甘藍(lán)型油菜pol-CMS雜交種純度SSR鑒定與田間鑒定單株吻合率研究

王同華，陳衛(wèi)江，王建喜

（湖南省作物研究所，湖南 長(zhǎng)沙410125）

利用雜種優(yōu)勢(shì)是提高油菜產(chǎn)量的重要途徑。目前，我國(guó)的油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用主要有細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）、細(xì)胞核雄性不育（GMS）、自交不親和（SI）和化學(xué)殺雄等途徑[1]。其中，在我國(guó)目前生產(chǎn)應(yīng)用中以波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育（pol-CMS）雜種為主導(dǎo)類型。但該類型雜交種母本不育系育性存在溫度敏感的特性[1-2]，即低溫條件下易出現(xiàn)育性恢復(fù)現(xiàn)象，并以自交方式產(chǎn)生母本假雜種，嚴(yán)重影響雜交種的純度。因此，對(duì)雜交種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的純度鑒定，是確保油菜安全生產(chǎn)的重要保證。

目前，我國(guó)油菜種子純度鑒定仍以傳統(tǒng)的田間種植鑒定為主，該方法雖簡(jiǎn)單直觀，但需要耗時(shí)近一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)，不適合當(dāng)前“北制南用”的雜交種生產(chǎn)需求。因此，快速、準(zhǔn)確的種子純度檢測(cè)方法顯得十分重要。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)在研究中的應(yīng)用越來(lái)越廣。其中，SSR標(biāo)記具有數(shù)量豐富、共顯遺傳、穩(wěn)定性好[3-5]，且已經(jīng)具備簡(jiǎn)單快速的分析方法[6-7]，在油菜種子純度鑒定中已作為的首選標(biāo)記得到廣泛應(yīng)用。但與其他作物一樣，油菜SSR標(biāo)記鑒定結(jié)果也存在與田間鑒定結(jié)果不吻合的現(xiàn)象[7-9]，而以往的報(bào)道多側(cè)重樣品結(jié)果的群體間對(duì)應(yīng)研究，大多采用回歸方程對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正，而對(duì)該兩種鑒定方法間單株吻合率的研究報(bào)道甚少。研究以長(zhǎng)江中游區(qū)推廣面積較大的3個(gè)甘藍(lán)型油菜pol-CMS雜交品種為對(duì)象，通過(guò)分析雜交制種樣品SSR鑒定和田間鑒定的單株一一對(duì)應(yīng)分析，更有效地探討SSR標(biāo)記技術(shù)在油菜雜交種純度鑒定應(yīng)用中的準(zhǔn)確性，旨在為我國(guó)油菜雜交種的生產(chǎn)與銷售提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為灃油737、豐油701、灃油520三個(gè)甘藍(lán)型油菜pol-CMS雜交品種及其親本相關(guān)信息見(jiàn)下表1，其中每品種取4份雜交制種樣品，每份樣品隨即取400粒種子播種于湖南省作物研究所試驗(yàn)場(chǎng)。每份待測(cè)樣品鑒定小區(qū)8行，行長(zhǎng)2.0m，行距0.5m，均勻播種，全生育期不間苗。

表1 供試雜交油菜品種的父母本及審定情況

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品DNA提取 在供試材料生長(zhǎng)至9～11葉期時(shí)，從每個(gè)鑒定小區(qū)一端順序數(shù)192個(gè)單株進(jìn)行吊牌編號(hào)，并取中間幼嫩葉片2 cm2左右于2.0 mL離心管中，－20℃保存用于SSR標(biāo)記檢測(cè)。DNA提取參照王同華等[7]報(bào)道的簡(jiǎn)便方法進(jìn)行。

1.2.2 SSR分析 試驗(yàn)所用112對(duì)SSR引物序列來(lái)源于http://uksrop.net，并由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。SSR-PCR反應(yīng)體系參照陸光遠(yuǎn)等[6]報(bào)道的方法進(jìn)行，PCR產(chǎn)物經(jīng)3%的瓊脂糖凝膠電泳分離，并用紫外成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察讀帶。SSR純度（%）=（檢測(cè)株數(shù)－母本帶型數(shù)－父本帶型數(shù)）×100/檢測(cè)株數(shù)。

1.2.3 田間鑒定 在供試材料發(fā)育至盛花期時(shí)，將上述192個(gè)吊牌編號(hào)的單株，根據(jù)育性表現(xiàn)進(jìn)行調(diào)查，田間鑒定純度（%）=（檢測(cè)株數(shù)－不育株數(shù)－異型株數(shù)）×100/檢測(cè)株數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物篩選

研究利用112對(duì)SSR引物對(duì)供試3個(gè)雜交品種的父母本間進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選到可將灃油737、豐油701、灃油520雜交種與母本區(qū)分開(kāi)的引物分別為3、7、3個(gè)。根據(jù)帶型清晰度、主帶差異大小和穩(wěn)定性，最終確定以SSR引物CB10373、Na10-D09、CN48分別作為灃油737、豐油701、灃油520的雜交種純度鑒定引物（見(jiàn)圖1）。其中引物CB10373在灃油737母本擴(kuò)增出200 bp的片段，而在父本擴(kuò)增出200 bp與220 bp的2個(gè)片段；引物Na10-D09在豐油701母、父本間分別擴(kuò)增出250 bp、170 bp的片段；引物CN48在灃油520母、父本間分別擴(kuò)增出170 bp、2 100 bp的片段。因此，該3個(gè)SSR引物可以用于3個(gè)供試雜交品種的純度鑒定。

