改良豬耳郭軟骨細胞體外培養(yǎng)的實驗研究

[摘要]目的：為組織工程化軟骨修復機體軟骨缺損提供實驗基礎。方法：用消化組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)豬耳郭軟骨細胞，并觀察其在Polyglycol icacid(簡稱PGA)支架上的生長情況。結果：軟骨細胞在pH值為7.0，含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中生長良好，可傳代1O代，細胞數(shù)目擴增為原來的400～500倍；軟骨細胞在PGA支架上生長良好，分泌基質(zhì)旺盛。結論：改良消化組織塊方法培養(yǎng)軟骨細胞是一種可以大量擴增軟骨細胞數(shù)目的確實可行的方法，PGA是軟骨細胞良好的生長支架。

[關鍵詞]組織工程；軟骨細胞；體外培養(yǎng)

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)05－0607－02

1 材料和方法

1.1 實驗用品

1.1.1 實驗器材：直徑10cm的一次性塑料培養(yǎng)皿(德國生產(chǎn))若干個，50ml一次性塑料離心管數(shù)支(美國生產(chǎn))，細胞培養(yǎng)器材一套。

1.1.2 實驗試劑：0.2％II型膠原酶(美國Sigma公司)、DMEM細胞培養(yǎng)基(杭州上城科創(chuàng)中心)、胎牛血清、0.25％的胰蛋白酶(美國Sigma公司)、PBS液、青霉素、鏈霉素、VitC、谷氨酰胺。

1.2 細胞培養(yǎng)液的制備：在DMEM加入Vitc 50mg、谷氨酰胺300mg，按1OOU/ml、100ug/ml分別加入青、鏈霉素，用前加入無菌胎牛血清，使其最終濃度為10％。調(diào)pH值為7.0左右，過濾消毒。

1.3 軟骨組織的取材：小豬浸泡在75％酒精溶液中半小時后，在無菌操作下切下豬耳郭，仔細剝?nèi)テつw和骨膜，用眼科剪將軟骨組織剪成3mm左右的小方塊，置于離心管中，加氯霉素沖洗液沖洗3次，再用PBS液沖洗3次。

1.4 軟骨細胞的提取

1.4.1 消化：在上述盛軟骨碎塊的離心管中加入0.2％II型膠原酶，體積約為軟骨體積的2倍，置于37℃的恒溫振蕩床中振蕩、消化。

1.4.2 收集細胞：3～4h后第一次收集軟骨細胞。將上述懸濁液倒入150目不銹鋼濾篩濾去軟骨組織，用于隔夜消化，第二天早上收集。過濾的液體2000r/min離心8min，輕輕吸除消化液，加入PBS液，漂洗1次，加入細胞培養(yǎng)液16ml，振蕩混和制成細胞懸液。

1.4.3 計數(shù)、檢查細胞活力

1.5 細胞培養(yǎng)方法

1.5.1 接種：每個培養(yǎng)皿加入8ml培養(yǎng)液(含10％的胎牛血清)，加入細胞懸液，每個培養(yǎng)皿接種2×10⁶個細胞，輕微搖動培養(yǎng)皿，使細胞均勻的分布于培養(yǎng)皿中，置入37℃5％CO₂溫箱培養(yǎng)。

1.5.2 換液：培養(yǎng)第3天細胞已開始分裂生長，此時應更換培養(yǎng)液。具體方法是：用吸管吸去培養(yǎng)液后再加入等量新的培養(yǎng)液，置溫箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5.3 傳代：吸干培養(yǎng)液，用PBS液輕洗細胞1次，培養(yǎng)皿內(nèi)加入0.25％的胰蛋白酶，以覆滿皿底為限，置溫箱2min后，顯微鏡下觀察到細胞質(zhì)已回縮，細胞間隙增大，即向培養(yǎng)皿里滴入2ml左右含血清的培養(yǎng)液終止消化，用套有軟管的吸管輕輕刮下皿底細胞，使細胞徹底從培養(yǎng)皿底壁脫落，用吸管吸取混和液，制成細胞懸液，計數(shù)，觀察細胞活力，按每個培養(yǎng)皿接種2×10⁶個細胞，置入37℃ 5％CO₂溫箱培養(yǎng)。

