Trx－ASK1 在多柔比星誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡中的作用

黃海高， 李悅山

(廣州醫(yī)學(xué)院藥理教研室，廣東 廣州510182)

硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種多功能小分子蛋白，因其具有重要的抗氧化和抗凋亡作用［1］而備受研究者重視。研究發(fā)現(xiàn)Trx 的抗凋亡作用主要通過抑制凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal－regulating kinase 1，ASK1)，進(jìn)而抑制了ASK1 所介導(dǎo)的凋亡下游信號(hào)通路［2］。

多柔比星(doxorubicin，DOX)是一種蒽環(huán)類抗生素，臨床上廣泛應(yīng)用于各種腫瘤的治療［3］，但是其應(yīng)用過程中會(huì)出現(xiàn)很強(qiáng)的心臟毒性［4］，進(jìn)而導(dǎo)致各種心肌病與心力衰竭的發(fā)生［5－6］。研究表明DOX 的心臟毒性與心肌細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，但是目前有關(guān)凋亡的具體機(jī)制仍然不是十分明確。DOX 體外誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡過程中Trx－ASK1 是否會(huì)發(fā)生分離以及ASK1 是否會(huì)被活化進(jìn)而啟動(dòng)凋亡下游信號(hào)通路，目前未見相關(guān)報(bào)道。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 主要試劑 DOX、ebselen 和細(xì)胞級(jí)二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)于Sigma。高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)自Gibco。MTT、細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、caspase－3 分光光度法檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞凋亡熒光Hoechst 33258 試劑盒購(gòu)于南京凱基生物。熒光探針熒光素2'，7'－二氯二氫熒光素二乙酯(2'，7'－dichlorodihydrofluorescin diacetate，H2DCFDA)購(gòu)于Molecular Probes。免疫沉淀試劑盒、BCA 蛋白測(cè)定試劑盒和發(fā)光液購(gòu)自Pierce。兔Trx 多克隆抗體購(gòu)于Millipore;山羊ASK1多克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz;聚ADP 核糖聚合酶1［poly(ADP－ribose)polymerase 1，PARP 1］、磷酸化ASK1(p－ASK1)、p38 有絲分裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen－activated protein kinase，p38)和磷酸化p38(p－p38)抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology。1.2 動(dòng)物 SPF 級(jí)Sprague－Dawley 新生大鼠(1 ～3 d)，雌雄不限，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供。

2 方法

2.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng) 乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)參照Simpson 等［7］的方法改進(jìn)而得。取新生24 ～72 h 的SD 乳鼠消毒后，在超凈臺(tái)無菌操作下快速打開乳鼠胸腔暴露心臟，取左室心肌組織立即浸入冰冷的D－Hanks 液中，重復(fù)，直到剪完所有乳鼠，用D－Hanks 液沖洗，剪成(0.5 ～1)mm ×1 mm ×1 mm 大小的組織塊，再?zèng)_洗數(shù)次;將心肌組織碎塊轉(zhuǎn)移至無菌錐形瓶，加消化液(0.125%胰蛋白酶液)6 ～8 mL，37 ℃恒溫磁力攪拌50 r/min。用0.125%胰蛋白酶消化8 次左右，每次6 ～8 min，吸管輕輕吸取上清，移入冷的離心管中，收集除前2 次以外的消化液，(每次消化后，用吸管吹打30 s，靜置約2 min)用適量含血清的冰培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min 離心10 min，棄上清，收集所有沉淀加入含15% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，置37℃、5% CO2水套式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。因內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞較心肌細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)，2 h 后培養(yǎng)液中懸浮的細(xì)胞95%是心肌細(xì)胞。小心吸出細(xì)胞懸浮液計(jì)數(shù)，根據(jù)需要稀釋到一定密度(5 ×105～1 ×106)，接種于培養(yǎng)皿或孔板中。24 h 后換液，換為無血清加胰島素(10 mg/L)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(10 mg/L)、維生 素B12(1.5 μmol/L)和BrdU (0.1 mmol/L)的DMEM 培養(yǎng)基。第3 d 換液，換用不含BrdU 的上述無血清培養(yǎng)基。如果可見細(xì)胞搏動(dòng)率大于95%，即可進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

