自體移植皮片中黑素細(xì)胞的密度和功能變化

[摘要]目的：通過對(duì)自體移植皮片中黑素細(xì)胞密度和功能變化的測(cè)定，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)黑素細(xì)胞密度變化在自體移植皮片過度色素沉著中的作用。方法：利用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定自體中厚移植皮片黑素細(xì)胞中特異性抗原顯示黑素細(xì)胞，計(jì)算表皮中黑素細(xì)胞的密度，并與自體正常皮膚對(duì)照；利用銀染－麗春紅法檢測(cè)自體中厚移植皮片和正常皮膚中黑素含量。結(jié)果：自體移植皮片與自體對(duì)照正常皮膚中黑素細(xì)胞的密度差異無顯著性(P＞0.05)；自體中厚移植皮片中黑色素含量較自體正常對(duì)照皮膚中的黑色素含量明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論：自體皮片移植后表皮中黑素細(xì)胞密度無明顯變化，與皮片色素沉著程度無顯著相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞]自體移植皮片；黑素細(xì)胞；過度色素沉著

[中圖分類號(hào)]R622 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008－6455(2007)06－0731－03

自體皮片移植是整形外科常用的手術(shù)方法之一，但皮片移植成活后常伴有不同程度的過度色素沉著。國內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)皮片移植后過度色素沉著的機(jī)制作了研究，其中對(duì)于皮片移植后黑素細(xì)胞數(shù)量的變化有著不同的看法。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定人體自體中厚移植皮片中黑素細(xì)胞的密度變化，以及自體中厚移植皮片中黑素含量的變化，進(jìn)一步澄清黑素細(xì)胞密度的變化在自體移植皮片過度色素沉著中的作用。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本：本組實(shí)驗(yàn)所需標(biāo)本均取自頸部自體中厚皮片移植術(shù)后1年，局部需再次手術(shù)的患者。取自體中厚移植皮片23例，同時(shí)在每例移植皮片受區(qū)及原供區(qū)腹部周圍分別切取正常皮膚作對(duì)照?；颊吣挲g7～34歲，男16例，女7例。所取標(biāo)本的患者均無垂體腎上腺疾病、傳染病、皮膚病及免疫性疾病，局部無感染、潰瘍，術(shù)前未應(yīng)用激素及免疫抑制劑治療，局部亦未曾行放射治療。標(biāo)本切取后在半小時(shí)內(nèi)放入液氮瓶，然后置－80℃冰箱保存。1．2主要試劑：Mel－5單克隆抗體：美國SignetLaboratories Inc產(chǎn)品；Envision免疫組化染色試劑盒：美國Dako公司；DAB：美國Sigma公司等；Fontana銀液；氯化金；麗春紅(Ponceau)(上海天平化學(xué)試劑廠)；JVC彩色攝像頭(TK－C1381，JVC公司，日本)；彩色病理圖像分析系統(tǒng)(四川大學(xué)圖像圖形研究所)。

1．3 免疫組化步驟：切片脫蠟至水，每張切片加過氧化酶阻斷劑(3％H₂O₂)50μl，作用10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；切片浸入0.01mol/L PBS緩沖液中，微波處理10min：每張切片加鼠抗人Mel－5單克隆抗體50μl，37℃條件，作用60min：每張切片加Envision試劑50μl，37℃條件，作用30min；以上各步驟均經(jīng)0.01mol/L PBS(pH7.4)沖洗，5min×3次；然后將切片置新鮮配制的0.01％DAB/0.03％H202顯色液中顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染1min；脫水，透明，中性樹膠封片。同時(shí)用PBS代替Mel－5單克隆抗體作陰性對(duì)照。

