duì)Treg細(xì)胞的影響,為MM的腫瘤免疫治療提供理論依據(jù)。

    材料和方法

    1 研究對(duì)象

    選取2010年7月~2011年8月中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科收治的42例初治MM患者。MM診斷標(biāo)準(zhǔn)及療效評(píng)價(jià)依據(jù)國(guó)外MM診斷及療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[9]。42例中男25例,女17例,中位年齡56歲(33~75歲)。根據(jù)Durie-Salmon分期(D-S分期):II期7例,III期35例;國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)分期(International Standard Staging,ISS分期):1期21例,2期6例,3期15例;根據(jù)疾病免疫學(xué)分型:IgG型19例,IgA型9例,輕鏈型10例,IgD型4例。其中30例接受硼替佐米聯(lián)合方案化療,12例接受傳統(tǒng)方案化療,見表1。

    2 主要試劑及儀器

    患者外周血單個(gè)核細(xì)胞使用人淋巴細(xì)胞分離液(TBD)及PBS(HyClone)分離洗滌。流式單抗(CD4-FITC、CD25-APC、FOXP3-PE)、APC、PE 同型對(duì)照、破膜劑、洗滌液均購(gòu)自Ebioscience。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)采用BD FASCanto流式細(xì)胞儀。

    表1 42例初治MM患者臨床資料Table 1.Clinical characteristics in 42 cases of the newly-diagnosed MM patients

    3 方法

    3.1 標(biāo)本采集及細(xì)胞分離 所有觀察對(duì)象均于化療前1 d及第2療程化療前1 d的清晨空腹時(shí)抽取肘靜脈血,分別用肝素和EDTA抗凝后,用于進(jìn)行血清免疫球蛋白分析、血清β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)檢測(cè)及全血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。使用人淋巴細(xì)胞分離液分離肝素抗凝外周血單個(gè)核細(xì)胞,使用PBS重懸至2×109/L。

    3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Treg細(xì)胞 取2支試管各加入100 μL上述細(xì)胞懸液,分別加入20 μL CD4-FITC、CD25-APC及CD4-FITC、APC同型對(duì)照單克隆流式抗體,充分混勻后4℃避光孵育30 min。每管加入2 mL洗滌劑混勻,300×g離心5 min,棄上清后重懸細(xì)胞。加入1 mL破膜劑混勻后4℃避光孵育45 min。加入2 mL洗滌劑再次洗滌后重懸細(xì)胞于100 μL PBS中,分別加入20 μL FOXP3-PE單抗及PE同型對(duì)照,混勻后4℃避光孵育30 min,洗滌后重懸細(xì)胞于500 μL洗滌劑中,上機(jī)檢測(cè)外周血Treg細(xì)胞比例。

    3.3 數(shù)據(jù)分析 使用FCS Express V3軟件分析數(shù)據(jù)。使用SSC-FITC設(shè)門選出CD4+T淋巴細(xì)胞,參照APC同型對(duì)照在CD4+T細(xì)胞中圈出CD4+CD25+T細(xì)胞,再參照 PE同型對(duì)照設(shè)門 CD4+CD25+FOXP3+的Treg細(xì)胞,見圖1,結(jié)合同步淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)得出Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)。

    Figure 1.Gating process of Treg cells.A:selecting CD4+T cells in FITC and SSC channels;B:gating CD25+cells in CD4+T cells on the basis of APC isotype.C:gating FOXP3+Treg cells in CD4+CD25+cells on the basis of PE isotype.圖1 Treg細(xì)胞設(shè)門過程

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)以中位數(shù)(范圍)表示,采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析不同分組間Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)差異。對(duì)于非正態(tài)分布變量的相關(guān)性進(jìn)行Spearman相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 臨床指標(biāo)與Treg細(xì)胞

