海帶夏季育苗系統(tǒng)褐藻酸降解菌數(shù)量組成分析

王偉偉,王娜,張壯志,曹增梅,曲艷艷,王青巖,李曉捷,曲善村

(山東東方海洋科技股份有限公司,國(guó)家海藻與海參工程技術(shù)研究中心,山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東煙臺(tái)264003)

海帶夏季育苗系統(tǒng)褐藻酸降解菌數(shù)量組成分析

王偉偉,王娜,張壯志,曹增梅,曲艷艷,王青巖,李曉捷,曲善村

(山東東方海洋科技股份有限公司,國(guó)家海藻與海參工程技術(shù)研究中心,山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東煙臺(tái)264003)

為研究褐藻酸降解菌對(duì)海帶Saccharina japonica夏季育苗的影響及其與病害間的關(guān)系,全程跟蹤監(jiān)測(cè)育苗池水與苗簾上的可培養(yǎng)好氧異養(yǎng)細(xì)菌 (heterotrophic aerobic bacteria,H)和褐藻酸降解菌 (alginic acid decomposing bacteria,A)的數(shù)量變化,并對(duì)褐藻酸降解菌菌群組成進(jìn)行初步分析。結(jié)果表明:孢子采苗使苗簾上好氧異養(yǎng)細(xì)菌量和褐藻酸降解菌量比附苗前明顯增加,其中褐藻酸降解菌菌群的高活性+中活性菌的A/H值是附苗前的2.05倍;育苗池水與苗簾好氧異養(yǎng)細(xì)菌量在育苗期間相對(duì)穩(wěn)定,分別為103～104cfu/mL和106～107cfu/g;苗簾A/H值在育苗前期呈下降趨勢(shì),在第21～28天出現(xiàn)峰值 (36.98% ～38.82%),高活性菌的比例增加1倍以上,這些變化與幼苗發(fā)生變形爛病較重的時(shí)間段一致;而育苗池水A/H峰值滯后,出現(xiàn)在第28天 (53.33%),育苗池水與苗簾在育苗中后期 A/H值均較高 (分別為27.63%～43.67%和31.38%～40.56%),褐藻酸降解菌菌群組成在育苗前期以低活性菌為主,中后期高、中活性菌增長(zhǎng)為優(yōu)勢(shì)菌,這可能是后期出現(xiàn)幼苗柄部病爛或脫苗的重要影響因素;16S rDNA測(cè)序比對(duì)結(jié)果表明,部分高活性褐藻酸降解菌與交替單胞菌屬和假交替單胞菌屬同源性高,但其降解能力與感染性存在菌株間差異。研究表明,褐藻酸降解菌數(shù)量、群落組成變化應(yīng)是育苗生產(chǎn)過程中的重要生物監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

海帶;夏季育苗;褐藻酸降解菌;好氧異養(yǎng)細(xì)菌

為減輕海藻養(yǎng)殖業(yè)中的病害損失,病原菌的鑒定、致病機(jī)制和大型海藻的免疫防御機(jī)制研究已成為海藻病害防治研究的重點(diǎn)與焦點(diǎn)[1-3]。目前,人工育苗作為中國(guó)海帶Saccharina japonica養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的首要環(huán)節(jié),病害防治問題日益突出,除不斷優(yōu)化管理技術(shù)措施外,病害發(fā)生時(shí)對(duì)養(yǎng)殖系統(tǒng)細(xì)菌及特殊條件下優(yōu)勢(shì)菌群的數(shù)量與分布跟蹤研究,以及分析病原菌與病害間的關(guān)系[4-6],應(yīng)成為海帶苗期病害防治的重要手段。

