EGFR 突變的非小細胞肺癌患者EML4－ALK 融合基因的檢測及其臨床特征分析*

林小梅， 莫娟梅， 鄒 敏， 曾愛屏， 于起濤， 周韶璋， 宋向群△

(廣西醫(yī)科大學1研究生院，2附屬腫瘤醫(yī)院化療二科，廣西 南寧530021)

肺癌是世界上癌癥死亡的常見惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌(non－small－cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌的80%～85%［1］，其中晚期NSCLC 患者的5 年生存率只有約15%，目前在晚期NSCLC 的治療上，一線含鉑的兩藥化療方案只使患者獲得了8 ～11 個月的中位生存期，其療效非常有限。隨著對腫瘤發(fā)病機制及其生物學行為研究的不斷深入，人們越來越多將治療的焦點集中于特異性高、不良反應輕的分子靶向藥物。目前NSCLC 的治療使用最多的是針對表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)突變的分子靶向藥物，即小分子的酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKIs)，其對存在EGFR 突變的NSCLC 患者顯示出了很好的臨床療效［2］。目前已證實其突變的優(yōu)勢人群具有以下的臨床特征:女性、不吸煙、亞裔和腺癌［3－4］。但在使用TKIs 過程中導致的原發(fā)或繼發(fā)耐藥尚難克服，因而對于不能從EGFR－TKIs 治療中獲益或發(fā)生耐藥的人群來說，尋找新的治療靶標將顯得尤為重要。

2007 年Soda 等［5］首次在非小細胞肺癌中發(fā)現了一個新型的融合基因EML4－ALK，此融合基因由棘皮動物微管相關蛋白樣4(echinoderm microtubule－associated protein－like 4，EML4)和間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)兩者的部分基因相互融合而成。EML4－ALK 在不加選擇的NSCLC 患者中的總表達率為3.4%［6］;而在某些經過篩選的NSCLC 人群中，EML4－ALK 的表達率可高達13.5%［7］。由于EML4－ALK 融合位點的多樣性，目前至少發(fā)現11 種不同的突變體類型［8］。且EML4－ALK 無論在體外或體內的研究中均具有致癌活性［5，9］，這種活性能被ALK 抑制劑有效阻斷［9－10］，說明其在肺癌的發(fā)生過程中起著關鍵性的作用。

在中國NSCLC 人群中，有研究示EML4－ALK 的表達率為2.9% ～11.6%［11－14］，但相關研究仍然非常有限，且進行EML4－ALK 檢測的NSCLC 患者例數仍較少。故為豐富中國肺癌分子缺陷目錄數據庫，本文對102 例經過選擇的中國非小細胞肺癌患者進行EML4－ALK 融合基因檢測，同時對檢測EML4－ALK 融合基因陽性患者的EGFR 和Kirsten 鼠肉瘤基因(Kirsten rat sarcoma，KRAS)的突變情況，并對EML4－ALK陽性和陰性病人的臨床及病理特征進行分析。為今后篩選EML4－ALK 突變的潛在臨床優(yōu)勢人群及實現以基因分型為基礎的NSCLC 個體化治療提供理論依據和重要的參考。

材 料 和 方 法

1 標本來源

入選實驗的102 例非小細胞肺癌患者均為中國人，且必須滿足以下至少一個條件(女性、不吸煙/少吸煙和腺癌)，病人的組織標本均來自中國廣西壯族自治區(qū)腫瘤醫(yī)院的標本庫，為2006 年1 月～2011 年8 月期間在廣西壯族自治區(qū)腫瘤醫(yī)院胸外科接受手術切除的腫瘤組織標本。腫瘤組織經手術切除后馬上浸泡于液氮中，隨后保存于－80 ℃冰箱中。

2 病人的臨床及病理信息的收集

入選實驗的102 例患者，均收集其以下信息:年齡、性別、吸煙史、組織病理分型及臨床分期，見表1。病人的組織病理分型參考2004 版世界衛(wèi)生組織(WHO)的肺癌組織學分類［15］，臨床分期參考第6 版國際肺癌研究協會(IASLC)的肺癌TNM 分期。