    根據(jù)MM患者D-S分期、ISS分期、是否合并貧血、高鈣血癥、低白蛋白血癥、腎功能損害及血清β2-MG>5 500 μg/L對(duì)42例MM患者進(jìn)行分組分析,發(fā)現(xiàn)ISS 1期患者外周血Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)為0.09×109/L,低于ISS 2、3期患者的外周血Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)0.18×109/L(P <0.05),見圖 2;血清 β2- MG >5 500 μg/L患者 Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)為 0.18 ×109/L,高于血清β2-MG≤5 500 μg/L患者的 Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)0.10×109/L(P<0.05)。而不同D-S分期、是否合并貧血、高鈣血癥、低白蛋白血癥及腎功能損害分組的MM患者Treg細(xì)胞對(duì)比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表2。

    Figure 2.Treg cells of different ISS stages in MM patients detected by FCM.A:Treg cells in a patient of ISS stage 1;B:Treg cells in a patient of ISS stage 2;C:Treg cells in a patient of ISS stage 3.圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同ISS分期MM患者Treg細(xì)胞

    2 化療、化療療效、血清β2-MG與Treg細(xì)胞的關(guān)系

    對(duì)42例MM患者于化療前和化療后使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Treg細(xì)胞并進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)化療后患者Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)較化療前下降,從化療前0.13×109/L降至化療后0.10×109/L(P <0.01)。

    根據(jù)MM患者化療后M蛋白下降是否超過25%將患者分為緩解組及未緩解組,發(fā)現(xiàn)緩解組的31例患者化療后Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)下降(P<0.01),而未緩解組的11例患者Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)的改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表3。

    化療后8例患者血清β2-MG水平較化療前下降>50%,而34例患者血清β2-MG雖有改變,但下降≤50%,據(jù)此將患者分為β2-MG下降>50%組及β2-MG下降≤50%組。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)2組患者化療后Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)均下降,β2-MG下降>50%的MM患者Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)從0.19×109/L降至0.08×109/L(P <0.01),而 β2-MG 下降≤50%組從 0.12×109/L下降至0.10×109/L(P <0.01),β2-MG 下降>50%的MM患者Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)下降幅度大,2組Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)下降值對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),見表 4。

    表2 不同臨床指標(biāo)分組Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)比較Table 2.Treg cell count comparison among different clinicalcharacteristics groups[×109/L.median(range)]

    表3 不同化療療效組的Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 3.Treg cell count in different chemoresponse groups[×109/L.median(range)]

    表4 化療后不同β2-MG下降組的Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 4.Treg cell count in different β2 - MG reduction groups after chemotherapy[×109/L.median(range)]

    3 不同化療方案對(duì)Treg細(xì)胞改變影響

    根據(jù)不同化療方案對(duì)MM患者進(jìn)行分組分析,發(fā)現(xiàn)無論在接受硼替佐米聯(lián)合化療方案的30例患者或接受傳統(tǒng)方案化療的12例患者中,化療后MM患者外周血Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)均較化療前下降,接受硼替佐米聯(lián)合方案患者Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)從化療前0.17×109/L降至化療后0.10×109/L,而接受傳統(tǒng)方案患者從Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)從化療前0.10×109/L降至化療后0.08×109/L,2組Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)變化對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P <0.01),見圖3、表5。

    Figure 3.Treg cell count changes in different chemotherapy groups detected by FCM.A:Treg cells of patient A before bortezomibbased treatment;B:Treg cells of patient A after bortezomib-based treatment;C:Treg cells of patient B before conventioal treatment;D:Treg cells of patient B after conventional treatment.圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)接受硼替佐米聯(lián)合方案及傳統(tǒng)方案化療前后Treg細(xì)胞改變

    表5 不同方案化療前后Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 5.Treg cell count before and after different chemotherapies[×109/L.median(range)]

    接受硼替佐米聯(lián)合化療的30例患者中,獲得緩解的21例患者化療后Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)從0.17×109/L降至0.08×109/L(P <0.01),而未獲得緩解的9例患者化療后Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。接受傳統(tǒng)方案未獲緩解的10例患者化療后Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)未較化療前下降(P>0.05),接受傳統(tǒng)方案獲緩解患者因例數(shù)過少(2例)未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,見表6。

