ＲＧＤ多肽表面修飾生物陶瓷修復(fù)骨缺損ＢＭＰ－２的表達(dá)

[商要]目的：了解精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸(Arg－Gly－Asp，RGD)多肽表面修飾的羥基磷灰石－磷酸三鈣(hydroxyapatite－tricalciumphosphate，HA－TCP)修復(fù)節(jié)段性骨缺損局部骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2(bone morphogenet ic protcin－2，BMP－2)的表達(dá)。方法：以骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(marrow stromal cells，MSCs)復(fù)合RGD多肽表面修飾的HA－TCP或單純材料培養(yǎng)制備組織工程骨，選擇60只新西蘭白兔，制作15mm長的橈骨節(jié)段性骨缺損模型，實驗根據(jù)植入不同的材料分為A、B、C和D組，A組：骨缺損區(qū)植入MSCs復(fù)合RGD多肽表面修飾的HA－TCP培養(yǎng)制備的組織工程骨；B組：骨缺損區(qū)植入MSCs復(fù)合HA－TCP培養(yǎng)制備的組織工程骨；C組：骨缺損區(qū)植入RGD多肽表面修飾的HA－TCP；D組：骨缺損區(qū)植入HA－TCP。術(shù)后4周取材，行修復(fù)區(qū)局部BMP－2免疫組化分析。結(jié)果：術(shù)后4周各組骨缺損區(qū)均有新骨生成，修復(fù)區(qū)局部BMP－2表達(dá)水平依次為：A＞B＞C＞D(P＜0.001，P＜0.05)。結(jié)論：RGD多肽表面修飾對以HA－TCP為支架材料組織工程骨的修復(fù)作用有明顯優(yōu)化作用。

[關(guān)鍵詞]組織工程；表面修飾；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；骨形態(tài)發(fā)生蛋白

[中圖分類號]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)06－0737－03

RGD多肽是介導(dǎo)種子細(xì)胞與支架材料粘附的多肽鏈，RGD序列可被固有粘附蛋白受體特異性結(jié)合，在生物材料表面自發(fā)形成一分子層，為與受體介導(dǎo)的種子細(xì)胞提供特異性位點而促進(jìn)細(xì)胞的粘附和分化。本研究旨在應(yīng)用RGD多肽對HA－TCP材料進(jìn)行表面修飾處理，以促進(jìn)MSCs在其表面的粘附和生長，為骨組織工程提供一種支架材料的表面修飾手段。

1 材料和方法

1．1 材料準(zhǔn)備：HA－TCP雙相多孔生物陶瓷(四川大學(xué)生物材料工程研究中心)含60％HA和40％TCP，孔隙率為50％～70％，孔隙直徑為200～500μm。將材料修整為1.5cm×0.5cm×0.5cm大小，蒸餾水加壓反復(fù)沖洗，去離子水超聲清洗2次，每次30min，高壓蒸汽滅菌后備用。將RGD多肽(美國Peptide生物工程公司)溶解于50％乙醇中，濃度為2mmol/L。將材料分別置于帶膠皮塞的離心管中，加入RGD多肽溶液，負(fù)壓抽吸使RGD多肽溶液進(jìn)入材料孔隙內(nèi)，4℃放置24h，吸除溶液，晾干。用pH值為7.4的0.01mol/L PBS漂洗至中性，晾干。

1．2 組織工程骨制備：取健康新西蘭白兔2只，雙側(cè)脛骨結(jié)節(jié)處備皮消毒，無菌條件下用骨穿針穿刺抽取紅骨髓8ml，加入含肝素的DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)，混勻后加入3ml淋巴細(xì)胞分離液(Gibco公司)，1800r/min離心10min，吸除中間層細(xì)胞后再離心，所得細(xì)胞沉淀以1×10⁶/ml密度接種于含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5％CO₂飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞相互融合達(dá)90％生長面積時用0.25％胰蛋白酶(Sigma公司)消化傳代培養(yǎng)。細(xì)胞傳至3代時，移入含1×10^-8mol/L地塞米松、50mg/L維生素C和1×10^-2mol/L β－磷酸甘油鈉的DMEM培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)3天，誘導(dǎo)后的細(xì)胞表型經(jīng)鑒定為成骨樣細(xì)胞。將支架材料用DMEM培養(yǎng)液浸泡1天后棄殘液，每個支架材料以1×10⁶/ml密度接種經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的MSCs，于37℃、5％CO₂飽和濕度培養(yǎng)7天。