表1 引物序列Table 1. Sequences of the primers

3 主要試劑

RNA 提取試劑盒(RNeasy Mini Kit)為Qiagen 產品;逆轉錄試劑盒(RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit)為Fermentas 產品;DNA 聚合酶(KOD plus DNA polymerase )為Toyobo 產品;DNA 提取試劑盒(SK1261)和TaqDNA 聚合酶均購自生工生物工程(上海)有限公司;所用引物由寶生物工程(大連)有限公司根據要求合成。

4 主要方法

4.1 EML4－ALK 的檢測 首先使用RNA 提取試劑盒提取102 例非小細胞肺癌組織標本的總RNA，具體提取步驟按試劑盒說明書進行。所有提取的總RNA 均經超微量分光光度計(Thermo Scientific NanoDrop 2000)檢測其濃度及純度，其中所有標本的總RNA 的A260/A280均為2.0 ～2.1 之間，且經瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA 的完整性。提取的總RNA 經逆轉錄試劑盒逆轉錄成單鏈cDNA，逆轉錄步驟按試劑盒說明書進行。單鏈cDNA 經單管多重反轉錄－聚合酶鏈鎖反應(multiplex RT－PCR)進行擴增。因為目前已知EML4－ALK 有11種不同的突變體類型(8)［7］，為了用cDNA 擴增出所有已知的突變亞型，本實驗中單管PCR 反應同時使用了3 對不同的引物［11］，見表1。PCR 總反應體積25 μL，其中10 × buffer 2.5 μL，2 mmol/L dNTPs 2.5μL，25mmol/L MgSO4 1μL，上游引物(10 μmol/L)各加入1μL，下游引物(10 μmol/L)3μL，Template cDNA 1μL，PCR grade water 12.3 μL，KOD－Plus 0.7 μL。擴增條件為:94 ℃預變性5 min，94 ℃30 s，58 ℃30 s，68 ℃1 min ，共35 個循環(huán)，68 ℃10 min。同時PCR 反應設置內參照為甘油醛－3－磷酸脫氫酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)，其PCR 反應引物見表1。內參照擴增條件為:94 ℃預變性3 min，94 ℃30 s，58 ℃30 s，72℃45 s ，共35 個循環(huán)，72 ℃3 min。取RT－PCR 產物8.0 μL，加上樣緩沖液2.0 μL，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，90 V 40 min，凝膠圖像分析系統(GelPro Analyzer 3.0)分析目的基因與內參照GAPDH 條帶顯示，對于顯現目的基因條帶的PCR產物送上海生工生物工程公司直接測序。

4.2 EGFR 和KRAS 的檢測 本文對8 例EML4－ALK 融合基因陽性的患者腫瘤組織標本分別檢測其EGFR(18 ～21 外顯子)和KRAS(1、2 外顯子)的突變情況。首先使用DNA 提取試劑盒提取8 例陽性標本的DNA，后使用各個外顯子的相應引物對DNA 進行PCR 擴增，產物直接送上海生工生物工程公司直接測序。

5 統計學處理

用連續(xù)校正χ2檢驗(continuity correction χ2Test)和Fisher 精確概率法(Fisher’s exact test)來分析EML4－ALK 陽性和陰性病人與年齡、性別、吸煙史、病理類型及臨床分期之間的聯系。所有P 值均基于雙向假設檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。采用SPSS 13.0 進行數據分析。

結 果

1 EML4－ALK 的突變率及其與臨床病理特征之間的聯系

在102 例經過選擇的非小細胞肺癌患者中檢測出8 例EML4－ALK 陽性，其突變率為7.8%(8/102)。將8 例陽性患者腫瘤組織標本的PCR 產物直接測序，其中7 例為EML4－ALK 突變亞型1(variant 1，V1)，1 例為EML4－ALK 突變亞型2(variant 2，V2)。經統計分析得出EML4－ALK 陽性和陰性患者在年齡(P ＞0.05)、性別(P ＞0.05)、吸煙史(P ＞0.05)、病理類型(P ＞0.05)及臨床分期(P ＞0.05)差別均無統計學意義，見圖1、2、表2。

