新型多孔雙相磷酸鈣支架與兔骨髓間充質(zhì)干細胞相容性的體外實驗研究

[摘要]目的：研究新型多孔雙相磷酸鈣支架與兔骨髓間充質(zhì)干細胞的體外相容性。方法：體外分離、擴增兔骨髓間充質(zhì)干細胞。取傳二代細胞，按照經(jīng)典組織工程構(gòu)建方法，分別接種雙相磷酸鈣(對照組)和雙相磷酸鈣復(fù)合納米羥基磷灰石(實驗組)支架。單純細胞培養(yǎng)為空白對照組。體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14天。倒置相差顯微鏡、掃描電鏡觀察細胞生長情況；MTT法檢測細胞增殖功能；堿性磷酸酶(ALP)檢測細胞成骨分化功能。結(jié)果：細胞在新型支架上吸附、生長良好。各組MTT及ALP值隨培養(yǎng)時間延長而增大。培養(yǎng)各時段實驗組均高于其他兩組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論：新型BCP支架與兔BMSc在體外具有良好的相容性，二者具有體外構(gòu)建工程骨的潛力。

[關(guān)鍵詞]骨組織工程；雙相磷酸鈣；納米羥基磷灰石；骨髓間充質(zhì)干細胞：細胞相容性

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)05－0588－05

外傷、感染、腫瘤切除導(dǎo)致骨質(zhì)缺損在臨床很常見。雙相磷酸鈣(biphasic calcium phosphate，BCP)作為骨替代、填充材料已被廣泛研究并投入臨床應(yīng)用。隨著組織工程概念的引入，BCP在組織工程支架領(lǐng)域的應(yīng)用正逐漸受到重視。人工合成的納米羥基磷灰石(nanophas hydroxyapatite，n-HA)與人體骨組織針狀納米磷灰石結(jié)構(gòu)相似，從仿生學(xué)角度來說，有更好的相容性。我們以多孔BCP作為基體，將n-HA復(fù)合在支架孔隙表面，結(jié)合兩種材料的優(yōu)點，獲得新的多孔支架。通過接種兔骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)體外共培養(yǎng)，初步探討新支架材料與兔骨髓間充質(zhì)干細胞的相容性，為將來結(jié)合體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)對該支架材料進行客觀評價提供依據(jù)。

1 材料和方法

2.1 主要實驗材料、試劑及設(shè)備：BCP＋n－HA及HCP支架(東南大學(xué)材料工程學(xué)院提供。每塊材料均制作成直徑5mm，厚1.5mm的多孔圓片。BCP與BCP＋n－HA支架的平均孔徑分別為500 um和450um；平均孔隙率分別為85.9％和81.9％)；DMEM－LG培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青)；人淋巴細胞分離液(上海華精)；胰蛋白酶(南京大治)；B－甘油磷酸鈉(南京創(chuàng)瑞)；地塞米松；維生素C；MTT試劑(南京創(chuàng)瑞)；二甲基亞砜(南京創(chuàng)瑞)；TritonX－100(南京創(chuàng)瑞)；考馬斯亮藍檢測試劑盒(南京建成)；堿性磷酸酶檢測試劑盒(南京建成)；酶標儀(BioRAD－680)；培養(yǎng)箱(HEAL FORCE HF 212 uv)；離心機(Anke TDL－40B)；相差倒置顯微鏡(OLYMPUSCKX41)；掃描電鏡(EDAX)。

2.2 實驗方法

2.2.1 兔BMSCs的分離與培養(yǎng)：取成年家兔一只，雌雄不限，重約2.5kg(東南大學(xué)實驗動物中心提供)。戊巴比妥鈉30mg／kg靜脈麻醉。髂后上棘穿刺抽取深紅色稠厚骨髓4ml于肝素化針管。PBS倍比稀釋后按體積比1：1小心加至人淋巴細胞分離液(1.073g/ml)上。2500r/min離心30min后收集管中段的白膜帶單個核細胞。PBS漂洗離心5min，1200r/min，共2次。棄上清液，用含10％胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM－LG重懸細胞沉淀。血細胞計數(shù)板計數(shù)后，以2×10⁵/cm²原代接種培養(yǎng)瓶。37℃，5％CO₂，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后首次全量換液，以后每2～3滅根據(jù)培養(yǎng)基的顏色全量換液。約12天，瓶底貼壁細胞匯合約80％時，0.25％胰蛋白酶溶液消化。收集并離心漂洗細胞后，以6000/cm²傳代接種。培養(yǎng)條件相同，每2天換液1次，待瓶底細胞80％匯合時繼續(xù)傳代。取對數(shù)生長期的傳二代細胞備用。

2.2.2 實驗分組及支架材料的準備：雙相磷酸鈣復(fù)合納米羥基磷灰石(BCP＋n－HA)支架為實驗組，BCP支架為對照組，每組各46塊支架材料。單純接種細胞的培養(yǎng)孔為空白對照組。兩組支架材料分別以PBS浸泡沖洗2次，每次15min。通風(fēng)吹干后，∞Co照射消毒。將各組材料用含10％FBS的DMEM－LG浸泡2h后吸去材料內(nèi)的大部分培養(yǎng)液，再將其放入37℃，5％CO₂，飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置5h。

