皮膚血管瘤和血管畸形細胞增殖與凋亡的對比研究

[摘要]目的：探討皮膚血管瘤和血管畸形的細胞凋亡與增殖的平衡關系及與臨床生物學行為的可能關系。方法：采用流式細胞．術檢測皮膚血管瘤和血管畸形組織中凋亡細胞比率及細胞周期分布，分析細胞凋亡/增殖水平。結果：血管瘤增生期和消退期凋亡/增殖水平出現(xiàn)下調和上調(P＜0.05)，而血管畸形細胞凋亡/增殖水平與正常皮膚相比無顯著性差異(P＞0.05)。結論：細胞凋亡/增殖水平在皮膚血管瘤和血管畸形之間存在差異且可能與二者的病理演變過程密切相關。

[關鍵詞]血管瘤；血管畸形；增殖；凋亡

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)06－0743－03

自1982年Mulliken和Glowaki將傳統(tǒng)意義上的血管瘤分為(真性)血管瘤和血管畸形以來，有關此類疾病的分類方法和相關研究得到了不斷的完善和發(fā)展，對于血管瘤和血管畸形在組織學、臨床生物學行為和診斷治療方面的對比研究頗多，二者明顯不同的病程演變和臨床生物學特征也逐漸被認識，但其發(fā)生機制尚不明確。本實驗通過對不同時期血管瘤、血管畸形和正常皮膚的細胞增殖和凋亡水平進行對比分析，旨在初步探討兩種病變的凋亡與增殖平衡的變化規(guī)律及其與臨床生物學行為的關系。

1 材料和方法

1．1 材料：選用2005年2月～2006年1月臨床診斷為血管瘤和血管畸形的手術切除的新鮮標本56例，部位為頜面部、四肢及軀干部。標本均分為兩份，一部分凍存?zhèn)溆?為盡量減少凍存對細胞存活率的影響，采用慢速分步降溫，先于4℃冷平衡15min，然后-20℃ 30 min，最后置入-80℃冰箱保存)，一部分經10％甲醛固定后行常規(guī)石蠟包埋，制4μm厚連續(xù)切片，HE染色后光鏡下根據Mulliken等的組織學標準并結合疾病的臨床生物學行為將病變分類：血管瘤40例，年齡12天～38歲，其中增生期(或叫增殖期20例，消退期(或叫退化期)20例；血管畸形13例，年齡2月～60歲；另有3例病理證實非血管瘤和血管畸形。所有標本術前未行干預性治療，術后病理確診，無合并結締組織疾病、免疫系統(tǒng)疾病及其他重要臟器疾病。同時取20例正常全厚皮膚作為對照。

1．2 方法：應用流式細胞術(FCM)分析細胞凋亡和細胞周期分布。

1．2．1 單細胞懸液的制備：組織塊解凍后置于70％冷乙醇溶液4℃固定24h。將組織塊置于120目不銹鋼網上，下置一平皿，用眼科剪刀將組織剪碎，以眼科鑷子輕搓組織，邊搓邊用生理鹽水沖洗，直至將組織搓完為止。將平皿中的混懸液以300目銅網過濾去除細胞團塊，收集細胞懸液，以800r/min離心2min。去除上清液，加入PBS液調整單細胞懸液為1×106/ml。

1．2．2 細胞凋亡和細胞周期測定：取單細胞懸液100μl，加入碘化丙啶(PI)1ml 4℃避光染色30min，以500目銅網過濾即可上機檢測。

1．2．3 流式細胞儀檢測條件及參數：采用美國Beckman Coulter公司的Epics－XL Ⅱ型流式細胞儀，應用Expo 32 ADC進行免疫熒光數據分析，應用Multicycle AV分析軟件對DNA細胞周期擬合分析。檢測前調整儀器CV值在2％以內。

