Ｌ－選擇素單克隆抗體對缺血／再灌注損傷皮瓣的保護作用

[摘要]目的：探討L－選擇素單克隆抗體在缺血／再灌注損傷皮瓣中的作用。方法：在大鼠缺血／再灌注損傷皮瓣模型，分別應(yīng)用L－選擇素單克隆抗體觀察皮瓣成活面積及組織改變。結(jié)果：術(shù)后7天時皮瓣成活面積分別為：假性實驗組為100％；生理鹽水對照組為(18.3±19.6)％；實驗組為(85.63±22.05)％。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：生理鹽水對照組有大量的炎細(xì)胞浸潤、組織腫脹、大部分皮膚組織壞死；L－選擇素單克隆抗體使用實驗組則炎癥癥狀明顯減輕、壞死組織減少，基本與假性實驗組近似。結(jié)論：L－選擇素單克隆抗體可以明顯減輕缺血／再灌注損傷，從而提高缺血／再灌注損傷皮瓣成活面積。

[關(guān)鍵詞]缺血／再灌注損傷；皮瓣；L－選擇素單克隆抗體

[中圖分類號]R622 [文獻標(biāo)識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)05－0593－03

缺血／再灌注損傷(I/R)是對于曾經(jīng)發(fā)生過缺血的組織，重新開放血流時，組織的缺血狀態(tài)不但沒有改善，反而更加加重，此乃缺血／再灌注損傷的主要特征。由于其發(fā)病機制復(fù)雜，尚不十分清楚，因而成為很多學(xué)者關(guān)注的熱點。目前已有資料表明：能量代謝異常、氧自由基產(chǎn)生增加、鈣離子超負(fù)荷等在其損傷中起著重要作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞在缺血／再灌注損傷中發(fā)揮著極為重要的作用，而L－選擇素是調(diào)節(jié)這種作用的關(guān)鍵因素，本實驗使用L－選擇素單克隆抗體，來觀察對缺血／再灌注損傷皮瓣的保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料：動物分組：36只Sprague－Dawley雄性大鼠(日本昭和大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物中心提供)，體重225～250g，分三組，分別為假性實驗組、生理鹽水對照組及實驗組(L－選擇素單克隆抗體使用組)動物，每組各12只。

1.2 模型制備：于大鼠腹部制備35mm×45mm腹壁淺血管島狀皮瓣，用顯微外科用的靜脈夾阻斷股動靜脈(因腹壁淺動靜脈較細(xì)小，鉗夾時損傷較大，故阻斷分出腹壁淺血管前的股血管即可)，9h后去除血管夾開放血流，形成缺血／再灌注損傷皮瓣模型。而假性實驗組只掀起皮瓣而未阻斷血管形成缺血改變。

1.3 抗體使用：再灌注前15min，L－選擇素單克隆抗體0.20mg/kg，稀釋至0.5ml。而對照組則給予生理鹽水O.5ml，均由尾靜脈注入。

1.4 觀察內(nèi)容

1.4.1 皮瓣成活面積：術(shù)后7天觀察的成活面積，硫酸紙描繪出成活與壞死的面積，攝像機拍攝后用圖像采集卡輸入計算機，用自編的程序測算皮瓣成活與壞死的面積占整個皮瓣的百分?jǐn)?shù)，表示為：皮瓣成活率(％)＝[皮瓣成活面積(cm²)／整個皮瓣面積(cm²)]×100。

1.4.2 組織學(xué)觀察：術(shù)后7天切取整個皮瓣，用10％甲醛固定、切片、HE染色，行組織病理學(xué)觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析：所有結(jié)果均用x±s表示，皮瓣成活面積用SAS統(tǒng)計軟件進行t檢驗分析

2 結(jié)果

2.1 皮瓣成活面積：假性實驗組皮瓣無壞死，生理鹽水對照組開放后皮瓣顏色差，而注射了L－選擇素單克隆抗體的皮瓣在血流開放后約1min就能看到皮瓣的顏色有明顯的改善；l周時皮瓣的成活面積：假性實驗組為100％；生理鹽水對照組為(18.3±19.6)％；實驗組為(85.63±22.05)％。兩組間有顯著性差異(P＜0.01)。

2.2 組織學(xué)觀察：假性實驗組組織結(jié)構(gòu)正常、無異常表現(xiàn)；而生理鹽水對照組有大量的炎細(xì)胞浸潤、組織腫脹、部分皮膚組織壞死，失去正常的組織結(jié)構(gòu)；而L－選擇素單克隆抗體使用實驗組則炎癥癥狀明顯減輕、壞死組織減少，基本與假性實驗組近似。

3 討論

缺血／再灌注損傷的主要原因之一，與白細(xì)胞導(dǎo)致的缺血組織的損傷、以及與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附有關(guān)。中性粒細(xì)胞進入缺血組織后被激活，釋放大量毒性氧自由基和蛋白水解酶，致血管通透性增加、組織水腫等一系列病理變化；同時被激活的白細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮，主要在毛細(xì)血管前括約肌和后微靜脈引起損傷，不能通過毛細(xì)胞血管前括約肌的白細(xì)胞發(fā)生堆積、阻塞毛細(xì)血管、加重缺血損傷。