2.2 心肌細(xì)胞活力測(cè)定 參照南京凱基生物的MTT 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒說明書，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，考察心肌細(xì)胞的活力。

2.3 細(xì)胞漿caspase－3 活性的測(cè)定 參照凱基生物的caspase－3 分光光度法檢測(cè)試劑盒說明書，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，考察caspase－3 的活化程度。

2.4 心肌細(xì)胞凋亡熒光顯微鏡觀察 參照南京凱基生物的細(xì)胞凋亡熒光Hoechst 33258 試劑盒說明書，正常細(xì)胞顯淡藍(lán)色，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核濃縮，顯亮藍(lán)色。

2.5 DOX 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生 預(yù)孵育50 μmol/L ebselen 2 h，給予1 μmol/L DOX。24 h 后，用ROS 敏感的熒光探針H2DCFDA 標(biāo)記細(xì)胞，熒光顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)H2DCFDA 熒光強(qiáng)度變化，以熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)ROS 含量的變化。

2.6 免疫沉淀試劑盒檢測(cè)Trx－ASK1 的分離 用多克隆ASK1 抗體和免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)方法獲取細(xì)胞中的總ASK1。具體方法參照Pierce 公司的IP 試劑盒說明書。Trx－ASK1 的分離使用抗Trx 多克隆抗體檢測(cè)。

2.7 Western blotting 檢測(cè)cleaved PARP1、p－ASK1(Ser967)、p38 和p－p38 蛋白水平 提取細(xì)胞總蛋白后，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，孵育Ⅰ抗(1 ∶1 000)4 ℃過夜，或β－actin(1∶1 000)室溫孵育2 h，Ⅱ抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，曝光。結(jié)果用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD 法)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度DOX 作用后細(xì)胞活力檢測(cè)

待心肌細(xì)胞搏動(dòng)率大于95%，換用不含Brdu 的上述無血清培養(yǎng)基，分別給予0、0.1、0.5、1 和5 μmol/L DOX。24 h 后，檢測(cè)細(xì)胞活力。1 μmol/L 與5 μmol/L DOX 組MTT 值下降，與對(duì)照組MTT 值比較均有顯著差異(P ＜0.01)，見圖1A。

Figure 1. Effects of doxorubicin (DOX)on vability (A，n =6)and apoptosis［caspase－3 activation (B，n =4)and PARP1 cleavage (C，n=3)］of cardiomyocytes. ±s. △△P ＜0.01 vs 0 μmol/L.圖1 不同濃度DOX 對(duì)心肌細(xì)胞活力和凋亡的影響

2 不同濃度DOX 作用后細(xì)胞漿caspase－3 活性的測(cè)定

心肌細(xì)胞分別給予0、0.1、0.5、1 和5 μmol/L DOX，24 h 后檢測(cè)胞漿caspase－3 活性。與對(duì)照組相比，1 μmol/L DOX 組caspase－3 活 化度為(151.23 ±10.41)% (P ＜0.01)，5 μmol/L DOX 組caspase－3 活 化 度 為(161.03 ± 12.21)% (P ＜0.01)，見圖1B。

3 不同濃度DOX 作用后細(xì)胞cleaved PARP1 的檢測(cè)

心肌細(xì)胞分別給予0、0.1、0.5、1 和5 μmol/L DOX，24 h 后檢測(cè)cleaved PARP1 的表達(dá)。與對(duì)照組相比，1 μmol/L 和5 μmol/L DOX 組cleaved PARP1表達(dá)明顯增加(P ＜0.01)，見圖1C。

4 預(yù)孵育ebselen 后細(xì)胞活力檢測(cè)

待心肌細(xì)胞搏動(dòng)率大于95%，換用不含BrdU 的上述無血清培養(yǎng)基，預(yù)孵育50 μmol/L ebselen 2 h，給予1 μmol/L DOX。24 h 后，檢測(cè)細(xì)胞活力。1 μmol/L DOX 組MTT 值下降，與對(duì)照組MTT 值比較有顯著差異(P ＜0.01);ebselen 可以顯著抑制DOX對(duì)細(xì)胞的損傷，與DOX 組MTT 值比較有顯著差異(P ＜0.05)，見圖2A。