1.5.4 將培養(yǎng)的l×10⁸個軟骨細胞接種在制備好的PGA支架上，置入37℃5％CO₂溫箱培養(yǎng)，觀察軟骨細胞的生長情況。

2 結果

2.1 軟骨細胞生長情況：倒置顯微鏡下觀察，剛分離出的軟骨細胞呈圓形，有較強折光性，貼壁時間平均為10h，延伸時間為24h，4天左右形成單層細胞，細胞排列緊密，呈多角形。第一代傳代后，軟骨細胞貼壁時間平均為3h，延伸時間7h。第4天細胞已接近長滿培養(yǎng)皿，此時進行傳代。第二代傳代細胞生長速度較快。隨著代數(shù)的增加，細胞牛長速度越來越慢，細胞傳代間隔的時間越來越長，連續(xù)培養(yǎng)至第10～11代，見細胞形態(tài)向成纖維細胞型轉(zhuǎn)化，呈梭形，細胞間隙變大，輪廓增強，胞漿內(nèi)可見空泡、脂滴，增殖速度減慢，表明細胞已開始老化變性。此時收集到的細胞約為原來400～500倍。

2.2 軟骨細胞接種在PGA支架上，可見呈膜片狀，軟骨細胞分泌基質(zhì)旺盛，軟骨細胞與基質(zhì)粘附良好，中央不透明為大量細胞層疊，與支架粘附生長。

3 討論

軟骨組織結構致密，較難消化，消化酶的pH值、濃度及消化時間，對收集到的細胞的量及活力影響較大。另外，軟骨細胞在培養(yǎng)、傳代、擴增過程中對血清、培養(yǎng)皿以及傳代的時機要求較為嚴格。

3.1 消化酶pH值、濃度及消化時間的確定消化酶的pH值制約著其活性，消化酶的濃度決定著組織消化時間的長短，過長會降低細胞的生命活力，甚至使細胞死亡，消化時間過短，又收集不到細胞。作者采用0.2％pH值為7.0的II型膠原酶，在37℃恒溫振蕩下，消化軟骨組織，4h后第一次收集收集細胞，測得細胞活力為85％。過濾的軟骨組織用消化過的II型膠原酶繼續(xù)消化，隔夜第二次收集。這樣比過去用0.15％II型膠原酶隔夜消化收集到質(zhì)量好數(shù)目多的細胞。

3.2 血清的選擇：血清中含有細胞增殖所需的生長因子和活性物質(zhì)，培養(yǎng)液中血清的質(zhì)量在很大程度上影響著細胞的生長。筆者采用了DMEM培養(yǎng)液后，細胞傳代時間明顯縮短，只需要4天，而以往采用F12培養(yǎng)液，則需要6天，說明DMEM培養(yǎng)液更適合軟骨細胞的生長。

3.3 細胞傳代時消化時機的把握：①消化酶的濃度、pH值及消化時間對細胞傳代極為重要，濃度高則細胞反應快，掌握不好，細胞易死亡，濃度低和pH值不當時細胞消化慢，消化下來的細胞成片，不利計數(shù)。本實驗采用pH值為7.0、濃度為0.25％的胰蛋白酶，在37℃溫箱里消化2min，取得滿意效果。②把握好傳代時機，在80％～90％匯合階段最合適，過早傳代細胞產(chǎn)量少，過晚細胞密度太大而出現(xiàn)接觸抑制和細胞毒性作用，細胞的健康狀態(tài)不佳。

3.4 軟骨細胞在體外培養(yǎng)中的特性：軟骨細胞在體外經(jīng)培養(yǎng)一段時間后，細胞易老化，喪失分泌基質(zhì)的能力，從而難以從少量的軟骨組織培養(yǎng)中獲得大量的軟骨細胞。筆者在實驗中對傳代方法的改進，不需要離心，有利于保護細胞，收到了很好的效果。軟骨細胞可傳到11代。

3.5 PGA是軟骨細胞良好的粘附生長的支架，有利于軟骨細胞分泌基質(zhì)。而如何促進軟骨細胞的生長，減慢軟骨細胞衰老的速度，仍是組織工程化修復軟骨缺損亟待解決的問題。

編輯 張惠娟

基金項目：汕頭市科技局基金資助(編號：2004102)