大豆異黃酮對(duì)D-半乳糖所致衰老大鼠的影響

顧饒勝，范紅艷，王艷春，沈 楠，常 影，任 曠* (吉林醫(yī)藥學(xué)院:.藥理教研室，.實(shí)驗(yàn)中心機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 303)

大豆異黃酮(soybean isoflavone，SI)是一種在結(jié)構(gòu)和功能上與雌二醇非常相似的植物雌激素，主要分布于大豆種子的子葉和胚軸中，種皮中含量極少。隨著大豆制品的普及和攝入量的逐漸增加，加之近年來表現(xiàn)的廣泛的生物學(xué)活性，如促生長(zhǎng)、增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗氧化、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)、防治心血管疾病等作用，大豆異黃酮日益受到關(guān)注［1-4］。本研究采用D-半乳糖(D-galactose，D-gal)建立體內(nèi)大鼠衰老模型，觀察不同劑量SI對(duì)大鼠衰老的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及藥品試劑

Wistar大鼠，清潔級(jí)，雌雄兼用，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

大豆異黃酮，鄭州荔諾生物科技有限公司，純度99%;D-gal，張家港市華昌藥業(yè)有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、ATP試劑盒和總蛋白試劑盒，南京建成生物工程公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組和給藥

Wistar大鼠60只，體重180～220 g，隨機(jī)分為5組:正常組、模型組(D-gal組)、SI各劑量組［100、200、400 mg/(kg·d)］，每組12只。除正常組，各組均頸背部皮下注射D-gal120 mg/(kg·d)，連續(xù)6周，SI組自第2天開始灌胃給藥6周，每日1次，正常組和模型組每日給予相同體積的0.25%羧甲基纖維素鈉溶液。

1.3 學(xué)習(xí)記憶能力的測(cè)定

于給藥結(jié)束后次日進(jìn)行Morris水迷宮行為測(cè)試。水迷宮為直徑150 cm，高60 cm，水深30 cm，水溫(22±1)℃，加適量二氧化鈦使水呈乳白色。將平臺(tái)放在西南象限正中距池壁22 cm處，迷宮中液面高于平臺(tái)1 cm，訓(xùn)練期間環(huán)境安靜，迷宮外參照物不變。每天上午8:00-10:00，每組分別訓(xùn)練1次，連續(xù)訓(xùn)練4 d。大鼠頭部涂以黃色染劑，訓(xùn)練時(shí)每天從東側(cè)入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水池，同時(shí)啟動(dòng)記錄裝置，記錄大鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期，escape latency)，設(shè)定120 s為最長(zhǎng)逃避潛伏期，120 s后自動(dòng)停止記錄。若大鼠在120 s內(nèi)仍未找到平臺(tái)，則將其引至平臺(tái)并停留10 s，潛伏期記為120 s。于第5天行定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。

定位航行試驗(yàn):將大鼠于西南象限面向池壁放入水中，自動(dòng)記錄大鼠找到平臺(tái)的潛伏期，檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)能力。

空間探索實(shí)驗(yàn):定位航行試驗(yàn)結(jié)束后撤除平臺(tái)，選擇西南象限的中心作為入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄120 s內(nèi)大鼠在原平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間(有效區(qū)停留時(shí)間)以及穿越原平臺(tái)次數(shù)，以檢驗(yàn)大鼠的記憶能力。

1.4 標(biāo)本的收集

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后禁食不禁水12 h，稱量體重，以10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，靜置30 min，3 000 r/min，離心15 min，分離得血清備用;迅速在冰上取腦組織，用4℃生理鹽水洗滌腦組織，吸干，精確稱量0.2 g，加2 mL生理鹽水，在冰浴下制成10%組織勻漿，3 000 r/min，離心15 min，取上清液備用。迅速取出胸腺、脾，吸去血液，修去脂肪、系膜，并立即用電子天平稱取濕重，計(jì)算胸腺指數(shù)、脾指數(shù)。指數(shù)計(jì)算采用如下公式:

1.5 血清中MDA含量、SOD活性的測(cè)定

取血清嚴(yán)格按試劑盒說明測(cè)定MDA含量;取血清嚴(yán)格按SOD試劑盒說明測(cè)定其活性。

1.6 腦組織Na+-K+-ATP酶活性的測(cè)定

取10%腦組織勻漿的離心上清液，嚴(yán)格按ATP酶試劑盒說明測(cè)定其Na+-K+-ATP酶活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SI對(duì)D-gal致衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

結(jié)果表明，模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙、空間定位記憶障礙，表現(xiàn)為模型組的逃避潛伏期較正常組明顯延長(zhǎng)、有效區(qū)停留時(shí)間減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。SI中、高劑量［200，400 mg/(kg·d)］組與模型組比較，其逃避潛伏期顯著縮短、有效區(qū)停留時(shí)間增加(P＜0.05或P＜0.001)，表明SI可以改善衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，但尚未達(dá)到正常組水平，見表1。