Figure 2. Ebselen (Ebs)reduced DOX－induced cardiomyocyte apoptosis. ±s. A:n =6;B:n =4;C:n =3. △△P ＜0.01 vs control;* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs DOX.圖2 Ebselen 抑制多柔比星誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡

5 預(yù)孵育ebselen 后細(xì)胞漿caspase－3 活性的測(cè)定

預(yù)孵育50 μmol/L ebselen 2 h，給予1 μmol/L DOX。24 h 后，檢測(cè)胞漿caspase－3 活性。與對(duì)照組相比，1 μmol/L DOX 組caspase－3 活化度為(171.04 ±10.41)% (P ＜0.01);與DOX 組相比，ebselen 可以顯著抑制caspase－3 的活化［(125.04 ±6.41)%］(P ＜0.05)，見圖2B。

6 預(yù)孵育ebselen 后細(xì)胞cleaved PARP1 的檢測(cè)

預(yù)孵育50 μmol/L ebselen 2 h，給予1 μmol/L DOX。24 h 后，檢測(cè)cleaved PARP1 的表達(dá)。與對(duì)照組相比，1 μmol/L DOX 組cleaved PARP1 表達(dá)明顯增加(P ＜0.01);與DOX 組相比，ebselen 組cleaved PARP－1 表達(dá)明顯減少(P ＜0.01)，見圖2C。

7 DOX 和(或)ebselen 對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的影響

預(yù)孵育50 μmol/L ebselen 2 h，給予1 μmol/L DOX。24 h 后，加入熒光探針H2DCFDA 孵育30 min清洗后觀察，DOX 組比對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)單位面積熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，證實(shí)有ROS 的產(chǎn)生，給予ebselen 后，ROS 量減少，見圖3。

Figure 3. Ebselen (50 μmol/L for 24 h)inhibited DOX(1 μmol/L)－ induced ROS production in cardiomyocytes. A:control;B:DOX;C:DOX+ebselen;D:ebselen..圖3 Ebselen 抑制DOX 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生

8 細(xì)胞凋亡熒光顯微鏡觀察

預(yù)孵育50 μmol/L ebselen 2 h，給予1 μmol/L DOX。24 h 后，Hoechst 33258 熒光染色。對(duì)照組細(xì)胞呈淡藍(lán)色，1 μmol/L DOX 組細(xì)胞呈亮藍(lán)色，有明顯的核固縮，具有凋亡的顯著特征，與DOX 組相比，ebselen 組凋亡有所改善，見圖4。

Figure 4. Ebselen (50 μmol/L for 24 h)inhibited DOX(1 μmol/L)－induced apoptosis of cardiomyocytes (Hoechst 33258 staining，×400). A:control;B:DOX;C:DOX+ebselen;D:ebselen.圖4 Ebselen 抑制DOX 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察

9 免疫沉淀檢測(cè)Trx－ASK1 的分離

預(yù)孵育50 μmol/L ebselen 2 h，給予1 μmol/L DOX。24 h 后，檢測(cè)Trx－ASK1 的分離，與對(duì)照組相比，1 μmol/L DOX 組Trx－ASK1 的分離顯著增加(P＜0.01)，與DOX 組相比，ebselen 組Trx－ASK1 分離減少(P ＜0.01)，充分說明DOX 作用心肌細(xì)胞后，Trx－ASK1 發(fā)生了分離(P ＜0.01)，給予ebselen 后，分離有所減少(P ＜0.01)，見圖5。

Figure 5. Effect of ebselen (50 μmol/L for 24 h)on DOX(1 μmol/L)－induced Trx－ASK1 dissociation in cardiomyocytes measured by immunoprecipitation. ± s. n=3. ##P ＜0.01 vs control;△△P ＜0.01 vs DOX.圖5 免疫沉淀法檢測(cè)ebselen 對(duì)DOX 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Trx－ASK1 分離的影響

10 p－ASK1(Ser967)、p38 和p－p38 蛋白表達(dá)檢測(cè)