1．4 Masson Fontana－Poneeau染色：各組標(biāo)本石蠟包埋后，切片脫蠟至蒸餾水浸洗，再浸入Fontana銀液15h；蒸餾水及時(shí)浸洗2次，氯化金處理2min：蒸餾水浸洗2次，Ponceau處理3min：無水乙醇脫水，過濾紙吸干；二甲苯透明和中性樹膠封閉；鏡檢，黑色素定位于表皮黑素細(xì)胞、角朊細(xì)胞胞漿。膠原纖維呈紅色，背景淡黃色；拍照，掃描成像分析儀處理系統(tǒng)進(jìn)行光密度掃描。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)，使用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，P＜0.01為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 免疫組化染色結(jié)果：Mel－5免疫標(biāo)記物定位于基底部黑素細(xì)胞胞漿，為黃或棕黃色顆粒，呈局灶性或彌漫性分布(圖1)。各組標(biāo)本中每200個(gè)基底細(xì)胞中平均陽性細(xì)胞數(shù)為：自體中厚移植皮片組28.4±3.2；皮片原供區(qū)正常皮膚組26.8±4.5；皮片受區(qū)周圍正常皮膚組27.6±4.1。自體中厚移植皮片組中黑素細(xì)胞密度與皮片原供區(qū)和受區(qū)周圍正常皮膚中黑素細(xì)胞密度相比，其差異性不顯著(P＞0.05)；皮片受區(qū)周圍正常對(duì)照皮膚與原供區(qū)腹部正常對(duì)照皮膚中黑素細(xì)胞密度的差異亦無顯著性(P＞0.05)

2．2 Masson Fontana－Ponceau染色結(jié)果：黑色素呈黑色，定位于表皮黑素細(xì)胞、角朊細(xì)胞胞漿，膠原纖維呈紅色，背景呈淡黃色。在白體中厚移植皮片表皮基底細(xì)胞中黑素含量較皮片原供區(qū)和受區(qū)周圍正常皮膚中明顯增多；皮片表皮基底層黑素細(xì)胞中黑素小體明顯增多，在突起未端亦見黑素小體增多，與黑素細(xì)胞相鄰近的角朊細(xì)胞中黑素顆粒明顯增多且位于角朊細(xì)胞細(xì)胞核的上方，在棘層和顆粒層細(xì)胞中可見少許黑素顆粒(圖2)，經(jīng)計(jì)算機(jī)掃描計(jì)算各組灰度值為：自體中厚移植皮片組為0.73±0.07；皮片原供區(qū)正常皮膚組為0.24±0.03；皮片受區(qū)周圍正常皮膚組為0.29±0.06。自體中厚移植皮片組中黑素含量與皮片原供區(qū)和受區(qū)周圍正常皮膚中黑素含量相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；皮片受區(qū)周圍正常對(duì)照皮膚與原供區(qū)腹部正常對(duì)照皮膚中黑素含量相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)

3 討論

自體皮片移植是整形外科常用的手術(shù)方法之一，但移植皮片成活后常伴有不同程度的過度色素沉著，從而影響了手術(shù)效果。如何防治自體皮片移植后過度色素沉著，至今仍是困擾整形外科醫(yī)生的一道難題，主要原因是其確切發(fā)生機(jī)制尚未闡明。

對(duì)于自體皮片移植后呈過度色素沉著現(xiàn)象許多學(xué)者作了研究，提出了許多重要的理論，但在自體皮片移植后表皮中黑素細(xì)胞的密度變化在皮片過度色素沉著中的作用，存在不同的看法。此前亦有研究表明，黑素細(xì)胞來源于胚胎時(shí)期的神經(jīng)嵴細(xì)胞，分化程度高，通過有絲分裂增殖的可能性較小，不同種族的人正常皮膚中黑素細(xì)胞數(shù)大體上是相同的，但黑種人角朊細(xì)胞內(nèi)黑素體數(shù)量多、形大、黑素化程度深，單個(gè)散在分布、降解緩慢。而來自白種人則相反，黑素體量少、形小、黑素化程度輕，多聚集分布于吞噬溶酶小體內(nèi)，容易發(fā)生降解，這些表現(xiàn)及過程與遺傳因素有關(guān)，并受多種基因的調(diào)控。但亦有人又觀察到在皮膚慢性炎癥或損傷后，處于炎性環(huán)璄中的黑素細(xì)胞可發(fā)生有絲分裂進(jìn)行增殖，并可發(fā)生黑素細(xì)胞的移行。