1．2．4 結果判定：應用DNA細胞周期分析軟件，獲取DNA組方圖各時相分布的百分比，以增殖指數(proliferation index，PI)表示細胞增殖活性，PI=(S＋G₂/M)/(G₀//G₁+S+G₂/M)×100％。在DNA直方圖上于正常二倍體細胞的G₀/G₁峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰(sub－G₁)，其占分析細胞的百分比經分析軟件處理后得出細胞凋亡率(apoptosis rates，AR)。

1．3統(tǒng)計學處理：所有數據采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計分析。樣本均數比較采用方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 HE染色結果：光鏡下增生期血管瘤內皮細胞大量增生呈團索狀，內皮細胞核肥大而淡染，血管腔呈竇隙樣或無明顯血管腔；消退期血管瘤內皮細胞數目減少，內皮細胞核扁平，血管腔明顯，血管周圍纖維結締組織增多。血管畸形血管管腔呈異常擴張，管壁由扁平的內皮細胞構成，胞核扁平，無內皮細胞增多；正常皮膚中的毛細血管由1～2個內皮細胞圍成，管壁較薄，內皮細胞胞質?。簝H含核的部分略厚，內皮細胞核扁平。

2．2 細胞凋亡率、增殖指數結果：血管瘤各組AR，PI及AR/PI與血管畸形和正常皮膚之間差異均有統(tǒng)計學意義，而血管畸形和正常皮膚之間均無明顯差異(P＞0.05)。見表1。

3 討論

傳統(tǒng)上血管瘤一詞用于定義多種脈管性病變，并根據形態(tài)學分類分為毛細血管瘤(包括葡萄酒色斑與草莓狀血管瘤)、海綿狀血管瘤、蔓狀血管瘤和混合型血管瘤，這種分類方法僅僅根據臨床癥狀和形態(tài)結構進行，并不能確切地反映各類疾病的本質。1982年Mulliken和Glowaki根據血管內皮細胞的組織病理學特點，結合疾病的臨床行為及其他實驗室指標，將傳統(tǒng)意義上所謂的血管瘤分為(真性)血管瘤和血管畸形兩種，并進一步將血管瘤分為增生期和消退期兩期。這種生物學分類方法較為合理科學，對脈管性病變的診斷、鑒別診斷、治療方法的選擇及預后判斷都有更為實際的指導意義。1993年Jackson等根據血管造影、多普勒超聲、核磁共振等檢查結果所提示的血流動力學特點將血管畸形進一步分為高流量和低流量兩型。1995年Waner和Suen根據脈管畸形形成的機制及病變發(fā)生的部位等，對Mulliken等的分類提出了修改和補充，以微靜脈畸形取代了原分類中的毛細血管畸形，此分類方法得到國外同行廣泛認同，我國學者亦推薦采用。對于脈管性疾病的準確分類將利于對其相關領域的深入研究。

血管瘤是以內皮細胞異常增殖為特征的腫瘤，而血管畸形其血管內皮細胞分裂率正常，無異常增殖狀態(tài)，是血管形態(tài)結構上的異常。二者的臨床生物學特征和預后有明顯不同，血管瘤的自然病程較為特殊，它們往往于出生后1個月內出現(xiàn)，在前6～12個月內迅速生長，且可超出小兒正常發(fā)育速度：在隨后的1～5年(或更長時間)腫物增生速度逐漸減慢或停止生長，大部分血管瘤有自行緩慢消退的趨勢。而血管畸形通常在出生時即存在，它的增長速度和生長發(fā)育成比例，可長期穩(wěn)定存在，無自行消退傾向。此外二者在臨床表現(xiàn)、影像學檢查、血液動力學改變、部分細胞和細胞外標記物方面也有所不同。至今血管瘤和血管畸形這兩種病變的發(fā)生、發(fā)展機制尚不明確。近年來隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的研究，發(fā)現(xiàn)許多腫瘤細胞數目的控制是通過細胞增殖和凋亡的平衡來實現(xiàn)的，但有關血管瘤和血管畸形組織中的細胞增殖和凋亡的對比研究尚不多見。

