枸杞多糖延緩小鼠皮膚衰老的實(shí)驗(yàn)研究

[摘要]目的：研究枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides，LBP)對D－半乳糖擬衰老小鼠皮膚組織的延緩皮膚衰老作用。方法：80只2月齡昆明種小鼠隨機(jī)分為四組：正常組(N)、衰老模型組(C)、低劑量LBP抗衰老組(L)和高劑量LBP抗衰老組(H)。衰老模型組與抗衰老用藥組每日頸背皮下注射D－半乳糖溶液制造衰老模型。抗衰老用藥組在注射D－半乳糖期間以LBP灌胃。42天后取小鼠背部皮膚檢測。結(jié)果：衰老模型組、低、高劑量LBP抗衰老組小鼠皮膚含水量、表皮厚度、真皮厚度以及成纖維細(xì)胞數(shù)與正常對照組比較差異有顯著性意義(P＜0.01)，組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：D－半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老模型是可靠的衰老實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，枸杞多糖能延緩皮膚衰老。

[關(guān)鍵詞]枸杞多糖；皮膚衰老

[中圖分類號]R322.99 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)06－0734－03

皮膚位于體表，是最早顯現(xiàn)機(jī)體衰老的組織。皮膚衰老不僅影響外貌，還與許多皮膚病有病因?qū)W聯(lián)系，因此預(yù)防和延緩皮膚衰老已成為醫(yī)學(xué)和美容的研究熱點(diǎn)。枸杞多糖(Lycium barbarumpolysaccharides，LBP)是枸杞子的主要活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、防衰老等多種功能。有研究表明，枸杞多糖有抗氧化延緩皮膚衰老的作用。我們研究LBP對D－半乳糖擬衰老小鼠皮膚組織的延緩皮膚衰老作用，為開發(fā)研制枸杞多糖資源提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級昆明種小鼠80只，2個(gè)月齡，體重16～24g，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1．1．2 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：OLYMPUS IMT－I型倒置相差顯微鏡(Japart)；LeicaRm－2135型石蠟切片機(jī)(Germany)；計(jì)算機(jī)圖像數(shù)字化分析系統(tǒng)(德國LEICA公司)。枸杞多糖(永州大舜中藥提取研究所惠贈)；D－半乳糖(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 實(shí)驗(yàn)分組：80只2月齡昆明種小鼠隨機(jī)分為四組，即正常組(N)，衰老模型組(C)，低劑量LBP抗衰老組(L)，高劑量LBP抗衰老組(H)。每組20只，自由進(jìn)食和飲水。

1．2．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型：衰老模型組與抗衰老用藥組每日頸背皮下注射D－半乳糖溶液，開始劑量為80mg/(kg·天)，7天；隨后為120mg/(kg·天)，14天；140mg/(kg·天)，14天；最后注射180mg/(kg·天)，7天。正常組每日注射同體積的生理鹽水。注射均按無菌操作要求進(jìn)行。抗衰老用藥組在注射D－半乳糖期間以LBP(低劑量LBP抗衰老組：10mg/kg；高劑量LBP抗衰老組：20mg/kg)1次/天灌胃。正常組與衰老模型組則以生理鹽水代之。

1．2．3 檢測皮膚含水量：頸背部皮膚去毛清潔后，切取1cm²皮膚，精密稱其濕重，隨即將其放入烘箱中，于80℃烘干12h，稱其干重，按下面方法計(jì)算皮膚含水量百分率：

皮膚含水百分率：濕重－干重/濕重×100％/濕重

1．2．4 制作皮膚病理切片，觀察皮膚組織結(jié)構(gòu)：按常規(guī)組織切片HE染色法制作皮膚組織病理切片，鏡下分析不同處理組皮膚內(nèi)部組織學(xué)變化特點(diǎn)，計(jì)算機(jī)圖像數(shù)字化分析系統(tǒng)定量分析小鼠表皮厚度、真度厚度。