    表6 不同化療療效治療前后Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 6.Treg cell count before and after different chemoresponses[×109/L.median(range)]

    接受硼替佐米聯(lián)合化療的30例患者中,8例患者化療后血清β2-MG下降>50%,22例患者β2-MG下降≤50%。分析發(fā)現(xiàn)β2-MG下降>50%的患者化療后Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)下降,從化療前0.19×109/L降至化療后0.08×109/L(P <0.01),而 β2-MG下降≤50%患者化療后Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)未較化療前下降(P>0.05),見表7。接受傳統(tǒng)方案化療后患者血清β2-MG下降均不超過50%,因此未進(jìn)行分組分析。對(duì)接受硼替佐米聯(lián)合化療方案的MM患者化療后 Treg計(jì)數(shù)改變與血清 β2-MG改變進(jìn)行Spearman相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)接受硼替佐米方案化療患者外周血Treg計(jì)數(shù)下降與血清β2-MG下降水平呈線性相關(guān)(r=0.40,P <0.05),見圖4。

    表7 硼替佐米聯(lián)合化療患者不同β2-MG下降治療前后Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 7.Treg cell count changes in different β2 - MG reduction groups before and after bortezomib-based treatment[×109/L.median(range)]

    Figure 4.The relationship between changes of Treg cell count and serum β2 - MG in patients after bortezomib -based treatment.圖4 硼替佐米聯(lián)合化療后患者Treg細(xì)胞改變與血清β2-MG改變的相關(guān)關(guān)系

    討 論

    MM患者外周血Treg細(xì)胞與MM發(fā)病及預(yù)后有關(guān):初治的MM患者外周血Treg細(xì)胞增多,而在癌前病變階段及緩解期的患者Treg細(xì)胞與正常人相比無顯著差異[6];Treg細(xì)胞增高的MM患者中位生存時(shí)間較短,復(fù)發(fā)率增大[4,8,10]。本研究證實(shí)處于疾病早期、腫瘤負(fù)荷較小的MM患者Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)較低,化療后獲緩解患者Treg細(xì)胞下降,提示MM患者外周血Treg細(xì)胞與腫瘤負(fù)荷及療效有關(guān),推測(cè)Treg增高所致的機(jī)體免疫功能下調(diào)可能為MM實(shí)現(xiàn)免疫逃逸的重要機(jī)制之一。

    隨著造血干細(xì)胞移植術(shù)以及新藥如硼替佐米、雷利度胺的應(yīng)用,MM患者的治療緩解率及生存時(shí)間得到了明顯提高[3],但腫瘤耐藥及復(fù)發(fā)仍是MM治療的一大困境[10]。如何抑制Treg細(xì)胞活化、增殖,提高免疫細(xì)胞的抗腫瘤免疫,是目前克服骨髓瘤耐藥及復(fù)發(fā)的重要手段之一[11]。應(yīng)用于MM治療的藥物如環(huán)磷酰胺、氟達(dá)拉濱、沙利度胺、雷利度胺等均被證實(shí)具有清除MM患者Treg細(xì)胞作用[7-8,12-13],但尚未見關(guān)于硼替佐米對(duì) MM 患者Treg細(xì)胞影響的研究。硼替佐米可通過抑制NF-κB通路抑制T細(xì)胞增殖、活化,應(yīng)用該藥治療移植物抗宿主疾病的實(shí)驗(yàn)證實(shí)硼替佐米對(duì)人體外周血Treg細(xì)胞有抑制、清除作用[14]。體外研究發(fā)現(xiàn)該藥以誘導(dǎo)未成熟的Treg細(xì)胞凋亡作用為主,對(duì)已成熟的Treg細(xì)胞無殺傷作用[15]。而本研究首次發(fā)現(xiàn)對(duì)比傳統(tǒng)方案,接受硼替佐米化療的MM患者化療后Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)下降更明顯,提示硼替佐米對(duì)MM患者的Treg細(xì)胞具有抑制作用,考慮對(duì)Treg細(xì)胞的抑制可能是硼替佐米發(fā)揮抗腫瘤作用的重要環(huán)節(jié)之一。硼替佐米可能通過解除機(jī)體免疫抑制的微環(huán)境,增強(qiáng)細(xì)胞免疫的抗腫瘤能力,重建細(xì)胞免疫間的平衡穩(wěn)態(tài)而達(dá)到良好的清除腫瘤功能。

