造血干細(xì)胞研究進(jìn)展

朱 劍綜述，林冬靜審校 (吉林醫(yī)藥學(xué)院:.200級(jí)臨床醫(yī)學(xué)本科乙班;2.組胚教研室，吉林 吉林3203)

1 造血干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)

Till等［1］(1961年)應(yīng)用脾集落法首次證明造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSC)的存在。我國(guó)學(xué)者吳祖澤等分別制備正常雄性和雌性小鼠骨髓細(xì)胞懸液，將含等量的雄性小鼠的骨髓細(xì)胞懸液輸入經(jīng)照射的同系小鼠靜脈內(nèi)，13 d后，切取受體鼠的脾集落做染色體分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一個(gè)脾集落中不存在兼有雄性和雌性染色體的細(xì)胞，有力證實(shí)每個(gè)脾集落都是由單一細(xì)胞增殖分化而成的。白血病患者的骨髓細(xì)胞染色體分析證明人造血組織中也存在HSC，這又為其存在提供了直接的證據(jù)。HSC以及低數(shù)量存在于哺乳動(dòng)物的胎肝、臍血以及骨髓中，被稱(chēng)作“龕(niche)”的特定微環(huán)境所包圍。HSC在整個(gè)生命過(guò)程中控制著造血系統(tǒng)生成淋系、髓系細(xì)胞，對(duì)各種血細(xì)胞的更新起著決定性作用［2］。

2 HSC是干細(xì)胞生物學(xué)的范例

血液的產(chǎn)生對(duì)于生命是必不可少的，因?yàn)樗鼈冊(cè)诮M織的氧合作用、血管完整性的控制和感染后免疫應(yīng)答細(xì)胞的分布中扮演了重要角色，而且大量的細(xì)胞數(shù)和相對(duì)短的細(xì)胞周期要求應(yīng)當(dāng)不斷產(chǎn)生新的細(xì)胞代替活動(dòng)期細(xì)胞。血細(xì)胞穩(wěn)定的日生產(chǎn)率是啟動(dòng)造血過(guò)程的干細(xì)胞潛能的體現(xiàn)［3］。這些對(duì)增殖和分化的極大需求及在人類(lèi)長(zhǎng)期成功移植的現(xiàn)實(shí)，使HSC在各類(lèi)細(xì)胞治療中成為首選的細(xì)胞類(lèi)型。

3 造血原理

由HSC定向分化，增殖為不同的細(xì)胞系，并進(jìn)一步生成血細(xì)胞。人類(lèi)HSC首先出現(xiàn)于胚齡2～3周的卵黃囊，在胚胎早期(第2～3月)牽制肝、脾，第5個(gè)月又從肝脾遷至骨髓。在胚胎末期一直到出生后，骨髓成為HSC的主要來(lái)源［4］。具有多潛能性，即具有自身復(fù)制和分化兩種功能。在胚胎和迅速再生的骨髓中，HSC多處于骨髓增殖中，而在正常骨髓中，則多數(shù)處于靜止期(G0期)，當(dāng)機(jī)體需要時(shí)，其中一部分發(fā)育成不同血細(xì)胞系的定向干細(xì)胞。定向干細(xì)胞多數(shù)處于增殖之中，并進(jìn)一步分化為各系統(tǒng)的血細(xì)胞系，如紅細(xì)胞系、粒細(xì)胞系、單核-吞噬細(xì)胞系、巨核細(xì)胞系以及淋巴細(xì)胞系［5］。由HSC分化出來(lái)的淋巴細(xì)胞有兩個(gè)發(fā)育途徑:一個(gè)受胸腺的作用，在胸腺素的催化作用下分化成熟為胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞，即T細(xì)胞;另一個(gè)不受胸腺，而受腔上囊(鳥(niǎo)類(lèi))或類(lèi)囊器官(哺乳動(dòng)物)的影響，分化成熟為囊依賴(lài)性淋巴細(xì)胞或骨髓依賴(lài)性淋巴細(xì)胞，即B細(xì)胞。由T、B細(xì)胞分別引起細(xì)胞免疫和體液免疫。

4 HSC鑒定分類(lèi)

HSC的鑒定是建立在一系列小鼠實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上的，該標(biāo)準(zhǔn)也適用于人體內(nèi)的HSC。根據(jù)其自我更新和分化產(chǎn)生體內(nèi)的各種血細(xì)胞的能力而定義的。

若干年來(lái)，許多表面標(biāo)記物常被用來(lái)鑒別、分離和純化從骨髓和血液中提取的HSC。未分化的HSC和造血前體細(xì)胞的表達(dá)c-kit、CD43和H-2K;為移植所需，表達(dá)CD34、Thy1+、Lin-的細(xì)胞含有干細(xì)胞可能性更大，更容易移植成功。

