萵苣黃酮類化合物的抗氧化性研究

杜 鵑(吉林醫(yī)藥學院，吉林 吉林 132013)

萵苣(Lettuce)，又稱千金菜、石苣，一、二年生草本植物?！侗静菥V目》記載，萵筍性涼味苦，有利五臟、通經(jīng)脈、開胸膈、堅筋骨、白牙齒、去口氣、通乳汁、利小便等功效［1］。目前，對萵苣的研究還主要集中在提取純化工藝上，對萵苣黃酮(total flavonoid extracts from lettuce，TFEL)體外抗氧化活性的研究尚未見報道。本研究旨在通過體外氧化化學模擬體系來研究TFEL的抗氧化活性，以期為萵苣天然抗氧化劑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料和試劑

EA-500A型高速中藥粉碎機(長沙岳麓中南藥機械廠);RE-52AA型旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);UV1800紫外可見分光光度計(日本島津);TGL20M-2臺式高速大容量冷凍離心機(湖南凱達實業(yè)發(fā)展有限公司);202-1型電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。

萵苣:購自吉林市多客源超市;蘆丁標準品(中國藥品生物制品檢定所);2-D-脫氧核糖(Sigma公司);無水乙醇、乙醚、硫酸亞鐵、氯化鈉、抗壞血酸、三羥甲基氨基甲烷等試劑均為國產(chǎn)分析純。

實驗動物為雄性昆明小鼠10只，由吉林醫(yī)藥學院動物實驗中心提供，體重(20±2)g。

1.2 萵苣預處理

取新鮮萵苣樣品，清洗后蒸餾水沖洗，切片后微波處理3 min，60℃干燥24 h，中藥粉碎機中粉碎至呈粉末，過60目篩，45℃乙醚脫脂脫色2 h(索氏提取法)，自然風干。

1.3 萵苣黃酮類化合物的提取

稱取10 mg蘆丁標準樣品，用70%乙醇定容至50 mL，搖勻即得濃度為0.2 mg/mL標準樣品儲備液。取蘆丁標準溶液2.0 mL，70%乙醇定容至10 mL，用紫外可見分光光度計于190～500 nm范圍內(nèi)進行吸光度掃描，2次掃描取平均值，最大特征吸收峰為360 nm。分別移取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mL蘆丁標準樣品儲備液于6個10 mL容量瓶中，加入體積分數(shù)70%的乙醇溶液定容，在360 nm處測定吸光度值。得回歸方程為Y=36.121 4X+0.546 6，R=0.999 9(X:濃度，Y:吸光度)。

超聲提取:稱取2.0 g脫脂后萵苣樣品于三角燒瓶中，按料液比1∶20加入60%乙醇溶液，50℃下利用50 W功率的超聲波提取30 min，離心10 min(3 000 r/min)，上清液即為總黃酮提取液。提取液減壓濃縮至干后以60%乙醇定容至50 mL，稀釋20倍，于360 nm處測定吸光度值，并按下列公式計算提取物中總黃酮的含量。

經(jīng)計算，萵苣總黃酮含量為0.74%。

1.4 TFEL清除羥自由基作用測定

樣品組:取5支試管分別加入5 mmol/L FeSO4，5 mmol/L EDTA，5 mmol/L 2-D-脫氧核糖各0.2 mL，與0.2 mL濃度分別為10、20、50、100、150 mg/mL的TFEL樣品液混合，加入0.1 mol/L PBS緩沖液(pH 7.4)1.0 mL，0.2 mL的5 mmol/L過氧化氫(H2O2)，37℃水浴4 h，加入1.4%三氯乙酸、0.5%硫代巴比妥酸各1 mL。沸水浴10 min后迅速冷卻至室溫。于波長532 nm處測定各管的吸光度值。空白組:不加2-D-脫氧核糖，其余同樣品管。對照組:用相同體積的60%乙醇代替樣品液，其余同樣品管。以吸光度計算抑制率。