2.2.3 細胞與支架材料的體外共培養(yǎng)：取準備好的傳二代細胞，用含10％FBS的DMEM－LG將其濃度調(diào)整為1.25×10⁶/ml。24孔板每孔放置1塊材料。每塊材料表面滴加細胞懸液15ul后將其放入37℃，5％CO₂，飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置。1.5h后取出各板，以同樣的方法再次接種上述細胞懸液15ul。培養(yǎng)箱中靜置1.5h后，向每孔滴加含10％FBS的DMEM－LG，調(diào)整各培養(yǎng)孔液體總體積至1ml。相同條件培養(yǎng)24h后取出，吸棄各孔培養(yǎng)液，更換為等量的成骨誘導(dǎo)液(含有0.1bmol/L地塞米松；50ug/ml維生素C；10mmol/L β－甘油磷酸鈉；10％FBS的DMEM－LG)。相同條件繼續(xù)培養(yǎng)，每日每孔滴加維生素C5ug，每2天更換1次成骨誘導(dǎo)液。

2.2.4 形態(tài)學(xué)觀察：定期相差倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，攝片。第2、7、14天，分別取出材料，PBS沖洗，2.5％戊二醛固定，乙醇梯度脫水，臨界點干燥，噴金，掃描電鏡觀察并攝片。

2.2.5 四唑鹽比色試驗(MTT法)檢測細胞增殖功能：復(fù)合培養(yǎng)第2、6、10、14天，各取1塊培養(yǎng)板，每孔加入0.5％MTT溶液i00ul，孵育4h，PBS洗滌3遍。每孔加入二甲基業(yè)砜(DMSO)1ml。振蕩lOmin后，吸取各孔液體150ul于96孔培養(yǎng)板，酶標儀于490nm波長下檢測各孔光密度值。

2.2.6 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)含量測定：復(fù)合培養(yǎng)第2、6、10、14天，各取1塊培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌3遍。每孔滴加0.5％TritonX－100lml，室溫下振蕩20min。吸取各孔液體按照ALP檢測試劑盒說明書檢測相應(yīng)指標。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法：結(jié)果以(x±s)表示，實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSSll.5軟件包進行單因素方差分析，P＜O.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 支架材料上細胞的光鏡下觀察：細胞接種后第l天，兩組支架孔隙表面均較光滑平整，并可見少量散在圓形透亮顆粒。從第4天開始實驗組支架孔隙表面開始出現(xiàn)膜狀透亮物覆蓋，其透光度不均，隨培養(yǎng)時間的延長逐漸增多、增厚。對照組第8天后才逐漸出現(xiàn)上述變化。

3.2 支架材料上細胞的電鏡下觀察：細胞接種后第2天，支架孔隙表面細胞吸附。細胞多為扁圓形及不規(guī)則形。表面光滑，單層離散分布。材料表面暴露較多。實驗組吸附細胞較對照組均勻，密集，第7天，細胞逐漸伸展，形態(tài)變?yōu)槎嘟切?。細胞表面高密度圓形顆粒增多。細胞和材料表面結(jié)合更加緊密，并逐漸由原位向周圍增殖，爬行。細胞間接觸增多。支架孔隙結(jié)構(gòu)存在，材料暴露面減小，實驗組更為明顯，第14天，實驗組細胞形態(tài)多為長扁梭形，胞質(zhì)而積較大，疊層覆蓋材料面。支架孔隙結(jié)構(gòu)存在，幾乎無材料面暴露，大量索條狀膠原和細胞膠著分布，表面可見較多大小不等的球形高密度顆粒，經(jīng)能譜分析為鈣鹽結(jié)晶。而對照組細胞形態(tài)較實驗組短小，分布不均，支架部分區(qū)域仍然裸露。但細胞覆蓋區(qū)域也有膠原及鈣鹽結(jié)晶膠著分布。

3.3 MTT檢測結(jié)果：如表1所示，各組MTT光密度值隨培養(yǎng)時間的延長而增大。培養(yǎng)各時段，實驗組均高于其它兩組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。對照組在第6天和第10天均低于空白對照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，而第2天和第14天，差別無統(tǒng)計學(xué)意義。

3.4 ALP檢測結(jié)果：如表2所示，各組ALP檢測值隨培養(yǎng)時間的延長逐漸增大。各時間段，實驗組均高于其它兩組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。對照組在第2天和第6天低于空白對照組，但第10天和14天高于空白對照組，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 討論

優(yōu)良的骨組織工程支架應(yīng)具備：良好的生物相容性；適宜的生物降解性；三維立體多孔結(jié)構(gòu)；可塑性和有一定的機械強度；良好骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性。完全符合上述條件的材料尚未開發(fā)出。而生物材料的表面特性如顆粒直徑、顆粒之間的孔徑是影響成骨細胞存活，增殖等生理功能的主要決定因素。本實驗采用的支架是在BCP支架孔隙表面復(fù)合納米羥基磷灰石涂層，綜合了兩種材料的特點。新合成支架的平均孔徑、孔隙率、孔隙問的相互貫通均可滿足支架內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的交換及細胞的長入，符合既往研究成果。

