聚己內(nèi)酯電紡纖維的制備及生物相容性研究

[摘要]目的：評(píng)價(jià)聚己內(nèi)酯電紡纖維的生物相容性，對(duì)其在組織工程支架方面的應(yīng)用前景進(jìn)行探討。方法：采用靜電紡絲法制備聚己內(nèi)酯納米纖維，場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察其表面形貌及內(nèi)部結(jié)構(gòu)，通過溶血實(shí)驗(yàn)、粘膜刺激實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(MTT法)初步評(píng)價(jià)其生物相容性。結(jié)果：場(chǎng)發(fā)射掃描顯微鏡觀察顯示所獲得纖維呈無紡多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，直徑范圍為153～612nm，纖維形態(tài)光滑均一。溶血實(shí)驗(yàn)顯示材料無溶血現(xiàn)象，不影響凝血功能；MTT試驗(yàn)顯示L929細(xì)胞在材料浸提液種中生長(zhǎng)良好，細(xì)胞毒性為0級(jí)；粘膜刺激實(shí)驗(yàn)未見異常組織學(xué)反應(yīng)。結(jié)論：聚己內(nèi)酯電紡纖維具有良好的生物相容性，對(duì)其在組織工程支架材料領(lǐng)域的應(yīng)用有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

[關(guān)鍵詞]電紡技術(shù)；聚己內(nèi)酯；生物相容性

[中圖分類號(hào)]R783.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008－6455(2007)05－0603－04

聚己內(nèi)酯(Polycaprolactone，PCL)是由ε－己內(nèi)酯開環(huán)聚合所得到的線性脂肪族聚酯，具有良好的熱穩(wěn)定性、生物降解性、力學(xué)性能、藥物通過性和生物相容性，其降解產(chǎn)物對(duì)人體無毒。目前該材料已經(jīng)獲得美國(guó)FDA的批準(zhǔn)，廣泛應(yīng)用于骨折固定材料、手術(shù)縫線、醫(yī)用敷料、藥物控釋材料和組織工程支架材料等領(lǐng)域。電紡技術(shù)是一種利用聚合物溶液或熔體存強(qiáng)電場(chǎng)作用下形成噴射流獲取超細(xì)長(zhǎng)纖維的新型工藝。目前已有近百種聚合物成功地通過這一技術(shù)獲取了超細(xì)纖維并被陸續(xù)心用于膜技術(shù)、增強(qiáng)材料、紡織品、光學(xué)傳感器、醫(yī)藥釋放體系和組織工程等諸多領(lǐng)域，引起了人們的廣泛關(guān)注。本研究采用電紡技術(shù)制備聚己內(nèi)酯納米纖維，并對(duì)其形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物相容性進(jìn)行了研究，初步論證了其作為組織工程支架材料的潛力。

1 材料和方法

1.1 材料：聚己內(nèi)酯(PCL，美國(guó)Sigma公司，Mn＝80000)，二甲基甲酰胺(DMF，西安化學(xué)試劑公司，AR)，氯仿(DMF，西安化學(xué)試劑公司，AR)，BGG40/2高壓直流電源(北京機(jī)電研究所0－30KV)，JSM－6700F型掃描電鏡(日本JEOL公司)，BX41型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，MPS－UV260型紫外分光光度儀(日本島津公司)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Bio－Tek公司)，DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)GibcoBRL公司)，胎牛血清(浙江金華清湖犢牛利用研究所)，胰蛋白酶(上海浦東生化試劑廠)，MTT(美國(guó)Sigma公司)，Image－Pro Plus5．02圖像分析軟件(美國(guó)Media Cybernetics公司)。6月齡新兩蘭大耳白兔，1只，雄性，體重1.5kg(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；昆明成年小白鼠，16只，體重18～22g(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；60～70天金黃色地鼠，10只，體重140～160g(西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。小鼠結(jié)締組織成纖維細(xì)胞L－929細(xì)胞株(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔生物實(shí)驗(yàn)室)。