    研究亦發(fā)現(xiàn)在接受硼替佐米聯(lián)合方案化療的初治MM患者中,Treg細(xì)胞下降與腫瘤負(fù)荷的減少及治療反應(yīng)有關(guān),提示硼替佐米對(duì)于原發(fā)耐藥患者外周血Treg細(xì)胞的清除作用較少,患者化療療效不佳可能與藥物對(duì)Treg細(xì)胞清除不足有關(guān),推測(cè)聯(lián)合Treg細(xì)胞抑制劑及硼替佐米的化療可在目前治療基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高M(jìn)M患者療效。本研究為MM尋找新的治療方案奠定了理論基礎(chǔ),抑制Treg細(xì)胞的增殖與功能、增強(qiáng)免疫細(xì)胞特異性抗腫瘤免疫可能將進(jìn)一步提高硼替佐米治療MM的療效。

    [1]Bird JM,Owen RG,D'Sa S,et al.Guidelines for the diagnosis and management of multiple myeloma 2011[J].Br J Haematol,2011,154(1):32 -75.

    [2]Shah JJ,Orlowski RZ.Proteasome inhibitors in the treatment of multiple myeloma[J].Leukemia,2009,23(11):1964-1979.

    [3]Chen D,F(xiàn)rezza M,Schmitt S,et al.Bortezomib as the first proteasome inhibitor anticancer drug:current status and future perspectives[J].Curr Cancer Drug Targets,2011,11(3):239 -253.

    [4]Whiteside TL,Mandapathil M,Szczepanski M,et al.Mechanisms of tumor escape from the immune system:adenosine- producing Treg,exosomes and tumor- associated TLRs[J].Bull Cancer,2011,98(2):E25 - E31.

    [5]Giannopoulos K,Kaminska W,Hus I,et al.The frequency of T regulatory cells modulates the survival of multiple myelomapatients:detailed characterisation of immune status in multiple myeloma[J].Br J Cancer,2012,106(3):546-552.

    [6]Brimnes MK,Vangsted AJ,Knudsen LM,et al.Increased level of both CD4+FOXP3+regulatory T cells and CD14+HLA-DR-/lowmyeloid-derived suppressor cells and decreased level of dendritic cells inpatients with multiple myeloma[J].Scand J Immunol,2010,72(6):540 -547.

    [7]Sharabi A,Laronne- Bar- On A,Meshorer A,et al.Chemoimmunotherapy reduces the progression of multiple myeloma in a mouse model[J].Cancer Prev Res(Phila),2010,3(10):1265 -1276.

    [8]楊 云,張王剛,何愛麗,等.沙利度胺對(duì)多發(fā)性骨髓瘤患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞作用的臨床研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2008,16(3):538-542.

    [9]Blade J,Samson D,Reece D,et al.Criteria for evaluating disease response and progression in patients with multiple myeloma treated by high-dose therapy and haemopoietic stem cell transplantation[J].Br J Haematol,1998,102(5):1115-1123.

    [10]Beyer M,Kochanek M,Giese T,et al.In vivo peripheral expansion of naive CD4+CD25high FOXP3+regulatory T cells in patients with multiple myeloma[J].Blood,2006,107(10):3940-3949.

    [11]Joshua DE,Brown RD,Ho PJ,et al.Regulatory T cells and multiple myeloma[J].Clin Lymphoma Myeloma,2008,8(5):283 -286.

    [12]Galustian C,Meyer B,Labarthe MC,et al.The anticancer agents lenalidomide and pomalidomide inhibit the proliferationand function of T regulatory cells[J].Cancer Immunol Immunother,2009,58(7):1033 -1045.