目前用于構(gòu)建工程骨的種子細胞主要有骨膜來源成骨細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞。BMSCs的巨大優(yōu)勢在于；易于獲取；體外可短期大量擴增；其自身部分亞群具有較強的成骨傾向，部分亞群在適當?shù)恼T導(dǎo)條件下更易向成骨分化；大量獲取時不易造成供區(qū)部位的創(chuàng)傷。

相對于傳統(tǒng)的以體內(nèi)植入實驗，體外實驗快速，方法標準化，條件可控，因此具有可操作性和可比性。這使得在過去的二十年中，體外實驗被廣泛的應(yīng)用于材料的生物相容性評價。本次實驗按照經(jīng)典工程組織體外構(gòu)建的程序，采用二次沉淀法接種種子細胞。此外細胞接種密度會影響其增殖與分化，Haynesworth等認為細胞初始接種密度在(0.7～20)×10⁶／ml較為合適，本次實驗根據(jù)自身特點選擇接種密度為1.25×10⁶/ml。

掃描電鏡結(jié)果顯示培養(yǎng)早期細胞在兩組材料孔隙內(nèi)外表面均能較好吸附，實驗組吸附細胞密度更大，更均勻?？紤]為納米羥基磷灰石比表面積大導(dǎo)致更多培養(yǎng)液大分子蛋白質(zhì)吸附及早期電離產(chǎn)生的離子界面均有利于細胞的吸附及均勻分布。Webster的實驗結(jié)果與本實驗相符。隨著培養(yǎng)時間延長，實驗組細胞較對照組更加伸展，胞質(zhì)更加均勻覆蓋材料，且細胞外膠原及鈣鹽沉積也更加密集。光鏡下所見也與之符合。說明在成骨誘導(dǎo)環(huán)境中，BMSCs逐漸向目的細胞一成骨細胞分化，并體現(xiàn)其分泌骨基質(zhì)，促進成骨的功能。在一定范圍內(nèi)，密集而均勻的早期細胞吸附有利于細胞間的相互作用，使得細胞群體的增殖、分化功能加強。低結(jié)晶度納米羥基磷灰石的早期降解使得材料表面更早形成的類骨磷灰石可促進膠原和礦物的沉積。

骨組織工程支架材料應(yīng)該支持BMSC在其中快速增殖及成骨分化。MTT法檢測細胞的增殖活性已被廣泛應(yīng)用。ALP是骨組織形成、代謝、再生過程中的重要礦化酶，同時又是細胞分化成熟和具有成骨能力的重要標志酶，是BMSCs向骨化亞群細胞分化和向骨組織轉(zhuǎn)化的前提。實驗結(jié)果顯示實驗組細胞的增殖及分化功能在各時段均高于對照組和空白對照組：而對照組在早期均低于空白對照組，中期后逐漸恢復(fù)，至培養(yǎng)末期增殖功能與空白對照組無顯著差別，分化功能高于窄白對照組。此現(xiàn)象說明兩組材料對BMSCs無明顯細胞毒性作用，而且可以促進BMSCs向成骨細胞分化。相對于空白對照組，對照組細胞需要較長的適應(yīng)期才能恢復(fù)細胞的功能，至培養(yǎng)晚期，其增殖與分化功能才達到甚至超過單純培養(yǎng)細胞的水平。原因可能是材料早期降解，使細胞周圍環(huán)境PH值產(chǎn)生較大的波動，細胞的功能受到暫時抑制。隨著材料降解趨于平穩(wěn)，環(huán)境變化幅度減小，加上定期更換培養(yǎng)液，使得細胞的功能逐漸恢復(fù)。然而實驗組材料沒有出現(xiàn)早期細胞功能抑制，且在培養(yǎng)各時段其功能均高于其它兩組，主要原因可能是納米羥基磷灰石快速降解導(dǎo)致細胞周圍鈣、磷離子濃度升高特別是鈣離子濃度的升高通過某種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制使早期細胞功能得以維持，更有利于細胞的增殖與分化。同時納米層降解后在孔隙表面形成的類骨磷灰石層也有利于吸附細胞的增殖與分化。這些因素的作用可能抵消了微環(huán)境PH值改變對細胞早期功能的抑制。各時期掃描電鏡所見也驗證了功能實驗的結(jié)果。

BCP復(fù)合納米羥基磷灰石支架與兔BMSCs在體外具有良好的相容性。接種于該支架內(nèi)的BMSCs較基體支架具有更高的增殖及分化能力。該支架值得進一步進行動物體內(nèi)植入實驗。

編輯 張惠娟

通訊作者：章慶國，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院耳再造中心二科主任，北京100096；主要研究方向：整形外科臨床及相關(guān)基礎(chǔ)研究：E－mail：plasticl35@126.com