ＲＧＤ多肽表面修飾對ＨＡ－ＴＣＰ生物陶瓷修復骨缺損的影響

[摘要]目的：了解精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸(Arg－Gly－Asp，RGD)多肽表面修飾對羥基磷灰石－磷酸三鈣(hydroxyapatine－tricalcium phosphate，HA－TCP)修復節(jié)段性骨缺損的影響。方法：以骨髓基質(zhì)干細胞(marrow stromal cells，Mscs)復合RGD多肽表面修飾的HA－TCP或單純材料培養(yǎng)制備組織工程骨，選擇60只新西蘭白兔，制作15mm長的橈骨節(jié)段性骨缺損模型，實驗根據(jù)植入不同的材料分為A、B、C和D組，A組：骨缺損區(qū)植入MSCs復合RGD多肽表面修飾的HA－TCP培養(yǎng)制備的組織工程骨；B組：骨缺損區(qū)植入Mscs復合HA－TcP培養(yǎng)制備的組織工程骨；C組：骨缺損區(qū)植入RGD多肽表面修飾的HA－TCP；D組：骨缺損區(qū)植入HA－TCP。術(shù)后4、8、16周取材，行X線檢查、組織學觀察、計算機圖像分析和生物力學測定。結(jié)果：術(shù)后4、8、16周各組骨缺損區(qū)均有新骨生成，成骨量隨時間的推移而增加。經(jīng)X線、組織學和生物力學評估，成骨能力依次為：A＞B＞C＞D(P＜0.001，P＜0.05)，其中A組術(shù)后16周骨缺損完全修復，骨髓腔再通，生物力學性能接近正常骨。結(jié)論：RGD多肽表面修飾對以HA－TCP為支架材料組織工程骨的修復作用有明顯優(yōu)化作用。

[關鍵詞]組織工程；表面修飾；骨髓基質(zhì)干細胞；修復

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)06－0723－04

RGD多肽是介導種子細胞與支架材料粘附的多肽鏈，RGD序列可被固有粘附蛋白受體特異性結(jié)合，在生物材料表面白發(fā)形成一分子層，為與受體介導的種子細胞提供特異性位點而促進細胞的粘附和分化。本研究旨在應用RGD多肽對HA－TCP材料進行表面修飾處理，以促進MSCs在其表面的粘附和生長，為骨組織工程提供一種支架材料的表面修飾手段。

1 材料和方法

1．1 材料準備：HA－TCP雙相多孔生物陶瓷(四川大學生物材料工程研究中心)含60％HA和40％TCP，孔隙率為50％～70％，孔隙直徑為200～500~m。將材料修整為1.5cm×0.5cm×0.5cm大小，蒸餾水加壓反復沖洗，去離子水超聲清洗2次，每次30min，高壓蒸汽滅菌后備用。將RGD多肽(美國Peptide生物工程公司)溶解于50％乙醇中，濃度為2mmol/L。將材料分別置于帶膠皮塞的離心管中，加入RGD多肽溶液，負壓抽吸使RGD多肽溶液進入材料孔隙內(nèi)，4℃放置24h，吸除溶液，晾干。用pH值為7.4的0.0lmol/L PBS漂洗至中性，晾干。

1．2 組織工程骨制備：取健康新西蘭白兔2只，雙側(cè)脛骨結(jié)節(jié)處備皮消毒，無菌條件下用骨穿針穿刺抽取紅骨髓8ml，加入含肝素的DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)，混勻后加入3ml淋巴細胞分離液(Gibco公司)，1 800r/min離心10min，吸除中間層細胞后再離心，所得細胞沉淀以1×10⁶/ml密度接種于含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5％CO₂飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細胞相互融合達90％生長面積時用0.25％胰蛋白酶(sigma公司)消化傳代培養(yǎng)。細胞傳至3代時，移入含1×10^-8mol/L地塞米松、50mg/L維生素C和1×10^-2mol/L β－磷酸甘油鈉的DMEM培養(yǎng)液誘導培養(yǎng)3天，誘導后的細胞表型經(jīng)鑒定為成骨樣細胞。將支架材料用DMEM培養(yǎng)液浸泡1天后棄殘液，每個支架材料以1×10⁶/ml密度接種經(jīng)誘導培養(yǎng)的MSCs，于37℃、5％CO₂飽和濕度培養(yǎng)7天。

1．3 動物模型和實驗分組：選擇3周齡雌性新西蘭白兔60只，體重為2.0～2.5kg。動物全身麻醉后，常規(guī)消毒雙上肢，沿上肢前外側(cè)做縱行切口，長25mm，逐層切開、分離、顯露橈骨，于橈骨中上1/3交界處截骨，去除橈骨和骨膜，制造15mm長的右側(cè)肢體橈骨節(jié)段性骨缺損模型。實驗根據(jù)植入不同的材料分為A、B、C和D組，每組實驗動物10只，其中A組：骨缺損區(qū)植入MSCs復合RGD多肽表面修飾的HA－TCP培養(yǎng)制備的組織工程骨；B組：骨缺損區(qū)植入MSCs復合HA－TCP培養(yǎng)制備的組織工程骨；C組：骨缺損區(qū)植入RGD多肽表面修飾的HA－TCP；D組：骨缺損區(qū)植入HA－TCP。