    [13]Hegde U,Chhabra A,Chattopadhyay S,et al.Presence of low dose of fludarabine in cultures blocks regulatory T cellexpansion and maintains tumor-specific cytotoxic T lymphocyte activity generated with peripheral blood lymphocytes[J].Pathobiology,2008,75(3):200 -208.

    [14]Blanco B,Perez-Simon JA,Sanchez-Abarca LI,et al.Treatment with bortezomib of human CD4+T cells preserves natural regulatory T cells and allows the emergence of a distinct suppressor T -cell population[J].Haematologica,2009,94(7):975 -983.

    [15]Kim JS,Lee JI,Shin JY,et al.Bortezomib can suppress activation of rapamycin-resistant memory T cells without affecting regulatory T-cell viability in non-h(huán)uman primates[J].Transplantation,2009,88(12):1349 -1359.

    猜你喜歡
    佐米外周血計(jì)數(shù)
    古人計(jì)數(shù)
    伊沙佐米治療多發(fā)性骨髓瘤的研究進(jìn)展
    遞歸計(jì)數(shù)的六種方式
    古代的計(jì)數(shù)方法
    抗偏頭痛藥物佐米曲普坦相關(guān)雜質(zhì)的合成
    山東化工(2020年4期)2020-03-30 08:39:32
    口服蛋白酶體抑制劑伊沙佐米治療多發(fā)性骨髓瘤的療效和安全性研究
    這樣“計(jì)數(shù)”不惱人
    硼替佐米對(duì)淋巴瘤細(xì)胞中SHP-2基因表達(dá)的影響
    白血病外周血體外診斷技術(shù)及產(chǎn)品
    結(jié)腸炎小鼠外周血和結(jié)腸上皮組織中Gal-9的表達(dá)
    一级片'在线观看视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 在线观看免费视频网站a站| 久久久精品区二区三区| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久影院123| 久久热在线av| 18禁美女被吸乳视频| 丝瓜视频免费看黄片| 国产亚洲av高清不卡| 色播在线永久视频| 正在播放国产对白刺激| 91麻豆av在线| 午夜老司机福利片| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲av国产av综合av卡| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 无遮挡黄片免费观看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久青草综合色| 亚洲avbb在线观看| 日本一区二区免费在线视频| 99riav亚洲国产免费| 国产在线视频一区二区| 少妇精品久久久久久久| 男人舔女人的私密视频| 女同久久另类99精品国产91| 成人永久免费在线观看视频 | 国产人伦9x9x在线观看| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产成人精品久久二区二区91| 免费观看人在逋| 午夜福利欧美成人| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 一级a爱视频在线免费观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 91老司机精品| 大码成人一级视频| 十分钟在线观看高清视频www| 一区在线观看完整版| a级毛片在线看网站| 亚洲av日韩在线播放| 99精品欧美一区二区三区四区| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 一区二区三区国产精品乱码| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲综合色网址| 亚洲国产av影院在线观看| tocl精华| 大香蕉久久成人网| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久久欧美国产精品| 亚洲国产看品久久| av天堂在线播放| tube8黄色片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产淫语在线视频| 国产免费av片在线观看野外av| 两个人免费观看高清视频| 国产av一区二区精品久久| 欧美午夜高清在线| 国产一卡二卡三卡精品| 蜜桃国产av成人99| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产高清视频在线播放一区| 12—13女人毛片做爰片一| 乱人伦中国视频| tube8黄色片| 亚洲国产成人一精品久久久| 丰满饥渴人妻一区二区三| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 手机成人av网站| 亚洲国产欧美网| 欧美人与性动交α欧美软件| 丰满少妇做爰视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 99九九在线精品视频| 午夜福利视频精品| 日日夜夜操网爽| 亚洲成人手机| 热re99久久国产66热| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 99精品在免费线老司机午夜| 日日爽夜夜爽网站| 国产av国产精品国产| 亚洲 欧美一区二区三区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 日韩中文字幕视频在线看片| 青草久久国产| 久久精品成人免费网站| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 99精品久久久久人妻精品| 69精品国产乱码久久久| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲精品国产一区二区精华液| 免费av中文字幕在线| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲人成伊人成综合网2020| 