1．3 動物模型和實驗分組：選擇3周齡雌性新西蘭白兔60只，體重為2.0～2.5kg。動物全身麻醉后，常規(guī)消毒雙上肢，沿上肢前外側(cè)做縱行切口，長25mm，逐層切開、分離、顯露橈骨，于橈骨中上1/3交界處截骨，去除橈骨和骨膜，制造15mm長的右側(cè)肢體橈骨節(jié)段性骨缺損模型。實驗根據(jù)植入不同的材料分為A、B、C和D組，每組實驗動物10只，其中A組：骨缺損區(qū)植入MSCs復(fù)合RGD多肽表面修飾的HA－TCP培養(yǎng)制備的組織工程骨；B組：骨缺損區(qū)植入MSCs復(fù)合HA－TCP培養(yǎng)制備的組織工程骨；C組：骨缺損區(qū)植入RGD多肽表面修飾的HA－TCP；D組：骨缺損區(qū)植入HA－TCP。

1．4 BMP－2免疫組化檢測：術(shù)后4周標(biāo)本經(jīng)4％多聚甲醛固定1周，用10％的EDTA脫鈣6周，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，制作厚度為5μm的切片，裱片于APES處理的載玻片上。石蠟切片脫蠟至水，3％tt202浸泡，避光20min，蒸餾水沖洗3min×3次。胃蛋白酶消化37℃15min，PBS沖洗5min×2次，1:20羊血清封閉37℃ 30min。甩去多余血清，加一抗37℃1～2h，PBS沖洗5min×2次。1:200二抗37℃40min，PBS沖洗5min×2次。SP(1:200)37℃30min，PBS沖洗5min×2次。DAB顯色，鏡下控制顯色時間，自來水中止顯色。自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。陰性對照以PBS代替一抗。各實驗組隨機(jī)選取6張切片，40×40視野下，每張切片隨機(jī)取10個視野，用醫(yī)用圖像分析儀測量骨缺損修復(fù)區(qū)域內(nèi)BMP－2免疫組化顯色的平均深度(灰度值)。

1．5 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 10.0軟件包對檢查結(jié)果行多個樣本均數(shù)的方差分析和兩兩比較的q檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 BMP－2免疫組化觀察：BMP－2免疫組化檢測結(jié)果顯示，術(shù)后4周新生軟骨及骨痂內(nèi)呈陽性反應(yīng)，陽性物質(zhì)為棕黃色細(xì)顆粒，分布于間充質(zhì)細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞內(nèi)。結(jié)果提示，各實驗組骨缺損修復(fù)的過程中，BMP－2在間充質(zhì)細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中表達(dá)，以PBS代替一抗的陰性對照中細(xì)胞內(nèi)未見陽性信號。A組術(shù)后4周，BMP－2在材料周圍和內(nèi)部出現(xiàn)的成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中高表達(dá)，呈陽性反應(yīng)的新生骨組織貫穿材料。B組術(shù)后4周，BMP－2在材料周圍和內(nèi)部的成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中表達(dá)，陽性反應(yīng)的新生骨組織貫穿移植材料。C組術(shù)后4周，BMP－2在材料周圍的成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中表達(dá)，橋接移植材料和宿主骨的新生骨呈陽性反應(yīng)。D組術(shù)后4周，BMP－2在材料周圍的成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中表達(dá)，材料周圍形成大量新生骨呈陽性反應(yīng)?？拷缑娑顺赎栃苑磻?yīng)的成骨細(xì)胞較多，遠(yuǎn)離界面部位較少(圖1)。

2．2 BMP－2免疫組化結(jié)果分析：術(shù)后4周各組骨缺損區(qū)均有新骨生成，骨缺損修復(fù)區(qū)BMP－2表達(dá)水平依次為：A＞B＞C＞D(P＜0.001，P＜0.05)(表1)。