1.5 TFEL對H2O2誘導肝勻漿脂質(zhì)過氧化的影響

取小鼠肝臟組織，冷生理鹽水清洗，冰浴下勻漿，制成1%肝組織勻漿。取1%肝勻漿2 mL，分別加入濃度為5、10、20、50和100 mg/mL TFEL溶液0.4 mL，再 依 次 加 入6mmol/L FeSO40.2 mL，60 mmol/L H2O20.2 mL，37℃溫育1 h后，加入15%三氯乙酸2.0 mL，終止反應，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，加0.67%硫代巴比妥酸2.0 mL，沸水浴15 min，流水冷卻，測定532 nm處的吸光度值;對照組:用等體積60%乙醇代替樣品液;VC陽性對照組:用等體積等濃度的VC溶液代替樣品液［2］。

1.6 TFEL對H2 O2所致的紅細胞氧化溶血的影響

小鼠眼球取血，肝素抗凝。用0.9%的生理鹽水沖洗、離心3次，2 000 r/min離心10 min。直至上清液無紅色，用0.9%的生理鹽水配制成0.5%紅細胞懸液。取1mL紅細胞懸浮液，分別加入0.2 mL濃度為2、5、10、20和50 mg/mL的TFEL樣品溶液，混勻，加入0.1 mL 100 mmol/L H2O2溶液，混勻，37℃溫育1 h后，2 000 r/min離心10 min，用生理鹽水稀釋4倍，取上清液，以生理鹽水調(diào)零，于415 nm處測定吸光度;VC陽性對照組:用等體積等濃度的VC溶液代替樣品液;H2O2誘導對照組:用等體積的生理鹽水代替樣品液。

2 結果與討論

2.1 TFEL清除·OH作用

結果顯示(見圖1)，當TFEL提取物在20～100 mg/mL濃度范圍內(nèi)時，隨濃度的增加，對·OH的抑制率明顯增強;但當TFEL濃度大于100 mg/mL后，其抑制率增加不明顯。經(jīng)計算TFEL對·OH半數(shù)抑制濃度IC50為59.06 mg/mL。

2.2 TFEL對H2O2誘導肝勻漿脂質(zhì)過氧化的影響

結果顯示(見圖2)，在試驗濃度范圍內(nèi)，各試樣的抑制作用隨濃度的增加而逐漸增大，表現(xiàn)一定的量效關系。經(jīng)計算TFEL對H2O2誘導肝勻漿脂質(zhì)過氧化半數(shù)抑制濃度IC 50為6.986 mg/mL。在同濃度下，TFEL樣品的抑制率略大于VC溶液。

2.3 TFEL對H2 O2所致的紅細胞氧化溶血的影響

由圖3可知，當TFEL提取物的濃度在5～50 mg/mL之間時，對紅細胞溶血有明顯的抑制作用，且隨著濃度增加，抑制率明顯提高;當黃酮濃度達到50 mg/mL時，抑制率可達96.03%。經(jīng)計算TFEL對H2O2所致紅細胞氧化溶血的半數(shù)抑制濃度IC50為20.25 mg/mL。

3 結論

萵苣中含有較多的黃酮類物質(zhì)，能有效清除羥自由基，抑制肝臟組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛的產(chǎn)生，對H2O2所致的紅細胞氧化溶血有明顯的抑制作用。表明TFEL具有較強的體外抗氧化活性，作為天然抗氧化劑具有很好的開發(fā)潛力，在食品、醫(yī)藥領域有廣泛的應用前景，有待進一步研究開發(fā)。

圖1 TFEL對·OH的清除作用

圖2 TFEL對肝勻漿脂質(zhì)過氧化的影響

圖3 TFEL對紅細胞氧化溶血的影響

［1］ 陳靜波，田迪英.萵筍不同部位抗氧化活性的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2006，27(9):54-57.

［2］ 張 嵐，葛紅娟，溫武略，等.酸漿宿萼總黃酮體外對羥基自由基的抑制作用［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22(8):1936-1937.