丹參納米銀復(fù)合材料的生物安全性研究

[摘要]目的：研究丹參納米銀復(fù)合材料(salvia M．1tiorrhiza/Naflo-silver composite)的生物安全性。方法：通過(guò)無(wú)菌試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)、皮膚刺激試驗(yàn)、皮內(nèi)刺激試驗(yàn)、全身急性毒性試驗(yàn)及SD大鼠對(duì)該材料中銀的吸收、代謝情況對(duì)自制的丹參納米銀復(fù)合材料進(jìn)行生物安全性評(píng)價(jià)。結(jié)果：丹參納米銀復(fù)合材料無(wú)菌、無(wú)熱原、無(wú)刺激、無(wú)明顯急性毒性，且機(jī)體對(duì)納米銀的吸收比對(duì)經(jīng)典創(chuàng)面抗感染藥磺胺嘧啶銀少。結(jié)論：丹參納米銀復(fù)合材料作為創(chuàng)面修復(fù)材料具有良好的生物安全性。

[關(guān)鍵詞]丹參；納米銀；磺胺嘧啶銀；無(wú)菌；熱原；刺激作用；全身急性毒性

[中圖分類號(hào)]R644 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008－6455(2007)05－0596－04

在金屬納米材料中，銀以其獨(dú)特的抗菌性能而在醫(yī)學(xué)界得到廣泛應(yīng)用，特別是在大量抗生素耐藥的今天。而納米銀使銀的殺菌能力產(chǎn)生了質(zhì)的飛躍。因此，在燒傷整形領(lǐng)域出現(xiàn)越來(lái)越多的含納米銀的新敷料。一種新的醫(yī)用生物材料應(yīng)用于臨床前需對(duì)其進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。因此，本研究對(duì)自制的丹參納米銀復(fù)合材料進(jìn)行了無(wú)菌試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)、原發(fā)性皮膚刺激試驗(yàn)、皮內(nèi)刺激試驗(yàn)、急性全身毒性試驗(yàn)及測(cè)定全血及組織中的痕量銀以評(píng)價(jià)該材料的生物安全性，為其作為創(chuàng)面修復(fù)和種子細(xì)胞的支架材料提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑：HS－1300超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；101AB－Z電熱恒溫?zé)峁娘L(fēng)干燥箱(上海華聯(lián)環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備公司恒昌儀器廠)；XW－80A旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；銀元素空心陰極燈；360MC型原子吸收分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)。

丹參注射液(江蘇安格藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：061205D)；粉狀殼聚糖(浙江玉環(huán)化工廠，脫乙酰度90％以上)；冰醋酸(99.5％)，硝酸銀，氫氧化鈉，檸檬酸三鈉等均為分析純；8％硫化鈉溶液，3％戊巴比妥鈉。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：1.9～2.8kg家兔，17～23g健康小白鼠，0.2kg左右SD大鼠，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 丹參納米銀復(fù)合材料的制備

1.3.1.1 納米銀的制備：根據(jù)Meisel報(bào)道的方法制備納米銀。

1.3.1.2 殼聚糖膜的制備：用1％冰醋酸溶液溶解殼聚糖得到1.5％的殼聚糖溶液。過(guò)濾后倒入塑料培養(yǎng)皿中烘干成膜。

1.3.1.3 丹參納米銀復(fù)合材料的制備：通過(guò)自組裝技術(shù)得到丹參納米銀復(fù)合材料。

1.3.2 無(wú)菌試驗(yàn)：根據(jù)中華人民共和國(guó)藥典(二部，2005)附錄XIH進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)。

1.3.3熱原試驗(yàn)

1.3.3.1 浸提液的制備：將丹參納米銀復(fù)合材料切成30mm×5mm條狀，置于去熱原的25ml錐形瓶中，按受試材料3cm²：1ml氯化鈉注射液的比例，取一定量的氯化鈉注射液于錐形瓶中，置于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中浸提72h。72h后將浸提液轉(zhuǎn)移至另一去熱原的錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH值為7.0左右，4℃保存?zhèn)溆?。以上過(guò)程均在潔凈工作臺(tái)上按無(wú)菌操作要求進(jìn)行。

1.3.3.2 熱原檢查法：根據(jù)GB/T16175-1996熱原試驗(yàn)，在試驗(yàn)前7天選3只家兔，雌雄不限，雌兔無(wú)孕，且測(cè)溫前7天內(nèi)應(yīng)在同一環(huán)境條件用同一飼料飼養(yǎng)，在此期間家兔體重?zé)o減輕，精神、食欲、排泄等無(wú)異常。預(yù)測(cè)體溫時(shí)用肛溫計(jì)插入家兔肛門，深度約6cm，時(shí)間為2min，取出肛溫計(jì)并記下讀數(shù)。每隔lh測(cè)量1次，共測(cè)4次，體溫均在38.O～39.6℃的范圍內(nèi)，且最高最低體溫的差數(shù)不超過(guò)0.4℃，符合熱原試驗(yàn)要求。