褐藻酸降解菌是海水與藻體表面的主要組成菌群,它與其他異養(yǎng)細(xì)菌的主要區(qū)別是具有降解褐藻酸的能力,該菌種類繁多,包括交替單胞菌屬Alteromonas、假交替單胞菌屬Pseudoalteromonas、弧菌屬Vibrio、糖噬胞菌屬Saccharophagus、黃桿菌屬Flavobacterium等[7-11]。已有研究表明,褐藻酸降解菌是海帶育苗與養(yǎng)殖過程中脫苗與爛苗等病害發(fā)生的重要影響因素[4,12-13],但目前尚無對(duì)其致病條件、侵染機(jī)理和海藻防御機(jī)制的系統(tǒng)研究。尤其是對(duì)海帶苗期病害發(fā)生的基本原因認(rèn)識(shí)不足,而且育苗病害病情不斷變化,普遍做法是從管理措施上嚴(yán)加控制,但實(shí)際效果不佳,特別在循環(huán)海水育苗系統(tǒng)中收效甚微。本研究中從種海帶孢子采苗開始,對(duì)海帶夏季循環(huán)海水育苗系統(tǒng)中好氧異養(yǎng)細(xì)菌與褐藻酸降解菌的數(shù)量及其分布特點(diǎn)進(jìn)行了為期2個(gè)多月的跟蹤監(jiān)測(cè),并對(duì)褐藻酸降解菌菌群組成進(jìn)行初步分析,以探討褐藻酸降解菌與病害發(fā)生的相互關(guān)系,建立育苗系統(tǒng)中微生物的監(jiān)測(cè)指標(biāo),以期為海帶夏季育苗管理與防病提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)于2015年7月末—10月初在山東東方海洋科技股份有限公司牟平分公司海帶育苗車間進(jìn)行孢子采苗及育苗。采苗時(shí)選擇生長(zhǎng)狀況良好的種海帶,除掉葉邊與病爛部分,然后用海水多次洗刷,移到放散池,其采苗方法與長(zhǎng)海帶[14]基本相同。主要試驗(yàn)材料為:采集于放散池中的種海帶葉片、假根,附苗前處理好的海水與棕繩苗簾,附苗用的孢子水以及附苗后的棕繩苗簾。

1.2 方法

育苗期間進(jìn)行育苗池水與棕繩苗簾跟蹤監(jiān)測(cè), 每7 d采樣1次,共采集3個(gè)車間。每次固定采集每個(gè)育苗車間 (階梯式育苗池,共6排,每排22個(gè)育苗池)的第1、3、6排各3個(gè)育苗池的池水與苗簾樣品,每排采集的3個(gè)樣品合為1個(gè)樣本,用于可培養(yǎng)細(xì)菌檢測(cè)。取3個(gè)車間的平均值作為每次采樣池水或苗簾的計(jì)數(shù)結(jié)果。

1.2.1 細(xì)菌計(jì)數(shù) 將種海帶、苗簾等固體樣本稱重后,用無菌海水漂洗除去附著的其他污染物,然后加入適量無菌海水,用滅菌的研磨棒研磨。用無菌移液管取上清液0.1 mL及適度稀釋液分別涂布于2216E培養(yǎng)基與褐藻酸鈉固體培養(yǎng)基[(NH4)2SO45 g,K2HPO40.2 g,MgSO4·7H2O 1 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,NaCl 30 g,褐藻酸鈉5 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 L]上,在28℃下培養(yǎng)5～7 d。換算為每克樣品的細(xì)菌數(shù)量。水樣用無菌海水稀釋適當(dāng)倍數(shù)同樣涂布于2216E培養(yǎng)基與褐藻酸鈉固體培養(yǎng)基上,換算為每毫升水樣細(xì)菌數(shù)量。2216E培養(yǎng)平板的菌落計(jì)數(shù)為好氧異養(yǎng)細(xì)菌量,褐藻酸鈉固體培養(yǎng)平板的菌落計(jì)數(shù)為褐藻酸降解菌量。

1.2.2 褐藻酸降解菌與好氧異養(yǎng)細(xì)菌的測(cè)定及其比值 (A/H)的計(jì)算 根據(jù)改良后的A/H測(cè)定方法[13]進(jìn)行。從2216E平板中選擇菌落數(shù)目適中的平板,從中逐一挑取全部單菌落,分別接種到富營(yíng)養(yǎng)褐藻酸鈉培養(yǎng)基 (0.5%蛋白胨,0.1%酵母浸粉,0.5%褐藻酸鈉,2%瓊脂,其中褐藻酸鈉用1/2體積的淡水溶解后加入NaCl調(diào)至3%濃度,其余成分用1/2體積海水溶解),15℃下培養(yǎng)7 d。用盧戈試劑法鑒定褐藻酸降解活性[15],即用稀釋的盧戈試劑覆在培養(yǎng)基表面,菌落周圍出現(xiàn)透明活性圈即表示該菌落為褐藻酸降解菌,計(jì)算褐藻酸降解菌株數(shù) (alginic acid decomposing bacteria,A)與好氧異養(yǎng)細(xì)菌株數(shù) (heterotrophic aerobic bacteria,H)的百分比值 (A/H)。