狂野欧美激情性xxxx| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲色图综合在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美人与性动交α欧美软件| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲专区国产一区二区| 9热在线视频观看99| 亚洲精品在线美女| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 人妻 亚洲 视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产精品九九99| 久久中文字幕一级| 国产成人精品无人区| 在线观看免费日韩欧美大片| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 色尼玛亚洲综合影院| 精品国产乱子伦一区二区三区| 香蕉久久夜色| 高清欧美精品videossex| 在线观看免费视频日本深夜| 老熟女久久久| avwww免费| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲中文av在线| 亚洲七黄色美女视频| 欧美乱妇无乱码| 久久久久视频综合| 久久ye,这里只有精品| 久久 成人 亚洲| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 欧美在线一区亚洲| 欧美精品一区二区免费开放| 人人妻人人澡人人看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 色尼玛亚洲综合影院| 国精品久久久久久国模美| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产成人欧美| 搡老岳熟女国产| 国产伦理片在线播放av一区| 久久久久精品人妻al黑| 极品教师在线免费播放| 1024视频免费在线观看| av片东京热男人的天堂| 久久影院123| 一区二区三区乱码不卡18| 国产日韩欧美视频二区| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久久欧美国产精品| 精品久久久久久久毛片微露脸| 人成视频在线观看免费观看| 女警被强在线播放| 久久久精品94久久精品| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久久欧美国产精品| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 视频在线观看一区二区三区| 老司机午夜十八禁免费视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 色综合婷婷激情| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 丁香六月天网| 亚洲av美国av| 日本黄色日本黄色录像| 日本a在线网址| 日韩有码中文字幕| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产成人免费无遮挡视频| 九色亚洲精品在线播放| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 大香蕉久久网| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久久久网色| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 日韩精品免费视频一区二区三区| 大香蕉久久网| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 丝袜美足系列| 一级黄色大片毛片| 新久久久久国产一级毛片| 中文字幕人妻丝袜一区二区| a级毛片在线看网站| 久久香蕉激情| 日本vs欧美在线观看视频| 国产男女内射视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 岛国在线观看网站| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲中文av在线| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲avbb在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 99re在线观看精品视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 高清毛片免费观看视频网站 | 丰满少妇做爰视频| 飞空精品影院首页| 欧美午夜高清在线| 亚洲一码二码三码区别大吗| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 精品国内亚洲2022精品成人 | 狂野欧美激情性xxxx| 高潮久久久久久久久久久不卡| 在线观看免费视频日本深夜| 国产真人三级小视频在线观看| 欧美日本中文国产一区发布| a级毛片在线看网站| 国产单亲对白刺激| 精品少妇内射三级| 国产亚洲一区二区精品| 国产精品久久久人人做人人爽| 成人手机av| 日日爽夜夜爽网站| 久久久精品区二区三区| av视频免费观看在线观看| 日韩欧美免费精品| 国产极品粉嫩免费观看在线| 青青草视频在线视频观看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 人妻 亚洲 视频| 在线看a的网站| 老司机午夜福利在线观看视频 | 777久久人妻少妇嫩草av网站| 十八禁高潮呻吟视频| 男女床上黄色一级片免费看| 交换朋友夫妻互换小说| 女人精品久久久久毛片| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲精品在线美女| 国产精品国产av在线观看| 色播在线永久视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 女警被强在线播放| 脱女人内裤的视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲精品自拍成人| 黑人猛操日本美女一级片| 国产精品国产高清国产av | 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产精品.