3天后將家兔固定于固定器內(nèi)。30min后開(kāi)始第1次測(cè)量，以后每隔30min測(cè)1次，共測(cè)2次。體溫之差不超過(guò)0.2℃，以此2次體溫的平均值為該兔的正常體溫。且當(dāng)日使用家兔的體溫在38.0～39.6℃的范圍內(nèi)，各兔間正常體溫之差不超過(guò)1℃。在家兔正常體溫符合要求后15min內(nèi)，自耳靜脈緩慢注入預(yù)熱38℃丹參納米銀復(fù)合材料浸提液，劑量為l0ml/kg。注射后每隔1h測(cè)量體溫1次，6次體溫中最高的1次減去正常體溫為試驗(yàn)家兔體溫升高值。

1.3.4 原發(fā)性皮膚刺激試驗(yàn)：受試家兔6只，實(shí)驗(yàn)前24h，脊柱兩側(cè)各選2個(gè)3cm×3cm面積的去毛區(qū)，用8％的硫化鈉溶液去毛，間距l(xiāng)0cm。用75％(v/V)乙醇消毒背部去毛區(qū)，用2.5cm×2.5cm濾紙塊浸泡于丹參納米銀復(fù)合材料的浸提液中至飽和，貼敷于試驗(yàn)部位。浸提介質(zhì)生理鹽水作為陰性對(duì)照，3.5％甲醛溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。材料貼敷于皮膚后，立即用3cm×3cm紗布?jí)K覆蓋，最外層用膠布固定。貼敷固定24h后，移去貼敷物，用溫水清潔貼敷區(qū)l并吸干，觀察移去斑貼物后24、48和72h皮膚的紅斑及水腫情況。計(jì)算原發(fā)刺激指數(shù)(PII)，參考文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行記分并評(píng)價(jià)。

1.3.5 皮內(nèi)刺激試驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前24h，受試家兔脊柱兩側(cè)各剪剃5cm×25cm區(qū)域兔毛，應(yīng)避免損傷皮膚。用75％(V/V)乙醇消毒暴露的皮膚。在兔脊柱兩側(cè)各選擇10個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)間隔2cm，每點(diǎn)皮內(nèi)注射劑量0.2ml。一側(cè)前5點(diǎn)注射丹參納米銀復(fù)合材料生理鹽水浸提液，后5點(diǎn)注射同批陰性對(duì)照生理鹽水；另一側(cè)前后5點(diǎn)分別注射丹參納米銀復(fù)合材料植物油浸提液和陰性對(duì)照植物油。注射后24、48、72h觀察注射局部及周圍皮膚組織反應(yīng)，參考文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行記分并評(píng)價(jià)。

1.3.6 急性全身毒性試驗(yàn)：將健康小白鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)材料組和對(duì)照兩組，每組5只。試驗(yàn)組動(dòng)物由尾靜脈注射丹參納米銀復(fù)合材料生理鹽水浸提液，劑量為50ml/kg。對(duì)照組動(dòng)物由尾靜脈注射同批號(hào)的生理鹽水，劑量為50ml/kg。注射后于24、48、72h觀察記錄試驗(yàn)和對(duì)照組動(dòng)物的一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)和死亡動(dòng)物數(shù)。觀察指標(biāo)參考文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.7 銀含量測(cè)定；0.2kg左右健康成年SD大鼠48只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(12只)，治療I組(創(chuàng)面外敷丹參納米銀復(fù)合材料，12只)、治療II組(創(chuàng)面外敷納米銀仿生敷料，12只)、治療III組(創(chuàng)面外敷磺胺嘧啶銀粉劑，12只)。治療I組、II組、III組sD大鼠用取皮刀造成10％～13％TBSA(Tota]Body Surface Area)深I(lǐng)I度切割傷。

治療I組、治療II組和治療III組在治療前和治療后2天、4天、5天、7天、13天和16天眼眶采血，采用火焰原子吸收分光光度法測(cè)定sD大鼠血液中銀的含量。當(dāng)創(chuàng)面恢復(fù)半個(gè)月后處死SD大鼠，取其肝、腦、腎，用火焰原子吸收分光光度法測(cè)定各組織中的銀含量。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：銀含量檢測(cè)數(shù)據(jù)，用State 7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 無(wú)菌試驗(yàn)結(jié)果：培養(yǎng)5天后，接種有丹參納米銀復(fù)合材料的需氧一厭氧菌培養(yǎng)管、環(huán)境監(jiān)測(cè)的陰性對(duì)照管無(wú)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照管有菌生長(zhǎng)；培養(yǎng)7天后，接種有丹參納米銀復(fù)合材料的真菌培養(yǎng)管、環(huán)境監(jiān)測(cè)的陰性對(duì)照管無(wú)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照管有菌生長(zhǎng)，說(shuō)明該材料無(wú)菌。