本試驗(yàn)中,人為劃定活性圈直徑≥15 mm的菌落為高活性褐藻酸降解菌 (HA);活性圈直徑＜15 mm,但活性圈邊界清晰的菌落為中活性菌(MA);有活性,但活性圈模糊、無明確邊界線的菌落為低活性菌 (LA)。統(tǒng)計(jì)3種活性褐藻酸降解菌在好氧異養(yǎng)細(xì)菌中的比例,并分析褐藻酸降解菌群落組成變化。

1.2.3 褐藻酸降解菌降解能力分析與感染試驗(yàn)將部分在培養(yǎng)基平板上降解活性高的菌株分離純化,然后以1×106cfu/mL菌量接種到富營(yíng)養(yǎng)褐藻酸鈉液體培養(yǎng)基中,在28℃下培養(yǎng)2 d,每組設(shè)3個(gè)平行。培養(yǎng)液以12 000 r/min離心,取上清液, 用3,5-二硝基水楊酸 (DNS)法 (http:// www.docin.com/p-472416269.html)測(cè)定其還原糖濃度,以進(jìn)一步確定褐藻酸降解菌活性。用篩選出的高活性菌進(jìn)行海帶組織塊感染試驗(yàn),具體操作方法如下:取健康海帶孢子體 (長(zhǎng)為50～60 cm),除梢部、假根和葉片邊緣部分,用滅菌海水反復(fù)擦洗,于無菌培養(yǎng)皿中切成邊長(zhǎng)約1 cm的小塊,然后在海帶塊表面做3～4處小切口處理,并接種活化好的由上述方法篩選出的5株褐藻酸降解菌,以未接種菌的海帶組織塊作為對(duì)照組。上述操作均按照無菌操作規(guī)則進(jìn)行。每株菌設(shè)2個(gè)平行,每個(gè)平行接種10塊。在水溫為15℃、接種菌為20 μmol/(m2·s)的條件下培養(yǎng)8 d,定期觀測(cè)。

1.2.4 褐藻酸降解菌的分子鑒定 將篩選出的菌株進(jìn)行DNA提取 (SDS法),然后選用16S rDNA通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增[16],其中退火溫度為55℃。PCR產(chǎn)物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序,并將其測(cè)序結(jié)果在NCBI(National Center for Biotechnology Information)基因數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有測(cè)定數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean± S.D.)表示,并利用SPSS 15.0軟件和Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與作圖。將測(cè)得的16S rDNA序列用BLAST程序在NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性比較,采用MEGA 5.0軟件中Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 采苗系統(tǒng)中的菌量

采苗系統(tǒng)菌量分布與A/H值變化分別見表1和圖1。結(jié)果表明,不易洗刷的海帶假根比葉片的菌量高1個(gè)數(shù)量級(jí)以上,且A/H值高出16.47%,主要差異表現(xiàn)在其高活性褐藻酸降解菌 (相差13%)。孢子放散后形成的孢子水與附苗后苗簾的好氧異養(yǎng)細(xì)菌量和褐藻酸降解菌量分別比孢子放散前處理好的海水與附苗前苗簾明顯增加;附苗前海水與苗簾主要以低活性褐藻酸降解菌為主,孢子水中褐藻酸降解菌總A/H值較附苗前海水增加了12.34%,主要增量為高活性菌 (增加了 5.91 倍);附苗后苗簾上總A/H值較附苗前僅增長(zhǎng)了3.78%,但高活性菌+中活性菌的A/H值之和是附苗前的2.05倍。

表1 海帶采苗系統(tǒng)中細(xì)菌數(shù)量的分布Tab.1 Quantity distribution of bacteria in seedling collection system of kelp Saccharina japonica