1.2 方法

1.2.1 PCL電紡纖維的制備與表面形貌表征：以氯仿／DMF(體積比2:1)的混合溶液為溶劑，配制濃度為8％的PCL溶液。將紡絲液加入一個(gè)安裝有8號(hào)不銹鋼注射針頭的自制玻璃加樣管，針頭與的正極相連，針頭亦即噴絲口下方安裝一個(gè)接地的銅板，上覆鋁箔作為纖維的接收屏。在噴絲口和接受屏之間形成一個(gè)高壓電場(chǎng)，從噴絲口流出的紡絲液在電場(chǎng)力的作用下以高速不規(guī)則的螺旋軌跡運(yùn)行，并被拉伸成為超細(xì)纖維沉積到接受屏上，在這個(gè)過程中溶劑揮發(fā)，紡絲細(xì)流固化。在外加電壓10kV，接收距離12cm，溶液流量3ml/h的條件下最終的獲得直徑為亞微米級(jí)甚至納米級(jí)的縱橫交錯(cuò)的無紡纖維氈，置丁干燥器中干燥保存。纖維樣品經(jīng)真空蒸鍍儀噴金，導(dǎo)電膠固定，以冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡JSM－6700F觀測(cè)纖維表面的形貌表征，電子加速率為5kV。采用Image－Pro Plus5.02測(cè)定電鏡照片中的纖維直徑。

1.2.2 溶血試驗(yàn)：將PCL電紡纖維切割為50mm×3mm條狀放入無菌試管，完全浸沒于20ml DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃培養(yǎng)箱中72h，獲得浸提液。心臟穿刺抽取新西蘭大耳白兔血10ml，立即加入20g/L的草酸鉀0.5ml，抗凝，取8ml兔血加入10ml生理鹽水中稀釋備用。實(shí)驗(yàn)分為3組，每組平行3份試樣。陰性對(duì)照組：0.2ml稀釋兔血加入10ml生理鹽水；陽性對(duì)照組：0.2ml稀釋兔血加入10ml雙蒸水；PCL電紡纖維組：0.2ml稀釋兔血加入10ml浸提液。37℃水浴60min，離心，取上清。在MPS－UV260型紫外分光光度儀上測(cè)A540nm值。溶血率計(jì)算公式為：溶血率(％)＝(實(shí)驗(yàn)組光吸收度－陰性對(duì)照光吸收度)／(陽性對(duì)照光吸收度－陰性對(duì)照光吸收度)×100％。溶血率大于5％，則預(yù)示陽性結(jié)果。