3 討論

種子細(xì)胞與支架材料粘附能力的大小與細(xì)胞和材料表面的物理和化學(xué)性質(zhì)有關(guān)。由兩者表面物理性質(zhì)所決定的粘附作用稱為非特異性粘附；如果粘附涉及兩者表面分子之間的相互作用，則稱為特異性粘附，或稱為細(xì)胞識別。細(xì)胞與材料的粘附不僅取決于細(xì)胞的表面性質(zhì)，而且與細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和功能變化密切相關(guān)。細(xì)胞與材料的非特異性粘附包括靜電斥力、范得瓦耳斯力和立體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性產(chǎn)生的斥力等。細(xì)胞與材料的特異性粘附包括鈣粘附蛋白、固有粘附蛋白和Ig超家族粘附分子等。細(xì)胞與材料表面粘附的位點稱為粘附斑(adhensionplaques)，這種接觸是～種緊密連接，細(xì)胞膜與材料表面的距離為10～15nm。支架材料對細(xì)胞的粘附主要通過特異性受體一整合素(integrin)發(fā)揮作用，整合素是由a、β兩個亞基組成的跨膜受體。已知有14個a亞基和8個β亞基，a、β亞基的外區(qū)構(gòu)成受體與特異性配體的結(jié)合，最常見的配體位點是ROD序列。整合素一方面介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附，另一方面具有傳遞信號的功能，聯(lián)系細(xì)胞內(nèi)外的代謝活動，對細(xì)胞的生長代謝起重要作用。成骨細(xì)胞可分泌Ⅰ型膠原、骨鈣素、骨結(jié)合素、骨橋蛋白、纖維連接蛋白和生長因子等。這些蛋白中均含有RGD序列，它可被細(xì)胞膜表面的整合素受體特異性識別，激活細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶、蛋白激酶、磷酸酶等信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，促使細(xì)胞發(fā)生一系列生理和生化反應(yīng)，鋪展而粘附于材料表面。成骨細(xì)胞可表達(dá)al、a2、a3、a4、a5、a6、β1、β3等亞基，a5 β1為纖維連接蛋白受體，識別纖維連接蛋白的RGD序列。Shin等證實纖維連接蛋白a5 β1的抗體，以及與纖維連接蛋白競爭a5 β1的短肽ROD可抑制成骨細(xì)胞的鈣化，說明纖維連接蛋白與受體a5 β1的相互作用是成骨細(xì)胞鈣化成骨的先決條件。

骨缺損修復(fù)的關(guān)鍵是細(xì)胞活化和成骨信號釋放，而BMP正是促使間充質(zhì)細(xì)胞向骨細(xì)胞分化最初的信號分子。BMP在骨修復(fù)過程中以自分泌或/和旁分泌的方式發(fā)揮作用。具體的作用方式為：骨修復(fù)早期在創(chuàng)傷等因素刺激下，骨折端局部骨膜中成骨細(xì)胞和周圍間充質(zhì)細(xì)胞增殖，局部BMP高表達(dá)細(xì)胞增多；BMPmRNA轉(zhuǎn)錄功能增強，從而使BMP合成和分泌增加；局部BMP濃度增高又進(jìn)一步促使間充質(zhì)細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并刺激上述3種細(xì)胞增殖，使局部BMP高表達(dá)細(xì)胞進(jìn)一步增多，形成正反饋調(diào)節(jié)，進(jìn)而使局部BMP的濃度在短期內(nèi)迅速增高。骨修復(fù)晚期，隨著成熟骨細(xì)胞增多，成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞減少，BMPmRNA轉(zhuǎn)錄水平下降，BMP合成減少，骨誘導(dǎo)作用減弱，直至達(dá)到維持正常骨代謝的平衡水平。HA－TCP雙相多孔生物陶瓷是骨組織工程應(yīng)用較為廣泛的化學(xué)合成支架材料，但多孔塊狀的HA－TCP存在材料表面的親水性差、表面自由能低、缺乏細(xì)胞識別和吸附位點等缺點，易使接種細(xì)胞流失，不利于接種細(xì)胞的粘附和生長，直接影響組織或器官的組織工程化研究。通過在材料表面固定氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、粘附因子來改善材料表面的親和性，可進(jìn)一步優(yōu)化組織工程支架材料的粘附性能。我們的研究表明，RGD多肽表面修飾的HA－TCP材料的細(xì)胞相容性明顯優(yōu)于單純材料，RGD多肽修飾的材料可黏附較多的MSCs在其表面和孔隙內(nèi)生長、分化和增殖，ROD多肽表面修飾對以HA－TCP為支架材料組織工程骨的修復(fù)作用有明顯優(yōu)化作用。