圖1 海帶采苗系統(tǒng)A/H值的變化Fig.1 Variations in number of heterotrophic aerobic bacterium/number of alginic acid decomposing bacterium(A/H) value in seedling collection system of kelp Saccharina japonica

2.2 育苗池水中的菌量

育苗期間,池水中好氧異養(yǎng)細(xì)菌與褐藻酸降解菌量變化如圖2所示。好氧異養(yǎng)細(xì)菌除在育苗第7天、第28天和最后一次采樣時(shí)達(dá)到104cfu/mL數(shù)量級(jí)外,整個(gè)育苗期間保持穩(wěn)定 (103cfu/mL);褐藻酸降解菌量除在培養(yǎng)前期 (0～7 d)較高外,整個(gè)育苗期間菌量保持102cfu/mL(圖2-A)。但A/H值從育苗的第21天左右開始上升,第28天達(dá)到峰值(3種活性菌之和為53.33%),此時(shí)期內(nèi)主要是低活性菌和中活性菌的大幅增加;其后近1個(gè)月時(shí)間保持高A/H值(27.63%～43.69%),此時(shí)期顯著特征是高活性菌的比例呈快速上升趨勢(shì), 第49天時(shí)其占菌量比例達(dá)到25.76%(圖2-B)。

圖2 育苗池水中菌量、A/H值隨時(shí)間的變化Fig.2 Temporal variations in amount of bacteria and A/H in seedling seawater with time

2.3 育苗苗簾的菌量

育苗簾上的菌量比池水高2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。好氧異養(yǎng)細(xì)菌除最后一次采樣菌量增加明顯外,育苗期間苗簾菌量在106～107cfu/g變化;育苗期間除第0天 (采苗)外,褐藻酸降解菌量在105～106cfu/g波動(dòng) (圖3-A)。但A/H值結(jié)果表明,育苗期間苗簾褐藻酸降解菌量與菌群組成隨時(shí)間變化明顯 (圖3-B)。采苗后苗簾的A/H值為38.81%,在前期14 d的育苗過程中A/H值呈下降趨勢(shì),降幅達(dá)到10.53%;第14～21天期間,苗簾A/H值快速上升,第21～28天期間,A/H值為36.98%～38.82%,高活性菌比例增加1倍以上,第21天是褐藻酸降解菌菌群組成的轉(zhuǎn)折點(diǎn),這之前菌群以低活性菌為主,之后高活性菌+中活性菌占優(yōu)勢(shì);第35天時(shí)A/H出現(xiàn)最低值,同育苗池水中菌量下降的時(shí)間一致,這可能與臭氧處理水等操作有關(guān)。試驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn),育苗第15～16天以后幼苗變形爛(又稱畸形腫大病、畸形病爛)零星出現(xiàn),第20～28天時(shí)幼苗變形爛發(fā)病較為嚴(yán)重,育苗第30～35天后變形爛減緩直至消失?？梢钥闯?苗簾A/H變化與變形爛發(fā)病在時(shí)間上具一致性,而池水的A/H結(jié)果相對(duì)滯后 (圖2-B)。育苗中后期苗簾上A/H值保持在31.38%～40.56%,但高活性菌+中活性菌 (二者之和為21.47%～30.83%)增長(zhǎng)成為優(yōu)勢(shì)菌,這可能是育苗后期出現(xiàn)幼苗柄部病爛或脫苗的重要影響因素。

圖3 育苗苗簾上菌量、A/H值隨時(shí)間的變化Fig.3 Temporal variations in amount of bacteria and A/H on palm curtains with time

2.4 褐藻酸降解菌株的降解能力及其分子鑒定

對(duì)褐藻酸降解菌的分析表明,A5、A24、A33 3株菌的降解能力明顯高于其他菌株,其次為A7 和A31菌株,其余菌株在液體培養(yǎng)基中的降解能力較小或不表現(xiàn)出降解活性 (圖4)。對(duì)A5、A24、A33、A7、A31 5株菌的感染試驗(yàn)結(jié)果表明,感染第1天時(shí)組織塊無明顯癥狀,第2～3天時(shí)切口部位褐色開始褪去,第5～6天后感染組織塊數(shù)均迅速增加且褪色區(qū)域增大,第7～8天時(shí)出現(xiàn)病爛,其中A5、A24、A33組病變過程較快,A7和A31組次之,對(duì)照組最慢,這與液體培養(yǎng)基中降解能力分析結(jié)果一致。