預(yù)孵育50 μmol/L ebselen 2 h，給予1 μmol/L DOX。24 h 后，檢測(cè)p－ASK1(Ser967)的表達(dá)，與對(duì)照組相比，1 μmol/L DOX 組p－ASK1(Ser967)表達(dá)顯著減少(P ＜0.01)，與DOX 組相比，ebselen 組p－ASK1(Ser967)表達(dá)顯著增加(P ＜0.01)，見圖6;同樣預(yù)孵育50 μmol/L ebselen 2 h，DOX 處理后15 min檢測(cè)p38 和p－p38 的表達(dá)，與對(duì)照組相比，1 μmol/L DOX 組p－p38 顯著增加(P ＜0.01)，與DOX 組相比，ebselen 組p－p38 顯著增加(P ＜0.01);各組之間p38 的表達(dá)無顯著差異，見圖7。說明DOX 作用心肌細(xì)胞后，ASK1 和p38 均被激活。

Figure 6. Effect of ebselen (50 μmol/L for 24 h)on DOX(1 μmol/L)－induced expression of p－ASK1 in cardiomyocytes. ±s. n=3. △△P ＜0.01 vs control;* P ＜0.05 vs DOX.圖6 Ebselen 對(duì)DOX 作用的乳鼠心肌細(xì)胞p－ASK1 表達(dá)的影響

Figure 7. Effect of ebselen (50 μmol/L for 24 h)on DOX(1 μmol/L)－induced expression of p38 and p－p38 in cardiomyocytes. ± s. n =3. ##P ＜0.01 vs control;△△P ＜0.01 vs DOX.圖7 Ebselen 對(duì)DOX 作用的乳鼠心肌細(xì)胞p38 和p－p38表達(dá)的影響

討 論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用DOX 體外誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞凋亡，首次證明了在此凋亡過程中Trx 和ASK1 發(fā)生了一定程度的分離，進(jìn)而啟動(dòng)了ASK1 介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路，這可能成為DOX 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

DOX 是一種臨床上廣泛應(yīng)用于抗腫瘤的藥物，但由于具有很強(qiáng)的心臟毒性，應(yīng)用受到了很大的限制。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞的凋亡是DOX 心臟毒性最為直接的表現(xiàn)形式之一［8］。關(guān)于DOX 導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制目前研究并不是十分充分。

眾多研究表明，DOX 作用心肌細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生較多的ROS，進(jìn)而認(rèn)為ROS 在細(xì)胞凋亡過程中起到了重要的作用［9－10］。文獻(xiàn)報(bào)道DOX 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡時(shí)1 μmol/L 的濃度被認(rèn)為是與臨床應(yīng)用最為相關(guān)的濃度。因此本實(shí)驗(yàn)選取了DOX 0.1、0.5、1 和5 μmol/L 濃度觀察DOX 對(duì)心肌細(xì)胞存活率的影響(MTT 檢測(cè))，及對(duì)caspase－3 和PARP1 活化的影響。基于大量實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道DOX 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞內(nèi)ROS 含量會(huì)增加，我們選取了抗氧化劑ebselen 作為保護(hù)劑。實(shí)驗(yàn)證實(shí)DOX 作用于心肌細(xì)胞可以發(fā)生明顯的凋亡，并且細(xì)胞內(nèi)的ROS量顯著增加，caspase－3 活化，PARP1 蛋白發(fā)生活化，給予抗氧化劑ebselen 后得到了顯著改善。

硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)是幾乎存在于所有原核和真核生物內(nèi)的一種多功能小分子蛋白，同時(shí)也是細(xì)胞內(nèi)重要的二硫鍵還原酶，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的還原狀態(tài)并正常發(fā)揮功能起著非常重要的作用。生物體內(nèi)的Trx 系統(tǒng)包括Trx、Trx 還原酶(TrxR)、還原型輔酶II(NADPH)和Trx 過氧化物酶(TrxP)。這是一個(gè)控制細(xì)胞還原/氧化狀態(tài)和細(xì)胞增殖/生存的廣泛表達(dá)的氧化還原酶系統(tǒng)。Trx－1除了具有抗氧化作用外，還具有抗凋亡作用［1－2］。其抗凋亡作用與細(xì)胞內(nèi)的ASK1 密切相關(guān)。ASK1 是一種有絲分裂原激活蛋白激酶激酶激酶家族(MAPKKK)中的一員，在凋亡信號(hào)中發(fā)揮著重要作用。ASK1 活化可以激活有絲分裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)家族中的MAPKK4、MAPKK7 和MAPKK3、MAPKK6，進(jìn)而活化有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中c－Jun 氨基端激酶(JNK)和p38(p38 MAPK)這兩個(gè)促凋亡蛋白激酶。促凋亡蛋白激酶p38 與JNK 的活化會(huì)通過caspase 依賴途徑激活caspase－3，進(jìn)而激活PARP1 蛋白，PARP1 活化則失去重要的DNA 修復(fù)功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。還原型Trx－1 主要是通過Cys－32、35 的巰基與ASK1的N 端連接，從而抑制了ASK1 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［2］。前面實(shí)驗(yàn)我們已經(jīng)證實(shí)給予1 μmol/L DOX 后細(xì)胞內(nèi)ROS 含量顯著增加，由此我們推測(cè)在這一過程中Trx 發(fā)生了氧化，與ASK1 發(fā)生了分離。為了證實(shí)我們的假設(shè)，我們采用免疫沉淀法分別檢測(cè)了正常組、DOX 組、ebselen + DOX 組和單純ebselen 組細(xì)胞內(nèi)Trx－ASK1 是否發(fā)生分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組細(xì)胞比較，DOX 組細(xì)胞內(nèi)Trx－ASK1 發(fā)生了顯著的分離(P ＜0.01)，較DOX 組，ebselen +DOX 組細(xì)胞內(nèi)Trx－ASK1 分離減少(P ＜0.01)。免疫沉淀證實(shí)了給予DOX 后細(xì)胞內(nèi)Trx－ASK1 發(fā)生了分離，接著我們檢測(cè)了ASK1 是否發(fā)生活化。我們選用p－ASK1(Ser967)抗體進(jìn)行Western blotting 檢測(cè)。p－ASK1(Ser83)、p－ASK1(Ser967)發(fā)生去磷酸化或者p－ASK1(Thr845)發(fā)生磷酸化均可代表ASK1 的活化。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常組細(xì)胞比較，DOX 組細(xì)胞內(nèi)p－ASK1(Ser967)表達(dá)顯著減少(P ＜0.01)，較DOX組，ebselen+DOX 組細(xì)胞內(nèi)p－ASK1(Ser967)表達(dá)顯著增加(P ＜0.01)。這可以說明給予DOX 后，ASK1 發(fā)生了活化，給予ebselen 后活化減少。我們發(fā)現(xiàn)與正常組細(xì)胞比較，DOX 組細(xì)胞內(nèi)p－p38 表達(dá)顯著增加(P ＜0.01)，較DOX 組，ebselen +DOX組細(xì)胞內(nèi)p－p38 表達(dá)顯著減少(P ＜0.01)。這說明，給予DOX 后，細(xì)胞內(nèi)p38 發(fā)生了活化，給予ebselen 后，活化減少。由此說明，DOX 體外誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過程中Trx－ASK1 發(fā)生了一定程度的分離，ASK1、p38、caspase－3 和PARP1 均參與了這一凋亡過程。

DOX 作用心肌細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)硝基酪氨酸量顯著增加，過多亞硝酸鹽的產(chǎn)生可以使一些凋亡相關(guān)蛋白發(fā)生硝基化進(jìn)而導(dǎo)致凋亡的發(fā)生［11］。DOX 作用心肌細(xì)胞可以抑制一些特定基因的表達(dá)［12－13］。本文主要是探討在氧化應(yīng)激的情況下Trx－ASK1 這一復(fù)合體的變化，以及下游相關(guān)蛋白的變化。對(duì)于在這一過程中凋亡信號(hào)通路中其它蛋白的變化情況以及是否還存在其它凋亡機(jī)制，我們將在后續(xù)工作中進(jìn)一步探討。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)DOX 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡過程中，Trx－ASK1 發(fā)揮了一定的作用，這將有助于進(jìn)一步了解DOX 心臟毒性的機(jī)制。

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