1．4 檢測項目

1．4．1大體觀察和x線檢查：術(shù)后觀察動物飲食、活動，傷口有無腫脹、分泌物等。術(shù)后4、8及16周X線攝片，根據(jù)Lane等(1987)的X線評分標準對各組移植區(qū)骨形成、骨連接和骨塑形進行評分。術(shù)后4、8及16周處死動物，取尺橈骨全段，觀察移植物的顏色、質(zhì)地和血管形成，與宿主骨融合和周圍軟組織分布情況。

1．4．2 組織學觀察：標本經(jīng)4％多聚甲醛固定后，乙醇梯度脫水，有機樹脂包埋。用硬組織切片機(德國Leica公司)制作厚度為5μm切片標本，行甲苯胺藍染色，顯微鏡下觀察移植區(qū)的骨愈合情況。用MLAS醫(yī)用計算機圖像分析系統(tǒng)(四川大學計算機學院)采集術(shù)后4周和16周的組織切片，在4倍物鏡下尋找包含移植材料的視野，計算每一視野中材料與材料內(nèi)所形成新骨的面積百分比。

1．4．3 生物力學測定：用萬能材料試驗機(美國Instron公司)測量各實驗組術(shù)后16周尺橈骨標本的最大扭轉(zhuǎn)強度，以正常兔的尺橈骨為對照。

1．5 統(tǒng)計學方法：采用SPSS 10.0軟件包對檢查結(jié)果行多個樣本均數(shù)的方差分析和兩兩比較的口檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 大體觀察：各組動物術(shù)后上肢均有不同程度腫脹，1周后癥狀消失。術(shù)后4周，A和B組移植材料與宿主骨界線不清，結(jié)合牢固，推之不動，有骨痂向材料中央延伸。C和D組移植材料與宿主骨界線清晰，周圍有大量纖維組織和血管長入。術(shù)后8周，A和B組移植材料與宿主骨牢固融合，材料表面有堅硬外骨痂形成，骨痂開始塑形。C和D組移植材料與宿主骨界線模糊，移植材料與宿主骨交界有大量骨痂形成。術(shù)后16周，各組移植材料被骨痂完全包圍，移植材料與宿主骨界線消失。術(shù)后各時期，移植材料周圍軟組織未見變性、壞死和囊性變。

2．2 X線檢查

2．2．1 X線觀察：A和B組術(shù)后4周，截骨端有新骨形成，移植材料紋理模糊；8周，大量新骨形成，移植材料邊界不清，部分髓腔再通；16周，新生皮質(zhì)骨與宿主皮質(zhì)骨自然連接，顯示出正常骨干結(jié)構(gòu)，移植材料分辨不清，髓腔再通。C和D組術(shù)后4周，截骨端有骨痂形成，移植材料紋理清晰；8周，大量新生骨向材料中心生長，移植材料邊界不清；16周，髓腔部分再通，骨缺損存留少量移植材料。

2．2．2 X線評分：移植區(qū)骨形成、骨連接和骨塑形的X線綜合評分，成骨能力依次為：A＞B＞C＞D(P＜0.001，P＜0.05)，結(jié)果見表1。

2．3 組織學觀察

2．3．1 A組：術(shù)后4周，移植材料周圍和內(nèi)部出現(xiàn)大量軟骨細胞和成骨細胞，呈島狀生長的新生骨組織貫穿整個移植材料；8周，新生骨小梁周圍可見大量成骨細胞和破骨細胞，編織骨向板層骨過渡，移植材料逐漸被新生骨取代，骨髓腔出現(xiàn)；16周，移植材料完全被新生骨取代，骨小梁排列整齊，皮質(zhì)骨形成，骨髓腔再通。

2．3．2 B組：術(shù)后4周，移植材料周圍和內(nèi)部出現(xiàn)有軟骨細胞和成骨細胞形成，材料周圍形成大量新生骨；8周，骨小梁周圍出現(xiàn)大量成骨細胞和破骨細胞，移植材料內(nèi)部出現(xiàn)交錯排列的編織骨，骨髓腔出現(xiàn)；16周，新生骨逐漸改建為板層骨，但不完善，骨缺損大部分被修復，仍存留少量移植材料。

2．3．3 C組：術(shù)后4周，移植材料周圍有軟骨細胞和成骨細胞形成，新生骨橋接移植材料和宿主骨；8周，材料周圍出現(xiàn)大量成骨細胞和破骨細胞，新生骨增多并向材料內(nèi)長入；16周，新生骨逐漸取代移植材料，骨髓腔出現(xiàn)，骨改建尚不完善。