圖4 褐藻酸降解菌的降解能力比較Fig.4 Comparison of decomposing activity in alginic acid decomposing bacteria

對(duì)5株褐藻酸降解菌的16S rDNA進(jìn)行測(cè)序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖5)。從圖5可見,A31、A33首先聚為一支,然后再和A7聚為一支,A7、A31 和A33均屬于交替單胞菌屬Alteromonas,且A31、A33株菌落色素 (黃色)與A7(乳白色)明顯不同,故A31、A33株與A7不屬于一個(gè)種,A31、A33株一致性為97%;而A5和A24聚為另一支,均屬于假交替單胞菌屬Pseudoalteromonas(一致性為99%)。

圖5 基于16S rDNA序列的5株細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of 5 bacterial strains based on 16S rDNA sequences

3 討論

3.1 褐藻酸降解菌對(duì)育苗的影響

海帶夏季育苗期間細(xì)菌監(jiān)測(cè)結(jié)果表明,褐藻酸降解菌是海帶、育苗海水和苗簾的主要棲居菌,其中交替單胞菌屬和假交替單胞菌屬菌株表現(xiàn)出較高的褐藻酸降解能力與感染性。有研究證實(shí),褐藻酸降解菌A.espejiana和A.baumann是海帶幼苗病爛和綠爛的病原菌[18-19],假交替單胞菌是海帶孔爛病害孢子體表面菌中的主要菌群[6],交替單胞菌是引起海帶配子體膨大死亡和孢子體白化病的病原菌[2,5]。還有研究表明,褐藻酸降解菌是海帶爛苗的條件致病菌[4],且不同菌株間表現(xiàn)出明顯的褐藻酸降解能力和感染性差異[4,18-19]。從本試驗(yàn)結(jié)果也可知,褐藻酸降解菌在育苗初期與中期的個(gè)別時(shí)間段內(nèi)并沒有引起病害發(fā)生,感染試驗(yàn)也表明,菌株間致病性有明顯差異。從苗簾A/H峰值與變形爛發(fā)病在時(shí)間上的一致性來看,褐藻酸降解菌異常增殖與變形爛間存在密切聯(lián)系,但因此時(shí)海帶幼苗只能在顯微鏡下觀察及試驗(yàn)條件的限制,無法對(duì)褐藻酸降解菌致病機(jī)理做一步研究。但有感染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn):感染第3天時(shí),褐藻酸降解菌在有傷口海帶的內(nèi)皮層聚集,造成個(gè)別細(xì)胞破裂,形成空腔;第5天時(shí)內(nèi)皮層細(xì)胞完全破碎,而表皮細(xì)胞相對(duì)完好[7,20]。另外,褐藻酸降解菌不僅能利用褐藻酸,還能利用褐藻糖膠、淀粉、甘露醇和海帶多糖等成分[5,10],而這些物質(zhì)均是海帶的重要組成成分,這可能也是褐藻酸降解菌對(duì)藻類的重要感染途徑。從褐藻酸降解菌與好氧異養(yǎng)細(xì)菌的比值來看,海帶養(yǎng)殖區(qū)海水和藻體的A/H值分別為30%～80%和35% ～90%[13],脫落爛苗上的比值達(dá)到61.98%[4]。本試驗(yàn)育苗期間,育苗池水與苗簾的A/H最高值雖僅為53.33%和40.56%,但育苗系統(tǒng)菌群有一個(gè)重要特征,即隨育苗時(shí)間的延長(zhǎng),高活性褐藻酸降解菌呈上升趨勢(shì)。研究表明,人工育苗系統(tǒng)中褐藻酸降解菌菌落形態(tài)與培養(yǎng)特征雖較為單一,但多數(shù)菌株均有強(qiáng)烈降解褐藻酸鈉和海帶藻體的特點(diǎn),育苗后期具有較強(qiáng)降解能力的褐藻酸降解菌的比例高達(dá)95.6%[12]。由此可知,正常海帶、海水中均自然存在較高數(shù)量級(jí)的褐藻酸降解菌,正常情況下不會(huì)對(duì)育苗造成明顯的影響。但隨著育苗時(shí)間的延長(zhǎng),高活性褐藻酸降解菌的比例增加,再加上育苗條件惡化 (如密度過大、損傷等使海帶的抵抗力下降),細(xì)菌就易于侵入并大量繁殖,從而導(dǎo)致病害發(fā)生。