2 EML4－ALK 陽性患者在臨床病理特征中的構成比

102 例患者的總體平均年齡為(59 ±10)歲(30 ～80 歲)，8 例EML4－ALK 陽性患者平均年齡(59 ±5)歲(41 ～80 歲)。在8 例陽性患者中，有5 例患者的年齡小于總體患者的平均年齡，占62.5%(5/8)，3 例患者的年齡大于總體患者的平均年齡，占37.5%(3/8)。女性6 例，占75.0%(6/8);男性2例，占25.0%(2/8)。在吸煙史中，7 例患者不吸煙，占87.5%(7/8);1 例患者吸煙，占12.5%(1/8)。在病理類型中，5例為腺癌，占62.5%(5/8);1 例為鱗癌，占12.5%(1/8);2例為腺鱗癌，占25.0%(2/8)。在臨床分期中，4 例患者為Ⅰ期，占50.0%(4/8);3 例患者為Ⅲ期，占37.5%(3/8);1 例為Ⅳ期，占12.5%(1/8)，見表2。

Figure 1. The RT－PCR results of 8 EML4－ALK positive cases.M:maker(100 bp，ladder);NTC:non－template control;24，34，…，90:the number of the positive sample.V1:EML4－ALK variant 1(237 bp);V2:EML4－ALK variant 2(960 bp);GAPDH:glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase.圖1 8 例陽性標本的RT－PCR 產物

Figure 2. Base sequencing figures of positive samples. A:EML4－ALK variant 1;B:EML4－ALK variant 2.圖2 陽性標本的堿基測序圖

表2 病人臨床病理特征及EML4－ALK 陽性與陰性病人的臨床病理特征的對比Table 2. A summary of all patients with clinicopathological features and the comparison of clinicopathological features between the EML4－ALK－positive and－negative patients

3 EML4－ALK 陽性病人的EGFR 和KRAS 突變情況

經過檢測發(fā)現，8 例EML4－ALK 融合基因陽性的患者均無EGFR(18 ～21 外顯子)及KRAS(1、2 外顯子)的突變。

討 論

自從2007 年Soda 等［5］首次在NSCLC 患者身上發(fā)現了一個新的EML4－ALK 融合基因后，陸續(xù)有許多學者對其進行了研究。對于EML4－ALK 在非小細胞肺癌中的突變率，不同文獻的報道稍有差異。楊衿記等［6］綜合全球17 個研究的數據得出，EML4－ALK 在不加選擇的NSCLC 患者中的總表達率為3.4%，其中東方人NSCLC 患者為4.1%，而高加索人NSCLC 患者為2.5%。這些大規(guī)模非選擇NSCLC 患者的系列研究提示東西方人種EML4－ALK 融合基因總發(fā)生率似乎相似。但某些研究中進行EML4－ALK 檢測的NSCLC 患者是經過篩選的，如Shaw 等［7］研究中入組的患者必須滿足以下至少2 個條件(女性、亞裔、不吸煙/少吸煙和腺癌)，故在富含上述因子的NSCLC 人群中得出了EML4－ALK 的突變率為13.5%(19/141)。而Sun 等［11］通過篩選東亞不吸煙的肺腺癌患者作為研究對象后，得出EML4－ALK 的突變率5.8%(3/52)。似乎經過篩選的NSCLC 患者其EML4－ALK 突變率較不加選擇的NSCLC 患者的突變率稍高(13.5%或5.8% vs 3.4%)。在本研究中同樣限定實驗對象必須滿足以下至少一個條件(女性、不吸煙/少吸煙、腺癌)，同時研究中所有患者均為亞裔，經檢測后我們得出EML4－ALK 的突變率7.8%(8/102)，我們的結果同樣比不加選擇的NSCLC 患者的總突變率稍高(7.8% vs 3. 4%)，但低于Shaw 等的研究結果(7.8% vs 13.5%)。這可能與我們篩選實驗對象的條件與Shaw 等的研究并非完全一致有關，亦可能不同種族(亞裔vs高加索人)之間EML4－ALK 的突變率存在差異。故EML4－ALK 融合基因突變率在不同地域和種族中是否存在差異?仍需要更多的研究來證實。

在Sasaki 等［8］的綜述中顯示，在各種突變類型中，最常見的類型為突變體1 型(E13－A20，V1)，檢出率高達33%。而在本文8 例EML4－ALK 陽性患者中，7 例為V1，1 例為V2，V1 亞型占所有陽性標本的87.5%(7/8)，這與文獻報道的結果相似。