1.2.3 短期全身毒性試驗(yàn)：將PCL電紡纖維研磨粉碎后高溫高壓消毒，無菌條件下配制成100g/L生理鹽水混懸液，使用前37℃下保持1h。選用昆明小鼠隨機(jī)分配為PCL電紡纖維實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組，每組各8只。實(shí)驗(yàn)組采用胃內(nèi)針給藥，1g/kg。對(duì)照組給以等量的生理鹽水。連續(xù)給藥7天，停藥后繼續(xù)觀察7天。每日檢查動(dòng)物的臨床中毒體征，并予以記錄。停藥7天后，采用頸椎脫臼法將動(dòng)物處死。取動(dòng)物心、肝和腎，置于多聚甲醛固定液中，常規(guī)HE染色后BX41型光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.4 口腔粘膜刺激試驗(yàn)：金黃色地鼠腹腔注射10g/L的戊巴比妥鈉麻醉動(dòng)物，消毒，鋪巾。用醫(yī)用縫合線將與試樣穿頰粘膜縫合固定到頰囊粘膜上，每只固定經(jīng)消毒備用的2個(gè)試樣，左側(cè)為實(shí)驗(yàn)組PCL電紡纖維試件，右側(cè)為作為陰性對(duì)照的牙膠圓片。術(shù)后每日觀察粘膜組織反應(yīng)及試樣在位情況，即試片周圍有無充血、糜爛、腫脹等。術(shù)后14天處死動(dòng)物，取與材料接觸的頰囊部全層組織，HE染色，BX41型光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.5 細(xì)胞毒性試驗(yàn)：按照CB/T16886.5－2003《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)》體外細(xì)胞學(xué)毒性試驗(yàn)的試驗(yàn)方法進(jìn)行。選擇L－929細(xì)胞為受試細(xì)胞株，實(shí)驗(yàn)前用PBS新鮮配制MTT溶液，微孔濾器過濾除菌，4℃保存。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞系，常規(guī)胰酶消化后制備成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁶L，接種細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板(100ul／孔，n＝5)置于5ml/LCO₂，37℃培養(yǎng)箱中，在飽和濕度條件下培養(yǎng)48h。然后將浸提液加入各實(shí)驗(yàn)組(150ul／孔)。陰性對(duì)照為DMEM培養(yǎng)基，陽性對(duì)照為1ml/L苯酚，常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)12h，24h和48h后酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定A_570nm，值，并計(jì)算出各組的A_570nm均值及細(xì)胞增殖百分率(P％)。P％＝各濃度組A_570nm均值／陰性對(duì)照組A_570nm均值×100％。按照CB/T16886.5－2003標(biāo)準(zhǔn)，P％可分為6級(jí)：＞100％為0級(jí)；75％～100％為I級(jí)；50％～74％為II級(jí)；30％～49％為III級(jí)；15％～29％為Ⅳ級(jí)；0～14％為v級(jí)。只有細(xì)胞毒性為I級(jí)或0級(jí)的牛物材料才能用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 PCL電紡纖維形貌掃描電鏡觀察：5000倍掃描電鏡下可見PCL電紡纖維呈相互交聯(lián)的多孔網(wǎng)狀無紡結(jié)構(gòu)，纖維交錯(cuò)相疊、光滑均 ，沒有明顯的珠狀膨大結(jié)構(gòu)或者纖維粘并現(xiàn)象。根據(jù)所采集的圖像用Image－Pro Plus軟件測(cè)量出電紡纖維的直徑變化范圍為153～612nm，平均值為285nm。

2.2 溶血試驗(yàn)結(jié)果：各測(cè)試組光吸收度測(cè)定值見表1，以每組測(cè)定值的平均數(shù)計(jì)算溶血程度，溶血程度為1.40％，小于5％，即PCL電紡纖維無溶血反應(yīng)。

2.3 短期全身毒性試驗(yàn)：所有小鼠胃內(nèi)灌入混懸液后動(dòng)物在2周內(nèi)般情況良好，活動(dòng)、進(jìn)食情況正常，體質(zhì)量無下降，無步態(tài)不穩(wěn)、驚厥、癱瘓、呼吸困難等不良反應(yīng)，無死亡。各組小鼠心、腎、肝的組織切片均未見細(xì)胞變性、壞死等病理變化，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無差異。

2.4 口腔粘膜刺激試驗(yàn)：各組金黃色地鼠進(jìn)食、飲水正常，毛發(fā)光澤度佳，反應(yīng)靈活。肉眼觀察，材料接觸處口腔粘膜表面未見明顯充血、腫脹、糜爛或潰瘍。組織切片觀察，陰性對(duì)照組，頰粘膜粘膜上皮排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常，較少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，粘膜下結(jié)締組織中有少量血管擴(kuò)張和充血。PCL電紡纖維實(shí)驗(yàn)組頰粘膜各層細(xì)胞排列整齊，較少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，粘膜下結(jié)締組織中有少量血管擴(kuò)張和充血。實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組的組織學(xué)觀察結(jié)果相似，均未見明顯異常反應(yīng)。細(xì)胞毒性分級(jí)見表2。倒置相差顯微鏡觀察陽性對(duì)照組，正常細(xì)胞形態(tài)消失，核固縮或溶解，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)良好，細(xì)胞折光性強(qiáng)，與陰性對(duì)照組相似，并可見多個(gè)分裂相細(xì)胞，表明細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛。細(xì)胞毒性測(cè)試為0級(jí)，說明PCL電紡纖維對(duì)L－929細(xì)胞無抑制作用。