3.2 對(duì)海帶夏季育苗期的管理建議

采苗過程中為了操作上的方便,往往會(huì)保留種海帶假根與養(yǎng)殖繩,但對(duì)其上細(xì)菌的分析發(fā)現(xiàn),假根與養(yǎng)殖繩的菌量要比海帶葉片高出1～2個(gè)數(shù)量級(jí)以上,A/H值和高活性褐藻酸降解菌均比葉片明顯增加,且這些部分不易清洗。種海帶的菌量與組成成為育苗早期病害的潛在因素,這一問題值得注意。因此,建議采苗時(shí)將假根、養(yǎng)殖繩、海帶邊緣和病爛部分一起去除,加大清洗力度,減少附苗后苗簾上的菌量。

從育苗期間跟蹤監(jiān)測(cè)結(jié)果來看,育苗池水與苗簾的好氧異養(yǎng)細(xì)菌量較為穩(wěn)定,而褐藻酸降解菌數(shù)量與菌群組成均隨育苗時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生變化。育苗海水中褐藻酸降解菌量前期保持穩(wěn)定,且以低活性菌為主,第28天時(shí)出現(xiàn)峰值,隨后保持高A/H 值,高活性菌量迅速增加,成為優(yōu)勢(shì)菌;苗簾上菌量比育苗海水高2～3個(gè)數(shù)量級(jí),育苗初始階段受采苗的影響菌量較高,但隨育苗系統(tǒng)低溫運(yùn)行后呈下降趨勢(shì),且以低活性菌為主,第21～28天時(shí)菌量異常增殖且高、中活性褐藻酸降解菌成為主要組成菌。這一時(shí)期又正是幼苗變形爛發(fā)病最重的階段,表明褐藻酸降解菌的異常增殖可能對(duì)育苗造成危害。育苗水循環(huán)系統(tǒng)中,在第27～39天時(shí)增加臭氧設(shè)備,處理1/3體積量的循環(huán)水,這是育苗海水和苗簾褐藻酸降解菌第35天時(shí)出現(xiàn)低谷的原因,患變形爛病的幼苗數(shù)量下降直至消失。隨后停止臭氧處理循環(huán)海水,A/H值快速恢復(fù),此時(shí)菌量大幅增殖因其協(xié)迫條件解除。育苗后期,高、中活性菌增長(zhǎng)可能是幼苗柄部病爛或脫苗的重要影響因素。綜上所述,育苗系統(tǒng)中特別是苗簾褐藻酸降解菌數(shù)量和菌群組成的變化與病害發(fā)生有密切關(guān)系,應(yīng)是育苗過程中重要的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),育苗海水與苗簾樣品的褐藻酸鈉固體篩選培養(yǎng)基計(jì)數(shù)結(jié)果和A/H值分析結(jié)果有著明顯差異,前者在育苗期間變化較小,而A/H值分析不僅能反映出褐藻酸降解菌的數(shù)量變化,還能通過降解活性分析褐藻酸降解菌群落的變化,為育苗生產(chǎn)提供參考。盧戈試劑染色法能快速、有效地利用普通培養(yǎng)基從環(huán)境樣品中將褐藻酸降解菌與其他菌分開,尤其在大量篩菌時(shí)更簡(jiǎn)單有效[21]。本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn),如果將環(huán)境樣品直接涂板,然后染色,會(huì)因菌株活性圈的重疊而影響計(jì)數(shù),而從2216E板轉(zhuǎn)移菌落的方法耗時(shí)較長(zhǎng),造成結(jié)果在時(shí)間上是滯后的。另外,培養(yǎng)平板染色結(jié)果不能完全反映菌株的降解能力與致病性,尚需進(jìn)一步地試驗(yàn)加以證明。