1．2．5 成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)：高倍視野下對HE染色切片上成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)，每例觀測3個(gè)高倍視野，計(jì)算每例切片成纖維細(xì)胞數(shù)/HPF，求出各組均值。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析(One－WayANOVA)，當(dāng)總體方差齊同時(shí)選擇LSD法分析；當(dāng)方差不齊時(shí)，選擇Dunnet C法分析。

3 結(jié)果

3．1 皮膚含水量及成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)：衰老模型組小鼠皮膚含水量及成纖維細(xì)胞數(shù)較正常對照組明顯減少，枸杞多糖可以提高皮膚組織含水量及成纖維細(xì)胞數(shù)。組間兩兩比較，P＜0.01，差異具有顯著性意義(見表1)。

3．2 皮膚表皮、真皮厚度和病理切片結(jié)構(gòu)變化：衰老模型組小鼠皮膚表皮、真皮厚度均較正常對照組明顯減少，枸杞多糖可以提高皮膚表皮及真皮厚度。組間兩兩比較，P＜0.01，差異具有顯著性意義(見表2、圖1～4)。

4 討論

在進(jìn)行衰老研究時(shí)，通常需要依據(jù)某一公認(rèn)的衰老學(xué)說，制造最接近臨床衰老癥狀的動(dòng)物模型，以用于抗衰老藥物的篩選和研究。因此，建立成功的衰老動(dòng)物模型，對于揭示衰老機(jī)制和研究抗衰老藥物的作用機(jī)理有著十分重要的意義。衰老的代謝學(xué)說認(rèn)為，新陳代謝是生命的本質(zhì)，也是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，衰老是機(jī)體代謝障礙的結(jié)果，糖代謝在三大物質(zhì)代謝中具有很重要的意義，糖代謝紊亂必然會引起心、肝、腎、腦等重要器官代謝異常，最終出現(xiàn)衰老。因此，在一定時(shí)間內(nèi)，連續(xù)給動(dòng)物注射大劑量的D－半乳糖，使機(jī)體細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度增高，在醛糖還原酶的催化下，還原成半乳糖醇，這種物質(zhì)不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響正常滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、功能障礙、代謝紊亂，最終導(dǎo)致衰老的發(fā)生。

Christopher等人在1979年首先提出了半乳糖性白內(nèi)障發(fā)生機(jī)理，是新陳代謝異常在晶體方面產(chǎn)生的病理變化。隨后，國內(nèi)學(xué)者利用大劑量D－半乳糖造成動(dòng)物的糖代謝障礙，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)代謝和脂類物質(zhì)代謝，致使動(dòng)物不僅出現(xiàn)老年性白內(nèi)障，而且還出現(xiàn)晶體病變以外的其它組織、細(xì)胞一系列退行性變化，也符合人類自然衰老時(shí)所出現(xiàn)的癥狀。國內(nèi)學(xué)者應(yīng)用大、小鼠成功建立了D－半乳糖誘發(fā)的亞急性衰老模型，并探討了其發(fā)病機(jī)理。進(jìn)入20世紀(jì)90年代后，D－半乳糖致亞急性衰老模型的研究、應(yīng)用日盛。本實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)D－半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老模型是可靠的衰老實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

增齡使皮膚呈現(xiàn)漸進(jìn)性老化，角質(zhì)層變薄，皮膚水合能力下降，水分喪失增加，皮膚細(xì)織細(xì)胞水分減少，細(xì)胞皺縮、老化、組織缺水、萎縮，出現(xiàn)組織學(xué)結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)改變而使皮膚出現(xiàn)細(xì)小皺紋。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)，枸杞多糖能夠增加皮膚組織的含水量，這正是其能改善皮膚老化狀態(tài)的機(jī)制之一。隨著年齡的增長，表皮細(xì)胞的分裂增值能力下降，細(xì)胞更新的速度將會減慢，表皮突變淺變平；真皮表現(xiàn)為真皮密度降低，相對細(xì)胞和血管數(shù)目減少。長期暴露于各種氧化應(yīng)激和損傷DNA的因子中可導(dǎo)致人成纖維細(xì)胞的早衰。本研究表明，枸杞多糖具有改善皮膚組織學(xué)形態(tài)及結(jié)構(gòu)的功能。