2.2 熱原試驗(yàn)結(jié)果：由表l可見(jiàn)，3只家兔體溫升高均低于0.6℃，并且3只家兔體溫升高總和低于1.4℃，說(shuō)明該材料無(wú)熱原。

2.3 原發(fā)性皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果：由表2可見(jiàn)，丹參納米銀復(fù)合材料浸提液貼敷家兔皮膚未見(jiàn)紅斑，無(wú)水腫形成，說(shuō)明該材料對(duì)家兔皮膚無(wú)刺激性。

2.4 皮內(nèi)刺激試驗(yàn)結(jié)果：表3為皮內(nèi)刺激試驗(yàn)的結(jié)果，可見(jiàn)丹參納米銀復(fù)合材料無(wú)皮內(nèi)刺激反應(yīng)。

2.5 急性全身毒性試驗(yàn)結(jié)果：急性全身毒性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

2.6 全血中銀含量的變化：從表5中可以看到丹參納米銀組、納米銀仿生敷料組各個(gè)時(shí)點(diǎn)血銀的含量明顯比磺胺嘧啶銀組低，丹參納米銀組、納米銀仿生敷料組全血銀含量無(wú)差異(P＞O.05)。丹參納米銀組、納米銀仿生敷料組銀含量最高是正常水平的7倍，而磺胺嘧啶銀組高達(dá)26倍。第13天，丹參納米銀組、納米銀仿生敷料組SD大鼠血銀含量基本恢復(fù)正常水平(與正常組銀含量0.07±0.03/zg/g相比，P＞0.05)，而此時(shí)磺胺嘧啶銀組SD大鼠銀含量是正常全血銀的5倍(P＜0.01)。

2.7 各組織中的銀含量：正常sD大鼠肝、腦、腎及血中銀含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。對(duì)深I(lǐng)I度切割傷大鼠使用丹參納米銀復(fù)合材料、納米銀仿生敷料和磺胺嘧啶銀后，各組織銀含量都有不同程度的升高，其中肝銀含量升高最多，其次為腎，說(shuō)明肝臟對(duì)銀的吸收最多，因此如過(guò)量吸收會(huì)首先造成對(duì)肝臟的損害。另外，磺胺嘧啶銀組中各組織的銀含量明顯高于丹參納米銀組、納米銀仿生敷料組，其中磺胺嘧啶組肝臟中銀含量是正常的近100倍(P＜0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

納米產(chǎn)品在醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，應(yīng)用前景十分廣闊。本文對(duì)自制的丹參納米銀仿生敖料進(jìn)行了初步的安全性評(píng)價(jià)，主要有無(wú)菌、熱原及銀在體內(nèi)的分布、蓄積情。試驗(yàn)證實(shí)丹參納米銀復(fù)合材料無(wú)菌、無(wú)熱原、無(wú)皮膚刺激、無(wú)皮內(nèi)刺激作用。同時(shí)因銀如過(guò)量吸收會(huì)造成機(jī)體的損害，我們用火焰原子吸收分光光度法對(duì)SD大鼠血液及肝、腦、腎等各器官的銀含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)用該復(fù)合材料的治療組大鼠比磺胺嘧啶銀組大鼠對(duì)銀的吸收少。其原因?yàn)椋恒y發(fā)揮生物活性，必須以溶液形式存在，如：Ag⁺或Ag⁺Ag⁺通常存在于硝酸銀、磺胺嘧啶銀和其它銀離子化合物中。Ag^°是存在于金屬或晶體(包括納米晶體)中，不帶電荷的存在形式。在溶液中，它以亞晶體形式存在，小于8個(gè)原子的大小。硝酸銀、磺胺嘧啶銀在濃度大于3200ppm時(shí)釋放銀離子，但是大部分都因形成化學(xué)復(fù)合物而快速失活。而納米銀提供Ag^°形式的銀，與離子形式相比較，這種形式的銀大部分不與鹵化物結(jié)合，在有機(jī)物質(zhì)中滅活的速度大大降低，有效的銀相對(duì)更多。因此，在達(dá)到同樣的治療效果時(shí)，機(jī)體對(duì)納米銀的吸收更少，減小了銀中毒的可能性，提高了使用的安全性。

編輯 張惠娟

基金項(xiàng)目：江蘇省科學(xué)技術(shù)廳社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(BS2005030)，江蘇省人事廳“六大人才高峰”資助項(xiàng)目，江蘇省“青藍(lán)工程”學(xué)術(shù)帶頭人項(xiàng)目，江蘇省教育廳高新技術(shù)項(xiàng)目(JH03－041)及自然科學(xué)項(xiàng)目(03KJBl50107，s30016)

通訊作者l：潘立群，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師：E－mail：dexuansir@hotmail.com

通訊作者2：顧海鷹，教授，博士研究生導(dǎo)師；E－mail：hyguOntu.edu.cn：guhy99@21cn.com