2.2 SI對(duì)D-gal致衰老大鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響

結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組胸腺指數(shù)和脾指數(shù)降低(P＜0.05)，SI中、高劑量［200，400 mg/(kg·d)］組大鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)增加，與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。結(jié)果表明，經(jīng)Dgal造模后，大鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)降低，而大豆異黃酮能顯著改善這種變化，說明大豆異黃酮能拮抗Dgal造模后大鼠脾和胸腺功能的衰退，提高免疫力，見表2。

表1 SI對(duì)D-gal致衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響(±S，s，n=12)

表1 SI對(duì)D-gal致衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響(±S，s，n=12)

與對(duì)照組相比:#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組相比:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 逃避潛伏期 有效區(qū)停留時(shí)間對(duì)照組26±18 5.2±2.1模型組 55±41## 2.1±0.9##SI 100 mg/(kg·d) 50±40 2.7±1.8 SI 200 mg/(kg·d) 35±27* 4.1±2.4*SI 400 mg/(kg·d) 30±28＊＊ 5.0±2.3＊＊

表2 SI對(duì)D-gal致衰老大鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響(±S，mg/g，n=12)

表2 SI對(duì)D-gal致衰老大鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響(±S，mg/g，n=12)

與對(duì)照組相比:#P＜0.05;與模型組相比:*P＜0.05

組 別TW/BW SW/BW對(duì)照組2.0±0.7 2.4±0.4模型組 1.5±0.4# 2.0±0.5#SI 100 mg/(kg·d) 1.8±0.4 2.1±0.2 SI 200 mg/(kg·d) 1.8±0.4* 2.2±0.3*SI 400 mg/(kg·d) 1.9±0.5* 2.3±0.2*

2.3 SI對(duì)D-gal致衰老大鼠血清中MDA含量、SOD活性的影響

結(jié)果表明，模型組大鼠血清中MDA含量明顯高于正常組、SOD活性明顯低于正常組(P＜0.01)。SI中、高劑量組大鼠血清中MDA含量減少，SI中、高劑量組大鼠血清中SOD活性增強(qiáng)，與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05或P＜0.01)，見表3。

表3 SI對(duì)D-gal致衰老大鼠血清中MDA含量、SOD活性的影響(±S，n=12)

表3 SI對(duì)D-gal致衰老大鼠血清中MDA含量、SOD活性的影響(±S，n=12)

與對(duì)照組相比:#P＜0.05，P##＜0.01;與模型組相比:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組 別 MDA(nmol/ml) SOD(U/ml)7.6±1.3 143±7模型組 12.1±2.3## 122±16##SI 100 mg/(kg·d) 10.2±2.6 124±25 SI 200 mg/(kg·d) 8.6±4.1* 134±10*SI 400 mg/(kg·d) 7.6±1.6＊＊ 140±24對(duì)照組*

2.4 SI對(duì)D-gal致衰老大鼠腦組織中Na+-K+-ATP酶活性的影響

結(jié)果表明，模型組大鼠腦組織中Na+-K+-ATP酶活性明顯低于正常組(P＜0.05)。SI中、高劑量［200，400 mg/(kg·d)］組大鼠腦組織中Na+-K+-ATP酶的活性明顯高于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，說明SI具有一定的提高Na+-K+-ATP酶活性的作用，見表4。

表4 SI對(duì)D-gal致衰老大鼠腦組織Na+-K+-ATP酶活性的影響(±S，n=12)

表4 SI對(duì)D-gal致衰老大鼠腦組織Na+-K+-ATP酶活性的影響(±S，n=12)

與對(duì)照組相比:#P＜0.05;與模型組相比:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組 別 Na+-K-ATPase［μmolPi/(mgprot·hour )］對(duì)照組0.30±0.14模型組 0.20±0.05#SI 100 mg/(kg·d) 0.20±0.08 SI 200 mg/(kg·d) 0.29±0.11*SI 400 mg/(kg·d) 0.31±0.07＊＊