3 討論

電紡技術(shù)的原理為：強(qiáng)電場(chǎng)作用下聚合物溶液或熔體克服表面張力在紡絲噴頭毛細(xì)管尖端形成射流，當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度足夠高時(shí)，在靜電斥力、Coulomb和表面張力的共同作用下，聚合物射流沿不穩(wěn)定的螺旋軌跡彎曲運(yùn)動(dòng)，在幾十毫秒內(nèi)被牽伸千萬倍，隨溶劑揮發(fā)，射流固化形成亞微米至納米級(jí)超細(xì)纖維。利用電紡技術(shù)制備組織工程支架材料的優(yōu)勢(shì)在于：能夠制備出比表面積大、孔徑小、孔隙率高、纖維均一生好，直徑與細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)膠原纖維相近的連續(xù)超細(xì)纖維(50～500nm)，從而最大程度的模仿細(xì)胞外基質(zhì)天然結(jié)構(gòu)；制備方法簡(jiǎn)單快捷，支架材料可以是單一的聚合物，也可以是多種聚合物的復(fù)合體，并可以在支架中引人無機(jī)粒子(如羥基磷灰石等)、生長(zhǎng)因子甚至活細(xì)胞等：通過選擇適當(dāng)?shù)牟牧虾图庸?shù)，能夠調(diào)控所制備支架材料的孔隙率、厚度、三維結(jié)構(gòu)、降解率和力學(xué)性能：利用同軸電紡技術(shù)能夠?qū)⑸锘钚苑肿蛹尤氲骄酆衔镏Ъ苤?，活性因子的有效釋放提供了理想平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)中獲得的PCL電紡纖維大體外觀為白色膜狀結(jié)構(gòu)，SEM觀察顯示纖維外觀光滑，直徑均一，纖維直徑153～612nm，為納米級(jí)多孔無紡纖維，其相瓦交錯(cuò)的多孔結(jié)構(gòu)與天然細(xì)胞外基質(zhì)的膠原纖維結(jié)構(gòu)近似，這種結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)，在組織工程支架和醫(yī)用敷料等方面有一定的應(yīng)用前景。

種子細(xì)胞與支架材料是組織工程的兩個(gè)核心因素。組織再牛的生物學(xué)特性要求支架材料不但要具備促進(jìn)細(xì)胞粘附、分化和表型表達(dá)的三維結(jié)構(gòu)，而且還要為組織再生提供一定的力學(xué)支撐，植入體內(nèi)后具備良好的免疫原性，不發(fā)生急、慢性免疫排斥反應(yīng)及近、遠(yuǎn)期毒性反應(yīng)等。而良好的生物相容性，是理想支架材料的首要條件。生物相容性是指生命體組織對(duì)非活性材料產(chǎn)生反應(yīng)的性能。一般是指材料與宿主之間的相容性，包括組織相容性和血液相容性。對(duì)生物材料相容性評(píng)價(jià)方法較多，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織公布的醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)指南(ISO標(biāo)準(zhǔn)，1997)中基本評(píng)價(jià)的生物學(xué)試驗(yàn)包括細(xì)胞毒性、致敏、刺激或皮內(nèi)反應(yīng)、全身急性毒性、亞慢性亞急性毒性、遺傳毒性、植入、血液相容性等。本課題選擇了溶血實(shí)驗(yàn)、短期全身毒性實(shí)驗(yàn)、口腔粘膜刺激實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性試驗(yàn)這四種較為常見的生物學(xué)試驗(yàn)方法。試驗(yàn)結(jié)果顯示PCL電紡纖維不引起溶血反應(yīng)，不干擾細(xì)胞功能，對(duì)口腔粘膜顯示無刺激性，無短期毒性作用，具有可靠的生物安全性，是一種具有良好生物相容性的材料，具有進(jìn)一步應(yīng)用于組織工程支架材料研究的前景。

編輯 張惠娟

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào)：30500118)，陜西省自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào)：2006E₁24)

通訊作者：張少鋒，男，敦授，主任醫(yī)師，E－mail：sfzhang@fmmu.edu.cn