久久久| 欧美日韩一级在线毛片| 一级毛片女人18水好多| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 天天添夜夜摸| 视频区图区小说| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 热re99久久精品国产66热6| 人妻一区二区av| 久久精品亚洲av国产电影网| 欧美精品av麻豆av| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久中文字幕人妻熟女| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 99国产精品99久久久久| 日本黄色视频三级网站网址 | 一进一出好大好爽视频| 亚洲av日韩在线播放| 日韩大片免费观看网站| 咕卡用的链子| 国产在线一区二区三区精| 在线天堂中文资源库| 日本一区二区免费在线视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 久久久久久久国产电影| 在线天堂中文资源库| 久久这里只有精品19| 精品少妇内射三级| 男女午夜视频在线观看| 香蕉丝袜av| 在线av久久热| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 欧美在线黄色| 日本a在线网址| 夫妻午夜视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 深夜精品福利| 亚洲天堂av无毛| 中文字幕高清在线视频| 精品亚洲成国产av| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲国产中文字幕在线视频| 少妇 在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 青草久久国产| 亚洲精品av麻豆狂野| 十八禁高潮呻吟视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产精品久久电影中文字幕 | 免费在线观看日本一区| 嫩草影视91久久| 亚洲七黄色美女视频| 国产精品一区二区在线不卡| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | netflix在线观看网站| 精品亚洲成a人片在线观看| 精品免费久久久久久久清纯 | 久久影院123| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 性高湖久久久久久久久免费观看| 99热网站在线观看| 免费看a级黄色片| 久久久久视频综合| 国产精品熟女久久久久浪| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 亚洲全国av大片| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 精品国产一区二区久久| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产亚洲精品第一综合不卡| netflix在线观看网站| 三上悠亚av全集在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产成人av教育| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 12—13女人毛片做爰片一| 国产在线免费精品| 无人区码免费观看不卡 | 国产日韩欧美在线精品| 国产成人精品久久二区二区91| av一本久久久久| 精品国产亚洲在线| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲伊人久久精品综合| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 精品国产一区二区三区四区第35| 夜夜爽天天搞| 91大片在线观看| 久久久久久人人人人人| 女人久久www免费人成看片| 性少妇av在线| 美女国产高潮福利片在线看| 久久天堂一区二区三区四区| 欧美精品一区二区免费开放| 精品国内亚洲2022精品成人 | 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 午夜福利在线观看吧| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲av成人一区二区三| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 人妻 亚洲 视频| 桃红色精品国产亚洲av| 黄色毛片三级朝国网站| 嫩草影视91久久| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 日韩视频在线欧美| 中国美女看黄片| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 精品亚洲成国产av| 久久免费观看电影| 日本av手机在线免费观看| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲av日韩在线播放| 国产高清videossex| 不卡一级毛片| 香蕉丝袜av| 高清在线国产一区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 2018国产大陆天天弄谢| 日本黄色视频三级网站网址 | 免费高清在线观看日韩| 欧美成人免费av一区二区三区 | 真人做人爱边吃奶动态| 午夜福利视频在线观看免费| 在线观看免费日韩欧美大片| 搡老熟女国产l中国老女人| kizo精华| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 成人国产av品久久久| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 欧美乱妇无乱码| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久久欧美国产精品| 免费观看a级毛片全部| 我要看黄色一级片免费的| 宅男免费午夜| 国产成人免费观看mmmm| 婷婷成人精品国产| 大型av网站在线播放| 精品少妇久久久久久888优播| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 视频在线观看一区二区三区| 午夜福利视频精品| 在线永久观看黄色视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 色老头精品视频在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产97色在线日韩免费| 天堂俺去俺来也www色官网| 女人久久www免费人成看片| 欧美另类亚洲清纯唯美| 少妇粗大呻吟视频| 久久久久久久精品吃奶| 黄色怎么调成土黄色| 久久狼人影院| 69精品国产乱码久久久| 欧美性长视频在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲精品在线美女| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久青草综合色| 久久久精品免费免费高清| 亚洲av日韩精品久久久久久密| av网站在线播放免费| 美女视频免费永久观看网站| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 日本a在线网址| 国产精品电影一区二区三区 | 飞空精品影院首页| 国产有黄有色有爽视频| 青青草视频在线视频观看| 免费黄频网站在线观看国产| a在线观看视频网站| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产日韩欧美在线精品| 亚洲精品自拍成人| 中文字幕av电影在线播放| 国产欧美亚洲国产| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产精品1区2区在线观看. | 蜜桃国产av成人99| 天堂中文最新版在线下载| 国产一区二区 视频在线| 国产成人系列免费观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲国产欧美网| 国产av一区二区精品久久| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲专区字幕在线| 亚洲精品美女久久av网站| 十分钟在线观看高清视频www| 欧美亚洲日本最大视频资源| 69av精品久久久久久 | 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲伊人久久精品综合| 女同久久另类99精品国产91| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产精品久久久av美女十八| 欧美成狂野欧美在线观看| 精品福利观看| 亚洲九九香蕉| 99精品在免费线老司机午夜| 18禁国产床啪视频网站| 极品人妻少妇av视频| 老司机在亚洲福利影院| 免费高清在线观看日韩| 天堂8中文在线网| av在线播放免费不卡| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲三区欧美一区| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 色视频在线一区二区三区| 欧美黑人精品巨大| 性少妇av在线| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久久久网色| 天天添夜夜摸| www.精华液| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲熟女精品中文字幕| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 亚洲一码二码三码区别大吗| 99国产精品99久久久久| 蜜桃在线观看..| 91麻豆av在线| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲五月婷婷丁香| 日韩中文字幕欧美一区二区| 嫁个100分男人电影在线观看| 午夜两性在线视频| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲色图av天堂| 国产免费福利视频在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 日韩视频在线欧美| 两人在一起打扑克的视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲五月婷婷丁香| 国产精品免费视频内射| 免费高清在线观看日韩| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 欧美在线黄色| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 日本一区二区免费在线视频| 成年版毛片免费区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产男女超爽视频在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 他把我摸到了高潮在线观看 | 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 成人免费观看视频高清| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲av美国av| 国产激情久久老熟女| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲成国产人片在线观看| 99久久人妻综合| 精品久久久久久电影网| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 又大又爽又粗| 国产精品亚洲一级av第二区| 这个男人来自地球电影免费观看| 麻豆乱淫一区二区| 中亚洲国语对白在线视频| 成年版毛片免费区| 欧美精品一区二区大全| 亚洲av片天天在线观看| 91成年电影在线观看| 男男h啪啪无遮挡| av有码第一页| 亚洲av片天天在线观看| 成在线人永久免费视频| 美国免费a级毛片| 黄频高清免费视频| 我要看黄色一级片免费的| 欧美激情高清一区二区三区| 高清欧美精品videossex| 性高湖久久久久久久久免费观看| 一区二区三区国产精品乱码| 国产免费现黄频在线看| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 丝袜美腿诱惑在线| 一本综合久久免费| 18禁美女被吸乳视频| 手机成人av网站| 最近最新免费中文字幕在线| 中文亚洲av片在线观看爽 | 国产黄频视频在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 69精品国产乱码久久久| 欧美 日韩 精品 国产| 一进一出抽搐动态| 丝瓜视频免费看黄片| 国产麻豆69| 精品人妻1区二区| 日韩大片免费观看网站| 精品国产一区二区三区四区第35| 美女扒开内裤让男人捅视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 日韩欧美三级三区| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲中文av在线| 在线观看舔阴道视频| 51午夜福利影视在线观看| 成年版毛片免费区| 99riav亚洲国产免费| 国产精品久久久久久精品古装| 99香蕉大伊视频| 乱人伦中国视频| 国产成人欧美在线观看 | 国产在线观看jvid| 亚洲欧洲日产国产| 蜜桃在线观看..| 亚洲精品久久午夜乱码| videosex国产| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 黄色成人免费大全| 91国产中文字幕| 久久久久久人人人人人| 操美女的视频在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| √禁漫天堂资源中文www| 国产一卡二卡三卡精品| 国产成人av激情在线播放| 亚洲中文av在线| 日韩免费高清中文字幕av| 精品福利永久在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 热99re8久久精品国产| 国产日韩欧美在线精品|