3 討論

衰老是機(jī)體各種生化反應(yīng)的綜合表現(xiàn)，是機(jī)體內(nèi)外眾多因素(遺傳、精神、環(huán)境污染等)共同作用的結(jié)果。目前關(guān)于衰老發(fā)生機(jī)制的學(xué)說有遺傳程序?qū)W說、免疫系統(tǒng)退化學(xué)說、氧自由基學(xué)說、代謝學(xué)說等。端粒及端粒酶的發(fā)現(xiàn)［5］使遺傳程序?qū)W說有了新進(jìn)展。端粒是真核細(xì)胞染色體末端的重復(fù)DNA序列，對(duì)染色體末端起保護(hù)作用，并決定細(xì)胞的復(fù)制與衰老。DNA每復(fù)制1次，端粒即丟失50～200 bP，當(dāng)它縮短到一定程度時(shí)，細(xì)胞則停止分裂、衰老、死亡。端粒序列的復(fù)制依賴于一種特殊的DNA聚合酶，即端粒酶，目前國(guó)內(nèi)外有大量的研究報(bào)道實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或人類組織細(xì)胞在衰老過程中端粒酶活性的變化，但對(duì)影響端粒酶活性的因素研究較少。免疫系統(tǒng)退化學(xué)說認(rèn)為，在衰老過程中，老年機(jī)體的免疫功能低下/紊亂是機(jī)體衰老的主要原因之一。隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體在衰老過程中免疫器官-胸腺萎縮，60歲左右萎縮至最小。胸腺能夠產(chǎn)生胸腺細(xì)胞，并分化成T細(xì)胞和多種亞型，胸腺細(xì)胞可以分泌胸腺素;衰老時(shí)胸腺上皮細(xì)胞分子表達(dá)下降導(dǎo)致胸腺組織產(chǎn)生T細(xì)胞的能力及淋巴細(xì)胞產(chǎn)生成熟的細(xì)胞因子能力明顯下降，免疫功能隨之下降。同時(shí)，脾臟是人類最大的外周免疫器官，是B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞的主要居所，也是免疫反應(yīng)的主要場(chǎng)所，脾臟功能的衰退同樣可引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞功能的減退［6］。自由基學(xué)說認(rèn)為，自由基過多可攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，生成脂質(zhì)過氧化物，損害生物膜，自由基還使DNA、RNA、蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致細(xì)胞正常生理活動(dòng)受損引起衰老。

衰老模型的建立是研究衰老的前提，也是研究衰老的表現(xiàn)、機(jī)理以及篩選延緩衰老藥物的主要手段，尋找并研究一種經(jīng)濟(jì)有效的抗衰老藥物成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的緊迫課題。目前常用的動(dòng)物模型有臭氧致衰老小鼠模型，D-gal致大鼠、小鼠亞急性衰老模型，輻射致小鼠亞急性衰老模型［7］，環(huán)磷酰胺或腎上腺皮質(zhì)激素致免疫功能低下小鼠衰老模型，用醋酸潑尼松致腎虛衰老小鼠模型等。最常見的致衰老模型是采用D-gal注射法，其機(jī)理主要是過量的D-gal在醛糖還原酶催化下還原成半乳糖醇，后者不能被進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響正常滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、功能障礙、代謝紊亂、破壞并消耗機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)，使自由基積聚、而過氧化脂質(zhì)等增高出現(xiàn)衰老［8］。機(jī)體衰老的基礎(chǔ)是細(xì)胞衰老，而細(xì)胞水平的改變主要表現(xiàn)在細(xì)胞膜上。Na+-K+-ATP酶是細(xì)胞膜上重要的膜蛋白，其活性改變是反映機(jī)體早期生理功能衰退極為敏感的指標(biāo)，現(xiàn)已作為觀察衰老的新指標(biāo)［9］。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠腦組織中Na+-K+-ATP酶活性降低，且出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙、免疫器官衰退，表現(xiàn)為逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，有效期停留時(shí)間明顯減少，胸腺指數(shù)、脾指數(shù)降低，與正常組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明衰老模型復(fù)制成功。經(jīng)SI治療6周后，SI中、高劑量［200，400 mg/(kg·d)］組大鼠腦組織中N+-K+-ATP酶活性增強(qiáng)，逃避潛伏期明顯縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加，胸腺指數(shù)、脾指數(shù)增高，與模型組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，說明SI通過穩(wěn)定細(xì)胞膜，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，而減弱了D-gal導(dǎo)致的衰老作用，使免疫器官的衰退減弱，使大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力提高。

MDA是自由基對(duì)不飽和脂肪酸引發(fā)的脂質(zhì)過氧化物的最終產(chǎn)物，MDA水平高低間接反映細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，SOD活性間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力。二者含量的測(cè)定被公認(rèn)是抗衰老藥物研究的重要指標(biāo)。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠血清中MDA含量增高、SOD活性降低與正常組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再次說明衰老與自由基作用密切相關(guān)。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用SI灌胃6周，在100～400 mg/(kg·d)劑量范圍內(nèi)可見衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的提高，同時(shí)大鼠血清中MDA含量減少、SOD活性增強(qiáng)。結(jié)果表明:SI的改善學(xué)習(xí)記憶作用可能與其提高機(jī)體SOD等抗氧化酶活力，降低MDA等代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，增強(qiáng)其對(duì)自由基的清除能力，抑制脂質(zhì)過氧化作用，保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞免受自由基的損害有關(guān)。

大豆異黃酮為雜環(huán)多酚類化合物，為非甾體類激素，其主要成分是三羥異黃酮、二羥異黃酮和6-甲氧基大豆素。它們的結(jié)構(gòu)與17B-雌二醇相似，可與ER結(jié)合，表現(xiàn)弱雌激素作用。本研究結(jié)果顯示SI作為一種植物雌激素［10］，它的抗衰老作用與穩(wěn)定細(xì)胞膜、抗氧化如清除過氧化氫、過氧化物陰離子和羥自由基有關(guān)。

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