2．3．4 D組：術(shù)后4周，移植材料周圍有軟骨細胞和成骨細胞形成，材料周圍形成大量新生骨，新生骨呈明顯的梯度生長，靠近界面端成骨細胞活躍，遠離界面的部位成骨較少；8周，移植材料周圍和內(nèi)部成骨細胞和破骨細胞聚集，材料內(nèi)部出現(xiàn)交錯排列的編織骨，新生骨逐漸取代移植材料；16周，移植材料被新生骨取代，骨髓腔出現(xiàn)。

2．4 組織形態(tài)計量學：移植材料植入體內(nèi)后，隨著時間的推移，新骨形成增多，材料逐漸被降解，采集術(shù)后4周和16周的組織切片，尋找包含移植材料的視野，計算移植材料與材料內(nèi)形成新骨面積百分比，推斷各組成骨能力依次為：A＞B＞C＞D(P＜0.001，P＜0.05)，結(jié)果見表2。

2．5 生物力學測定：術(shù)后16周尺橈骨力學強度比較，A＞B＞C＞D(P＜0.001，P＜0.05)，A組術(shù)后16周尺橈骨力學強度接近正常尺橈骨(P＞O.05)，結(jié)果見表3。

3 討論

種子細胞與支架材料粘附能力的大小與細胞和材料表面的物理和化學性質(zhì)有關。由兩者表面物理性質(zhì)所決定的粘附作用稱為非特異性粘附；如果粘附涉及兩者表面分子之間的相互作用，則稱為特異性粘附，或稱為細胞識別。細胞與材料的粘附不僅取決于細胞的表面性質(zhì)，而且與細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和功能變化密切相關。細胞與材料的非特異性粘附包括靜電斥力、范得瓦耳斯力和立體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性產(chǎn)生的斥力等。細胞與材料的特異性粘附包括鈣粘附蛋白、固有粘附蛋白和Ig超家族粘附分子等。細胞與材料表面粘附的位點稱為粘附斑(adhensionplaques)，這種接觸是一種緊密連接，細胞膜與材料表面的距離在10～15nm。支架材料對細胞的粘附主要通過特異性受體－整合素(integrin)發(fā)揮作用，整合素是由a、β兩個亞基組成的跨膜受體。已知有14個a亞基和8個β亞基，a、β亞基的外區(qū)構(gòu)成受體與特異性配體的結(jié)合，最常見的配體位點是RGD序列。整合素一方面介導細胞與細胞問及細胞與細胞外基質(zhì)的粘附，另一方面具有傳遞信號的功能，聯(lián)系細胞內(nèi)外的代謝活動，對細胞的生長代謝起重要。成骨細胞可分泌I型膠原、骨鈣素、骨結(jié)合素、骨橋蛋白、纖維連接蛋白和生長因子等。這些蛋白中均含有RGD序列，它可被細胞膜表面的整合素受體特異性識別，激活細胞內(nèi)的蛋白酶、蛋白激酶、磷酸酶等信號傳導系統(tǒng)，促使細胞發(fā)生一系列生理和生化反應，鋪展而粘附于材料表面。成骨細胞可表達a1、a2、a3、a4、a5、a6、β1、β3等亞基，a5β1為纖維連接蛋白受體，識別纖維連接蛋白的RGD序列。Shin等證實纖維連接蛋白a5 β1的抗體，以及與纖維連接蛋白競爭a5 β1的短肽RGD可抑制成骨細胞的鈣化，說明纖維連接蛋白與受體a5 β1的相互作用是成骨細胞鈣化成骨的先決條件。

HA－TCP雙相多孔生物陶瓷是骨組織工程應用較為廣泛的化學合成支架材料，但多孔塊狀的HA－TCP存在材料表面的親水性差、表面自由能低、缺乏細胞識別和吸附位點等缺點，易使接種細胞流失，不利于接種細胞的粘附和生長，直接影響組織或器官的組織工程化研究。通過在材料表面固定氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、粘附因子來改善材料表面的親和性，可進一步優(yōu)化組織工程支架材料的粘附性能。我們的研究表明，RGD多肽表面修飾的HA－TCP材料的細胞相容性明顯優(yōu)于單純材料，RGD多肽修飾的材料可粘附較多的MSCs在其表面和孔隙內(nèi)生長、分化和增殖，RGD多肽表面修飾對以HA～TCP為支架材料組織工程骨的修復作用有明顯優(yōu)化作用。Park等的研究發(fā)現(xiàn)，賴氨酸－精氨酸－絲氨酸－精氨酸(Lys－Arg－Ser－Arg)可選擇性增強硫酸乙酰肝素介導的成骨細胞粘附機制，這種粘附作用不同于整合素介導的細胞粘附機制，具有成骨細胞特異性粘附作用。用這種短肽包埋的基質(zhì)材料可顯著提高成骨細胞的粘附，減少內(nèi)皮細胞或成纖維細胞的粘附，是一種良好的骨組織工程支架材料包埋劑。對于多種組織組成復雜器官的組織工程再造，細胞的特異性粘附更具有應用價值。在基質(zhì)材料的不同空間引入不同的細胞粘附序列，引導不同組織細胞在特定位置生長，可望再造多組織復雜器官。