圖1 三對(duì)SSR引物對(duì)供試品種父母本DNA的PCR擴(kuò)增

2.2 SSR鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果的群體對(duì)比

利用篩選得到的SSR引物對(duì)供試材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè)均得到清晰、穩(wěn)定的條帶（部分?jǐn)U增結(jié)果見(jiàn)圖2），可以確保SSR標(biāo)記鑒定過(guò)程無(wú)讀帶偏差出現(xiàn)。從表2中可以看出，SSR標(biāo)記鑒定和田間種植鑒定的結(jié)果高度一致，12個(gè)供試樣品中有8個(gè)結(jié)果完全相同，其他4個(gè)樣品的鑒定結(jié)果差異在2%以內(nèi)，兩種鑒定方法的平均偏差僅為0.35%，表明SSR標(biāo)記鑒定結(jié)果與大田種植鑒定的結(jié)果是一致的。此外，對(duì)12個(gè)樣品的鑒定數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可以看出存在差異的4個(gè)樣品的鑒定純度均較差，在田間種植鑒定中主要表現(xiàn)為異型株，而在SSR標(biāo)記鑒定中可能表現(xiàn)為父本或母本帶型。

圖2 引物CB10373對(duì)供試樣品Y2的SSR-PCR擴(kuò)增

2.3 SSR鑒定單株與田間鑒定單株結(jié)果吻合率分析

從田間種植鑒定和SSR標(biāo)記鑒定結(jié)果對(duì)比分析結(jié)果（表2）中可以看出，12份供試樣品的單株吻合率均在97%以上，其中有6個(gè)樣品的吻合率為100%。其中，不吻合情況主要有可育株數(shù)檢成母本帶型、不育株檢成雜交種帶型、異型株數(shù)檢成雜交種帶型3種情況。對(duì)不吻合單株的表現(xiàn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)上述3種情況的出現(xiàn)呈隨機(jī)狀態(tài)，沒(méi)有明顯的規(guī)律性。造成兩種鑒定結(jié)果不吻合的原因可能與農(nóng)藝性狀與分子標(biāo)記間不關(guān)聯(lián)、雜種親本的純合程度、制種田塊自生苗類型以及制種環(huán)境的影響等因素有關(guān)，其確切原因需要進(jìn)一步研究。

3 討論

利用SSR標(biāo)記鑒定甘藍(lán)型油菜雜交種具有簡(jiǎn)便、快速、不受環(huán)境因素影響、鑒定結(jié)果穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，目前在油菜雜交種純度鑒定中已廣泛應(yīng)用[5，10]。以往關(guān)于SSR標(biāo)記在作物種子純度鑒定的準(zhǔn)確性研究主要集中在與田間種植鑒定純度結(jié)果的群體間對(duì)應(yīng)上，研究者通常利用SSR標(biāo)記和田間種植鑒定結(jié)果對(duì)比，建立回歸方程以校正兩種方法的鑒定誤差。筆者認(rèn)為這種做法存在著一定的局限性：首先，種植鑒定受土壤、肥力和氣候等條件影響，弱苗和不能成苗的種子得不到準(zhǔn)確觀測(cè)值，而室內(nèi)SSR標(biāo)記鑒定可對(duì)這部分種子作出準(zhǔn)確判斷，得到樣品的原始純度；其次，種植鑒定與室內(nèi)SSR標(biāo)記鑒定是對(duì)同一樣品的不同次抽樣鑒定，抽樣誤差也可導(dǎo)致鑒定結(jié)果出現(xiàn)偏差。另外，種植鑒定主要根據(jù)品種形態(tài)特征和生物學(xué)性狀進(jìn)行判定，受檢測(cè)人員經(jīng)驗(yàn)水平和樣品親本的遺傳差異度影響較大，也是造成結(jié)果差異的重要原因。鑒于此，研究以甘藍(lán)型油菜雜交種樣品同一抽樣樣品田間單株為研究對(duì)象，通過(guò)SSR標(biāo)記和田間種植鑒定的一一對(duì)比分析，結(jié)果表明該兩種方法鑒定結(jié)果具有高度的一致性，證明利用SSR標(biāo)記鑒定甘藍(lán)型油菜雜交種的純度是準(zhǔn)確可靠的。

表2 田間種植鑒定和SSR標(biāo)記鑒定的純度結(jié)果

表3 供試樣品的田間種植鑒定和SSR標(biāo)記鑒定單株吻合率結(jié)果

對(duì)于研究中出現(xiàn)的極少數(shù)不吻合單株，筆者認(rèn)為主要有3個(gè)方面的原因：一方面為制種田或鑒定田自生苗的干擾，表現(xiàn)為SSR母本帶型單株育性表現(xiàn)卻正常；另一方面，制種環(huán)境隔離不當(dāng)導(dǎo)致無(wú)恢復(fù)基因外源花粉漂入，可能造成SSR雜種帶型單株卻表現(xiàn)為不育；此外，來(lái)自收獲、晾曬、運(yùn)輸和包裝過(guò)程的機(jī)械混雜，在SSR鑒定中可能表現(xiàn)為父母本或雜交種帶型，也是造成鑒定結(jié)果不吻合的因素。因此，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中要綜合考慮制種環(huán)境、管理措施的影響，根據(jù)需要對(duì)兩種鑒定方法綜合應(yīng)用，以確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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