根據(jù)其造血重建能力可以分為長(zhǎng)期增殖造血干細(xì)胞(long-term hematopoietic stem cell，LT-HSC)和短期增殖造血干細(xì)胞(short-term hematopoietic stem cell，ST-HSC)［6］。ST-HSC只在有限時(shí)間內(nèi)分裂，有的只分裂幾個(gè)月。LT-HSC有很高的端粒酶活性。端粒酶能通過(guò)給染色體末端的端粒加入核苷酸而保持端粒的長(zhǎng)度。高端粒酶活性是未分化的分裂期細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的特征之一。已分化的人類(lèi)體細(xì)胞并無(wú)端粒酶活性。LT-HSC存在與成人的骨髓、血液、肝臟和脾臟中，但數(shù)量非常稀少。在小鼠中10 000～15 000個(gè)骨髓細(xì)胞中才有1個(gè)LT-HSC。最近有研究表明，ST-HSC實(shí)際上是一個(gè)能自我更新、重組造血系統(tǒng)的混合細(xì)胞群［7］。

HSC繼續(xù)向下分化形成多能造血祖細(xì)胞(multipotent progenitor cells，MPPs)，MPPs再分化形成髓系祖細(xì)胞(common myeloid progenitor，CMP)和淋系祖細(xì)胞(common lymphoid progenitor，CLP)［8-9］。髓系前體細(xì)胞能分化為單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞和紅細(xì)胞;淋巴前體細(xì)胞能分化為T(mén)細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，其分化機(jī)制及通道仍在研究中。

5 HSC形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

經(jīng)光鏡、電鏡觀察，提出HSC大小形態(tài)類(lèi)似小淋巴細(xì)胞，直徑7～10μm，有少量的胞漿，除游離核糖體和少量線(xiàn)粒體外，無(wú)其他細(xì)胞器，過(guò)氧化物酶染色陰性。與淋巴細(xì)胞相比較，發(fā)現(xiàn)HSC:①大小變動(dòng)范圍較淋巴細(xì)胞大，細(xì)胞核大致呈圓形，多不規(guī)則，凹陷不如淋巴細(xì)胞的深;②核的染色質(zhì)與小淋巴細(xì)胞比較，細(xì)小、彌散分布;③可見(jiàn)到小淋巴細(xì)胞胞漿中常見(jiàn)到的高爾基復(fù)合體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體;④雖然兩種細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體均少，但HSC的線(xiàn)粒體較淋巴細(xì)胞的多且小;⑤含游離核糖體較小淋巴細(xì)胞多，但極少有多聚核糖體［10］。

6 HSC生物學(xué)特性

高度自我復(fù)制能力。經(jīng)分裂增生產(chǎn)生的子代細(xì)胞均保持親代細(xì)胞的所有特征，機(jī)體內(nèi)干細(xì)胞的這種自我復(fù)制能力持續(xù)終身。關(guān)于干細(xì)胞分裂的機(jī)制可能與細(xì)胞極性有關(guān)。

多分化能力。具有多分化潛能，生成大量成熟的各種血細(xì)胞，還可生成一些其他細(xì)胞，如破骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞等。

細(xì)胞的不均一性。不是單一的細(xì)胞群體，而是有不同發(fā)育等級(jí)的干細(xì)胞組成［11］。

7 HSC檢測(cè)方法

由于HSC數(shù)量極少，且從形態(tài)上不能識(shí)別，在實(shí)驗(yàn)血液發(fā)展早期也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞的表面識(shí)別標(biāo)志(CD34)，更不具備分離、純化HSC的手段，故經(jīng)典的研究其性能的思路為選擇一個(gè)HSC上的人為或天然的具有遺傳特性的標(biāo)志，通過(guò)檢測(cè)分化后細(xì)胞的這一標(biāo)志來(lái)推測(cè)它的性能。早期采用的標(biāo)志是由輻射誘變的染色體以外及天然的性染色體(小鼠)。前者是指采用帶有畸變?nèi)旧w標(biāo)志的小鼠骨髓去重建受致死劑量射線(xiàn)小鼠的造血，通過(guò)研究帶有這一染色體標(biāo)志重建造血以后的小鼠細(xì)胞情況來(lái)推測(cè)HSC的性能。而后者是指采用一種性別的小鼠HSC去重建相反性別的受射線(xiàn)照射小鼠的造血，再研究造血重建后的血細(xì)胞的染色體核型，以此推測(cè)造血干細(xì)胞的性能［12］。其方法有:①經(jīng)典測(cè)試方法;②自我更新和造血重建能力的測(cè)試;③無(wú)限增殖及多向分化能力的測(cè)試;④胎羊?qū)m內(nèi)移植模型;⑤競(jìng)爭(zhēng)性再植實(shí)驗(yàn);⑥體外克隆實(shí)驗(yàn)。目前用來(lái)檢測(cè)HSC和早期造血祖細(xì)胞的體外克隆實(shí)驗(yàn)包括:長(zhǎng)期培養(yǎng)啟動(dòng)細(xì)胞LIC-IC實(shí)驗(yàn);延長(zhǎng)的長(zhǎng)期培養(yǎng)啟動(dòng)細(xì)胞LIC-IC實(shí)驗(yàn);高增殖潛能集落形成細(xì)胞實(shí)驗(yàn)HPP-CFC;卵石樣區(qū)域形成細(xì)胞實(shí)驗(yàn)CAFC;原始細(xì)胞集落形成細(xì)胞測(cè)試CFC-BI;混合集落培養(yǎng)法CFU-Mix［2］。