之前有文獻報道，EML4－ALK 陽性多見于年輕［7，12，16］，不吸煙/少吸煙［7，10，12，16］，腺癌［10，17－19］的非小細胞肺癌患者。我們通過比較EML4－ALK 陽性和陰性病人的臨床及病理特征得出，陽性和陰性病人在年齡、性別)、吸煙史、病理類型及臨床分期方面的差別均無統計學意義。分析原因可能是由于我們實驗入組的研究對象是經過篩選的人群(其中女性、不吸煙/少吸煙、腺癌這3 個條件必須滿足至少1 個)，如表1 所示，使得入組的患者接近一半為女性(47.1%)，且大多數偏向于不吸煙(71.6%)、腺癌(71.6%)的患者，這就造成我們入組人群的選擇偏倚。故最后再分析陽性和陰性病人在性別、吸煙史及病理類型方面的差別時，就得到了差別無統計學意義。

但本研究8 例EML4－ALK 陽性患者的臨床特征構成比顯示(表1):8 例陽性患者中，有5 例患者的年齡低于總體患者的平均年齡(62.5%)，3 例患者的年齡高于總體患者的平均年齡(37.5%)，說明EML4－ALK 陽性更多見于年輕患者。雖然女性是我們選擇入組的條件之一，但是從基線上看男女比例分別為52.9%和47.1%，基本平衡。但我們的結果提示在8 例陽性患者中，6 例為女性，2 例為男性(75% vs 25%)，女性為男性的3 倍。故在男女入組比例基本平衡的情況下，EML4－ALK 陽性更多見于女性患者。由于亞裔女性的吸煙率較低，在本研究中女性患者的吸煙率僅為6.3%(3/48)，且本研究中75%的EML4－ALK 陽性患者為女性，這一點也能解析為什么EML4－ALK 陽性更多見于不吸煙的人群。另外，我們發(fā)現8 例EML4－ALK 陽性患者中，5 例為腺癌，占62.5%(5/8)，這與之前絕大多數研究結果顯示EML4－ALK 陽性多見于腺癌患者相似［10，17－19］。另外2 例為腺鱗癌，亦含有腺癌的成分，說明EML4－ALK 陽性更多見于腺癌患者。

本文中8 例EML4－ALK 融合基因陽性患者的EGFR 和KRAS 突變狀態(tài)均為野生型。這與之前的絕大多數報道相符［5，7，12，16，19］，似乎說明了EML4－ALK、EGFR 和KRAS 這三者之間是相互排斥的。但是也存在特殊的病例，在Koivunen等［10］的報道中，在一個日本的腺癌病人身上同時發(fā)現了EML4－ALK 和EGFR 的突變;在中國NSCLC 人群中，Zhang等［13］也報道了在一個女性腺癌病人身上存在著EGFR 19 號外顯子和EML4－ALK 的雙重突變;Martelli 等［17］也在一個54歲的男性肺腺癌患者身上發(fā)現了EML4－ALK 和KRAS 的同時突變;目前認為以上共同突變屬于罕見事件。故EGFR 和KRAS 野生型與EML4－ALK 突變是同一分子事件的必然結果，還是純屬不同分子事件的巧合呢?以上問題還需在更廣泛的人群(包括不同種族、年齡、性別、病理類型和疾病的不同階段)中檢測除EML4－ALK 以外的更多分子指標，以發(fā)現和揭示這些不同分子事件的本質和彼此間的關聯。同時有研究［20］發(fā)現腫瘤細胞內EGFR 的表達程度對肺癌細胞的生長、分化和轉移均存在密切的影響，那么EML4－ALK 在腫瘤細胞中的表達程度是否對NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展、轉移存在影響?這也仍需進一步的研究證實。

EML4－ALK 融合基因已經代表了非小細胞肺癌的一種新的亞型，針對其的靶向藥物的臨床研究正在進行，所以我們應該堅信，在倡導腫瘤個體化治療的今天，針對EML4－ALK 這一靶點的深入研究，將有助于對其優(yōu)勢人群的正確篩選并開創(chuàng)ALK 抑制劑的非小細胞肺癌靶向治療新領域，同時將促使肺癌個體化治療更加精準有效和逐步走向成熟。

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