選擇素是由在氨基酸末端的鈣離子依賴的凝血素區(qū)、類上皮生長因子區(qū)、補體調(diào)節(jié)蛋白中發(fā)現(xiàn)的重復(fù)區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿尾區(qū)所組成，分為E－、P－、L－選擇素三個成員。L－選擇素廣泛表達于多種白細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、血液和骨髓中的大部分T、B細(xì)胞及一部分自然殺傷細(xì)胞。研究表明，L－選擇素成簇地存在于靜止的中性粒細(xì)胞微絨毛頂端或膜的皺褶部位，這可能有利于L選擇素與其內(nèi)皮細(xì)胞配體的及早接觸。與另外二種選擇素不同，即使沒有受到刺激，白細(xì)胞表面也有表達，其配體為活性化血管內(nèi)皮細(xì)胞上的糖基化依賴性細(xì)胞粘附分子(GlyCAM－1)。

實驗證明，L－選擇素在白細(xì)胞的移出與移行中發(fā)揮重要作用，主要是通過其與其配體的結(jié)合實現(xiàn)的。L－選擇素是白細(xì)胞“滾動受體”，白細(xì)胞滾動是白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞牢固粘附的先決條件。在感染及炎癥反應(yīng)過程中，炎癥介質(zhì)首先活化血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其表達粘附分子相應(yīng)的配體，血流中的白細(xì)胞通過表面表達的L－選擇素與其相應(yīng)的內(nèi)皮細(xì)胞配體結(jié)合，使隨機運動的白細(xì)胞在切應(yīng)力的作用下沿炎癥附近血管(特別是毛細(xì)血管后靜脈)內(nèi)皮緩慢滾動，而后隨著L－選擇素介導(dǎo)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)的白細(xì)胞激活和β2整合素的粘附加強作用，使白細(xì)胞活化、變形，穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞到血管外，移行到炎癥區(qū)域釋放炎癥介質(zhì)介導(dǎo)炎性反應(yīng)。

Von Andrian等研究發(fā)現(xiàn)，L－選擇素單抗DREG56可明顯抑制PMN滾動，而β2－整合素或免疫球蛋白超家庭成員的單抗則只阻斷PMN的牢固粘附，不影響滾動；不表達L－選擇素的小鼠前B淋巴細(xì)胞瘤株L122幾乎不能在炎性靜脈內(nèi)皮上滾動，但轉(zhuǎn)染人L－選擇素后，其滾動能力明顯增強，且與L－選擇素表達的密度呈正相關(guān)；抑制L－選擇素功能，便抑制了滾動，也就抑制了白細(xì)胞的滲出。因此，阻斷L－選擇素與其內(nèi)皮配體的作用己成為抗炎研究的新途徑。Jutila等全身應(yīng)用L－選擇素單抗(MEL214)使小鼠炎性腹腔中PMN的滲出減少了70％，引起白細(xì)胞的積聚減少。Watson等在巰基醋酸性腹膜炎模型上用可溶性L－選擇素／IgG嵌合分子也抑制了75％的PMN滲出。

特異性選擇素分子的單克隆抗體在缺血／再灌注損傷(I/R)中的研究最為廣泛。在貓心肌缺血再灌注損傷模型中應(yīng)用抗L－選擇素抗體，發(fā)現(xiàn)能顯著減少再灌注后壞死心肌面積，穩(wěn)定EC功能，并防止PMN的過度激活。在小鼠模型中，L－選擇素單抗可以預(yù)防機械正壓通氣引起的肺損傷。在哮喘和慢性阻塞性肺病等慢性炎癥性疾病的發(fā)病早期，選擇素介導(dǎo)的白細(xì)胞－內(nèi)皮細(xì)胞的粘附是重要的病理過程，采用L－選擇素的單抗來對抗這一病理過程，能達到治療效果。因此，L－選擇素單抗有可能用于預(yù)防和治療炎性疾病。近來的研究證明，使用L－選擇素抗體進行治療，不會造成白細(xì)胞減少癥，也不會增加感染或敗血癥等并發(fā)癥的發(fā)生率，因此其使用是安全可靠的。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，阻斷腹壁淺動靜脈島狀皮瓣血流9h再灌注后可誘導(dǎo)出缺血／再灌注損傷，一周時皮瓣部分或全部壞死，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)組織腫脹、炎細(xì)胞浸潤。而使用L－選擇素單克隆抗體后，皮瓣成活率提高，組織腫脹減輕、壞死組織減少、炎細(xì)胞浸潤降低。進一步證實L－選擇素在白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附中的作用，使用相應(yīng)的特異性抗體可以減輕缺血／再灌注損傷程度。在皮瓣缺血早期阻斷L－選擇素的表達可能有助于減輕缺血性損傷。為臨床防治撕脫性皮瓣原位縫合后繼發(fā)壞死提供一個新途徑。

編輯 張惠娟

基金項目：陜西省攻關(guān)計劃項目資助 [編號：2005K12－G5(13)]