8 HSC臨床應(yīng)用

8.1 基因治療

HSC因具有自我更新、多向分化、重建長(zhǎng)期造血、采集和體外處理容易等特點(diǎn)而成為某些疾病基因治療的一種理想靶細(xì)胞［13］。造血干細(xì)胞應(yīng)用范圍比較廣泛［14］:①單基因缺陷遺傳病，如重癥聯(lián)合免疫缺陷癥(SCID)、Fanconi貧血等;②移植與腫瘤治療中基因標(biāo)記、自殺基因或耐藥基因的導(dǎo)入;③DNA/RNA疫苗;④AIDS的治療，如HIV基因抑制物等。

8.2 細(xì)胞治療

(1)臨床HSC移植。臨床進(jìn)行造血干細(xì)胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)，通過(guò)注入定向造血干細(xì)胞及化學(xué)放射治療來(lái)消除以前存在的骨髓再生，是由E.Donnall Thomas在1956年首次完成［15］。到1995年，已在世界各地進(jìn)行了40 000例造血干細(xì)胞移植。截至2009年9月，全球共有2 723項(xiàng)干細(xì)胞相關(guān)的臨床研究已開(kāi)展或者正在進(jìn)行［16］。其中，Ⅰ期臨床研究817項(xiàng)，Ⅱ期臨床研究1 421項(xiàng)，Ⅲ期臨床研究370項(xiàng)，Ⅳ期臨床研究62項(xiàng)。1 311項(xiàng)臨床研究正在招募志愿者。開(kāi)展干細(xì)胞臨床研究的國(guó)家主要在美國(guó)和歐洲(根據(jù)NIH的臨床研究區(qū)域分類(lèi))。此外，加拿大、澳大利亞的干細(xì)胞臨床研究也比較多，而亞洲地區(qū)相對(duì)較少。在這些臨床研究中，血液和淋巴疾病干細(xì)胞治療較多。

(2)移植種類(lèi)、適應(yīng)證及其預(yù)后。

當(dāng)前執(zhí)行干細(xì)胞移植的種類(lèi)有以下幾種:自體干細(xì)胞移植;異體干細(xì)胞移植、骨髓根除相關(guān)干細(xì)胞移植;錯(cuò)配、親緣(單倍同一性)、非親緣;臍帶;異體移植，非骨髓根除相關(guān)或不相關(guān)、匹配或不匹配［15］。自體HSCT是患者提供他們自己的干細(xì)胞(骨髓、外周血或臍帶血)，因此能避免移植抗宿主病。提前獲得材料的自體HSCT可允許化療和放療的劑量增加超過(guò)骨髓抑制的限度。高劑量治療實(shí)施后，受體被自體干細(xì)胞“挽救”。

適應(yīng)證包括漿細(xì)胞性骨髓瘤和所有種類(lèi)復(fù)發(fā)性淋巴瘤。同源性HSCT也與之相似，其干細(xì)胞從同卵雙生同胞身上獲取。異體HSCT中供體細(xì)胞在重建造血作用的同時(shí)，也產(chǎn)生了免疫介導(dǎo)的移植物抗腫瘤(graft versus tumor，GVT)作用，與自體移植相比能減少?gòu)?fù)發(fā)率［17］。異體干細(xì)胞移植可取自親緣或非親緣的供體。供體和受體可接受的匹配程度與主要組織相容性/人類(lèi)白細(xì)胞抗原(human lymphocyte antigen，HLA)位點(diǎn)相關(guān)，其發(fā)生作用與干細(xì)胞源、受體的年齡及其他因素相關(guān)。臍帶血更能接受各種不匹配的人類(lèi)白細(xì)胞抗原，這是外周血和骨髓移植所不能的。

由于造血干細(xì)胞移植時(shí)供體T細(xì)胞輸注引發(fā)移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)?？顾拗鞑】梢詫?dǎo)致急性癥狀和致命的細(xì)胞因子反應(yīng)，但是更常見(jiàn)的表現(xiàn)是易變且反復(fù)的皮疹、黏膜炎和炎癥改變，長(zhǎng)期后遺癥(慢性GVHD)包括血管病和終末器官損傷［18-19］。表1顯示了國(guó)際骨髓移植登記處(IBMTR)對(duì)急性GVDH分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［20］。

造血干細(xì)胞基因治療尚處于探索階段，有許多問(wèn)題需要解決:如生物安全性問(wèn)題，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由于隨機(jī)整合引起插入突變，進(jìn)而出現(xiàn)白血?。?1］;還有轉(zhuǎn)染效率低，外源基因不能長(zhǎng)期穩(wěn)定地表達(dá)或“沉默”現(xiàn)象，嚴(yán)重影響臨床應(yīng)用。不過(guò)，隨著對(duì)造血干細(xì)胞生物學(xué)特性的深入研究，以及生物技術(shù)手段的不斷創(chuàng)新，使造血干細(xì)胞的細(xì)胞治療和基因治療成為廣闊的治療手段。

表1 急性GVHD的IBMTR分度標(biāo)準(zhǔn)

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