為觀察自體中厚移植皮片在經(jīng)歷了組織損傷、修復(fù)，炎性反應(yīng)基本穩(wěn)定后，其表皮黑素細(xì)胞的密度變化與皮片呈過度色素沉著表現(xiàn)是否具有相關(guān)性，本研究利用75KDa的色素相關(guān)糖原蛋白特異性存在于表皮黑素細(xì)胞中參與黑素的合成，通過免疫組化方法使用特異性的單克隆抗體Mel－5與表皮黑素細(xì)胞中75KDa的色素相關(guān)糖原蛋白抗原相結(jié)合，顯示黑素細(xì)胞；結(jié)果表明，黑素細(xì)胞密度變化在自體中厚移植皮片與正常對(duì)照皮膚之間無顯著差異，供區(qū)與受區(qū)部位正常對(duì)照皮膚之間黑素細(xì)胞數(shù)量的差異亦無顯著差異性，說明白體皮片移植后雖經(jīng)歷了組織的損傷、修復(fù)及炎性反應(yīng)過程，黑素細(xì)胞的密度無明顯變化。同時(shí)利用銀染一麗春紅法檢測(cè)自體中厚移植皮片和正常皮膚中黑素含量，顯示在自體中厚移植皮片表皮中黑素含量較正常皮膚中明顯增多，從大體上亦觀察到皮片呈過度色素沉著表現(xiàn)。從細(xì)胞形態(tài)學(xué)上觀察亦可知，自體皮片移植后表皮中黑素細(xì)胞分支狀樹突增多，與周圍基底細(xì)胞連接緊密；角朊細(xì)胞亦表現(xiàn)為胞體肥大，核淡染，核周出現(xiàn)透明區(qū)，與黑素細(xì)胞連接緊密，表明白體皮片移植后表皮中黑素細(xì)胞、角朊細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征發(fā)生了變化，相應(yīng)細(xì)胞的功能亦可能會(huì)發(fā)生變化。至于本實(shí)驗(yàn)觀察到皮片表皮中黑素細(xì)胞密度變化與李海洋等觀察的結(jié)果不一致，也許是兩者觀察的時(shí)間差異所致，本組實(shí)驗(yàn)所取標(biāo)本均為術(shù)后一年，移植皮片的組織損傷、修復(fù)及炎性反應(yīng)基本穩(wěn)定，而后者的觀察時(shí)間是術(shù)后三月內(nèi)，移植皮片的組織損傷、修復(fù)及炎癥反應(yīng)可能還未完全消退，表皮黑素細(xì)胞還處于從損傷到恢復(fù)、增殖的過程中，其后續(xù)變化情況可進(jìn)一步研究觀察。

在此前研究中我們觀察到自體中厚移植皮片a－MSH及其受體的表達(dá)明顯增強(qiáng)，在自體移植皮片過度色素沉著過程中起重要調(diào)控作用。研究表明a－MSH及其受體的表達(dá)上調(diào)通過G蛋白與腺甘酸環(huán)化酶偶聯(lián)增加細(xì)胞內(nèi)cAMP含量，蛋白激酶被激活，酪氨酸酶生成增多，活性增強(qiáng)，黑素合成增加并使黑素體擴(kuò)散，且主要是優(yōu)先刺激合成優(yōu)黑素并促進(jìn)黑素體擴(kuò)散，在黑素細(xì)胞、角朊細(xì)胞內(nèi)呈“核上帽”形成分布，從而使皮膚的色素沉著明顯。由上可知，自體移植皮片在經(jīng)歷組織的損傷、修復(fù)及炎癥反應(yīng)過程后，其表皮中黑素細(xì)胞功能增強(qiáng)、表皮中黑素含量明顯增多，是導(dǎo)致皮片呈過度色素沉著表現(xiàn)的主要原因，其基底層黑素細(xì)胞的密度無明顯變化，故自體皮片移植后呈過度色素沉著表現(xiàn)與黑素細(xì)胞的密度變化無明顯相關(guān)性。