4 結(jié)論

對(duì)海帶夏季育苗系統(tǒng)細(xì)菌監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn),除采苗過程使苗簾的菌量增加外,育苗系統(tǒng)中好氧異養(yǎng)細(xì)菌量相對(duì)穩(wěn)定,而褐藻酸降解菌數(shù)量與組成則隨育苗時(shí)間發(fā)生變化,且與育苗期間病害發(fā)生事件有著密切聯(lián)系。褐藻酸降解菌與好氧異養(yǎng)細(xì)菌比值 (A/H 值)不僅能反映出育苗系統(tǒng)中褐藻酸降解菌量的變化,還初步反映了其菌群落組成變化,應(yīng)當(dāng)成為海帶育苗期間一個(gè)重要的管理指標(biāo),為生產(chǎn)提供防病預(yù)警信息。目前,仍缺乏對(duì)褐藻酸降解菌致病機(jī)理的系統(tǒng)研究,且其指標(biāo)的測(cè)定在時(shí)間上較為滯后。建議解決此問題的同時(shí),進(jìn)一步深入研究褐藻酸降解菌致病機(jī)制與海藻免疫防御機(jī)制。

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Quantity and composition of alginic acid decomposing bacterial community in summer seedling system of kelp Saccharina japonica

WANG Wei-wei,WANG Na,ZHANG Zhuang-zhi,CAO Zeng-mei, QU Yan-yan,WANG Qing-yan,LI Xiao-jie,QU Shan-cun

(National Engineering and Technique Research and Development Center of Algae and Sea Cucumber of China,Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Efficient Culture of Marine Algae of Shandong,Shandong Oriental Ocean Sci-tech Company Limited,Yantai 264003,China)

The community composition,quantity and temporal variations in culturable heterotrophic aerobic bacteria (H)and alginic acid decomposing bacteria(A)were surveyed in seawater and palm curtains used in summer seedling of kelp Saccharina japonica to discuss the relationship between diseases during summer seedling and the bacteria.The results showed that the heterotrophic aerobic bacteria and alginic acid decomposing bacteria were increased an order of magnitude on the palm curtains attached by kelp spores compared to the palm curtain without kelp spores,and the A/H ratio of high and middle hydrolysis activity of bacteria was increased by 2.05 times on the palm curtains attached by kelp spores.No significant changes in umber of heterotrophic aerobic bacteria in the seedling seawater and palm curtains were observed,fluctuating 103-104cfu/mL and 106-107cfu/g,respectively during summer seedling.A/H ratio of the palm curtain was shown to be a downward trend in the early seedling,a peak(36.98%-38.82%)during 21-28 days,the proportion of bacteria with high hydrolysis activity being increased by more than one time.These changes were consistent with the occurrence of malformation disease in term of time,showing a close link between the proliferation of alginic acid decomposing bacteria and the disease of young spore.But A/H ratio of seedling seawater lagged,a peak in the 28 day(53.33%).A/H proportion in seedling seawater and palm curtains had high values(27.63%-43.67%and 31.38%-40.56%,respectively)in the middle and late seedling period.Low hydrolysis activity bacteria was dominant in the early,whereas high and middle hydrolysis activity bacteria ascended to the predominant bacteria in the middle and late seedling periods,which is involved in stipe rot or sporeling detachment disease.The 16S rDNA gene sequence alignment showed that alginic acid decomposing bacteria with high activity and infectivity had high homology with Alteromonas and Pseudoalteromonas,and that there were differences in hydrolysis activity and infectivity among strains.Therefore,the variations in quantity and community composition of alginic acid decomposing bacteria would be the important biological indicators for kelp seedling.

Saccharina japonica;summer seedling;alginic acid decomposing bacterium;heterotrophic aerobic bacterium

S946.1

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.01.005

2095-1388(2017)01-0026-07

2016-04-18

國(guó)家 “十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目 (2012BAD55G01);國(guó)家 “863”計(jì)劃項(xiàng)目 (2012AA10A406);煙臺(tái)市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013LGS002)

王偉偉 (1979—),女,工程師。E-mail:wangww2008@126.com

李曉捷 (1970—),女,博士,研究員。E-mail:yeslxj@sina.com