本實驗對血管瘤和血管畸形組織進行細胞周期分析，檢測了病變細胞周期時相S期的比率，直接反映了細胞增殖能力，結果顯示血管瘤組織中具有較高的PI，且在增生期較消退期更為明顯。而血管畸形組織與正常皮膚的PI相近，無顯著性差異，提示血管瘤中的細胞具有較強的增殖分裂能力，尤其是增生期的血管瘤細胞的增殖能力相對更強；而血管畸形與正常皮膚相似，細胞具有正常的增殖周期，無異常的高增殖狀態(tài)，與MullikenTan等對血管瘤及血管畸形內皮細胞體外培養(yǎng)的生長特性的研究結果相符，依此也可以解釋二者不同的組織學改變。本實驗同時應用FCM檢測了凋亡細胞比率，當細胞凋亡時可發(fā)生形態(tài)學和生化方面特征性的改變，可用多種方法進行檢測，各有優(yōu)缺點。FCM檢測凋亡直觀、簡便和迅速，是目前公認的凋亡量化指標，與其它凋亡分析方法具有良好的相關性，但不足是特異性稍差。本組結果顯示血管瘤各期AR均高于血管畸形和正常皮膚，其中在消退期尤為明顯，血管畸形組織的細胞凋亡水平與正常皮膚相比無顯著性差別，表明在血管瘤由增生期向消退期發(fā)展的病程中存在著逐漸活躍的細胞凋亡現(xiàn)象。

機體的細胞數目控制是通過細胞增殖和細胞死亡的平衡來實現(xiàn)的。結合本實驗細胞增殖與凋亡結果，提示在血管畸形組織中，細胞的凋亡/增殖水平與正常皮膚相似，未出現(xiàn)平衡性的改變，在組織學形態(tài)學上也僅僅顯示出血管結構的改變，而未出現(xiàn)細胞數目的明顯改變和新生血管形成，不存在細胞異常增殖現(xiàn)象，且內皮細胞的形態(tài)與正常血管內皮細胞一致。臨床上血管畸形的生長過程平穩(wěn)，生長速度與小兒生長發(fā)育成比例增長，它的漸進性增大不是由于病變內的細胞增生或血管、淋巴管數量的增多所致，而是因為病變內原有血管或淋巴管管腔進行性擴張而引起。血管畸形與血管瘤不同，無明顯的增生期和消退期，也無自行消退的趨勢，所以一般需積極治療。而對于血管瘤，在增生期細胞增殖活性大于凋亡活性，AR/PI水平下調，細胞不斷增殖，在組織學形態(tài)上表現(xiàn)為血管瘤內皮細胞大量增生；而在消退期較增生期相比，凋亡水平明顯升高，增殖活性下降，AR/PI平衡出現(xiàn)明顯上調，表明此期細胞凋亡的增加和細胞增殖的相對抑制促使細胞從增殖走向凋亡，在組織學形態(tài)上顯示其內皮細胞由異常增生到逐漸減少，這也與它的臨床生物學行為相符，即存在可超出小兒正常發(fā)育速度的快速生長期，此后往往生長速度逐漸減慢且存在自行消退的可能，所以對于大部分血管瘤可先進行嚴密動態(tài)觀察。可以推測細胞凋亡/增殖的平衡改變可能與血管瘤的增生消退過程密切相關，細胞凋亡與增殖的平衡狀態(tài)可能是血管瘤可自行消退而血管畸形不能白行消退的重要因素之一。

血管瘤和血管畸形是兩類性質不同的病變，其發(fā)生發(fā)展的病理過程亦不同，確切機制尚不明確，本實驗結果提示在血管瘤的自然病程中存在著凋亡/增殖平衡的上調，這可能與它的白行消退有關，進一步研究凋亡/增殖平衡關系及其調控機制，將有利于發(fā)現(xiàn)更有效的手段來調控治療血管瘤。