金柑抗凍實驗模型的建立

郭 純 ，楊 華 ，饒力群 ，李夢蕓，馬珊珊

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；3.湖南洞庭藥業(yè)股份有限公司，湖南 常德 415001）

凍害是農(nóng)業(yè)氣象災害的一種。常發(fā)生的有越冬作物凍害、果樹凍害和經(jīng)濟林木凍害等[1-3]。凍害對農(nóng)業(yè)威脅很大，如美國的柑橘生產(chǎn)、中國的冬小麥和柑橘生產(chǎn)常因凍害而遭受巨大損失。歷史上，我國長江流域、美國柑橘產(chǎn)區(qū)就因嚴重的周期性凍害數(shù)次遭受嚴重打擊。自1949年以來，我國出現(xiàn)了5次柑橘大凍害（1955年，1969年，1977年，1992年和2008年），僅1992年1月的凍害使我國柑橘受凍面積達56萬hm2，產(chǎn)量損失超過200萬t；2008年1～2月的冰凍對幾個主要產(chǎn)區(qū)均造成嚴重影響，特別是湖南、湖北等地更為嚴重。湖北的三峽庫區(qū)、丹江庫區(qū)、富水庫區(qū)等柑橘集中產(chǎn)區(qū)75%以上的柑橘受到不同程度的凍害，其中有25%的柑橘受到毀滅性損害。湘西的柑橘產(chǎn)業(yè)也遭到了毀滅性打擊，受災面積達6.67萬hm2，成災4.73萬hm2，絕收近1.93萬hm2，直接經(jīng)濟損失約7億元。面對如此頻繁的災害影響，研究柑橘抗凍的機制顯得十分必要，而建立柑橘抗凍試驗模型則是研究柑橘抗凍機制的前提條件。試驗采用冷馴化誘發(fā)抗寒能力的金柑為實驗組[4]，以未冷馴化誘發(fā)抗寒能力的金柑為對照組，模擬柑橘越冬時氣溫低、土溫高的環(huán)境[5-6]，摸索金柑能耐受的最低溫度和低溫持續(xù)時間，以建立金柑抗凍實驗模型。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

挑選生長健壯、粗細較一致的2 a生金柑（Fortunella margarita(Lour.)Swingle）苗 200株，用缽高24 cm、缽開口直徑為24 cm規(guī)格的營養(yǎng)缽栽植，營養(yǎng)土為菜園土摻1/3的火土灰，采用一般的肥水管理和病蟲害防治。所有材料放置室溫28℃（室內(nèi)溫度變動26.5℃～29.5℃。）正常生長1個月后，隨機選取100株移入控溫室內(nèi)進行冷馴化，溫度設定為4℃，室內(nèi)溫度為3.5～6.0℃，時間15 d。

1.2 低溫處理

試驗材料在冷馴化半個月后，每3株用棉絮包裹營養(yǎng)袋及根頸，放入試驗改裝的控溫箱進行低溫處理?？販叵錅囟仍?～-20℃（溫度變化控制在±0.2℃）。以未冷馴化的金柑經(jīng)過不同時間不同溫度的低溫處理后作為對照，取樣進行生理生化分析，單株設3次重復。

1.3 細胞損傷分析

金柑受凍的葉片表現(xiàn)為水漬狀、透明，顏色加深呈墨綠色，質(zhì)感變薄，葉片上的細小白點消失，數(shù)小時后逐漸卷曲，2~3 d后葉片干枯。以成熟葉片是否凍死（處理后葉片卷曲、干枯）為標準，配合電解質(zhì)滲出率及丙二醛（MDA）含量的測定，找到金柑在試驗條件下所能耐受的最低溫度及能耐受低溫的持續(xù)時間。

1.3.1 電解質(zhì)滲出率的測定 經(jīng)低溫處理的材料分別放入20 mL具塞刻度試管中，準確加入去離子水20 mL，蓋上試管塞，在控溫室浸泡24 h，每次浸泡時保持環(huán)境溫度基本一致，攪動混勻后用精密電導率儀（DDS-312型，上海大普儀器有限公司）測定溶液電導率，冷馴化處理樣品的電導率為E1，對照材料的電導率為E0。冷馴化處理的樣品再放入98±2℃沸水浴中1 h，以殺死植物組織，取出置控溫室冷卻至室溫，測其煮沸電導率E2，按下式計算各處理的電解質(zhì)滲出率：電解質(zhì)滲出率（%）=[（E1-E0）/（E2-E0）]×100%。

1.3.2 丙二醛（MD A）含量的測定 取待測液1.0 mL，加入 5.0 mL 20%的三氯乙酸（TCA）（含 0.5%的硫代巴比妥酸：TBA）混勻后塞上塞子，水浴煮沸30 min，冰浴快速冷卻，4 000 r/min 離心 10 min，以20%TCA為參照，上清液用紫外分光光度計測定532 nm和600 nm處的吸光值A532和A600，重復3次求平均值，MDA含量=△A×N/W?！鰽=A532-A600，N為稀釋倍數(shù)，W為植物樣品重量（g）。

2 結果與分析

2.1 實驗模型的冰凍處理時間

為了探討金柑生長期所能耐受的冰凍低溫持續(xù)時間，兩種處理的盆栽苗用棉絮包蔸，在-6℃下處理不同時間，觀察葉片受凍情況。兩種處理的盆栽苗冰凍30 min均未表現(xiàn)出凍害癥狀；未經(jīng)冷馴化的金柑冰凍40 min出現(xiàn)凍害癥狀，60 min其大多數(shù)葉片受凍；而經(jīng)冷馴化的金柑冰凍50 min才出現(xiàn)凍害癥狀，60 min只是輕微的凍害（表1）。為減少控溫箱中缺乏光照的影響，并鑒于上述結果，選定抗凍實驗模型的冰凍處理時間為60 min。

表1 -6℃下不同時間處理金柑葉片受凍情況

2.2 實驗模型的冰凍處理溫度

為了探討金柑生長期所能耐受的致死溫度，兩種處理的盆栽苗用棉絮包蔸，在不同溫度下冰凍處理60 min，觀察葉片受凍情況。兩種處理的盆栽苗0℃下均未表現(xiàn)出凍害癥狀；未經(jīng)冷馴化的金柑-3℃出現(xiàn)凍害癥狀、-6℃大多數(shù)葉片受凍、-12℃全部葉片受凍；而經(jīng)冷馴化的金柑-6℃才出現(xiàn)輕微的凍害癥狀、-12℃大多數(shù)葉片受凍（表2）。考慮到抗凍實驗模型中未經(jīng)冷馴化的對照組要求表現(xiàn)受凍，而經(jīng)冷馴化的處理組不能表現(xiàn)受凍，因此抗凍實驗模型的冰凍溫度需要選定在-9～-12℃。

2.3 低溫脅迫對金柑葉片電解質(zhì)滲出率的影響

表2 不同低溫處理60 min金柑葉片受凍情況

兩種預處理的金柑在溫度高于-6℃條件下冰凍60 min，其葉片電解質(zhì)滲出率均低于50%；但未經(jīng)過冷馴化的金柑在-9℃條件下冰凍處理，其葉片電解質(zhì)滲出率增加到58.4%，當溫度下降到-12℃時，電解質(zhì)滲出率陡然增加到96.2%，表現(xiàn)為所有葉片均嚴重受損；而經(jīng)過冷馴化的金柑葉片電解質(zhì)滲出率在-9℃條件下依然低于50%，當溫度下降到-12℃時，電解質(zhì)滲出率平緩地增加到51.4%，表現(xiàn)為部分葉片受損（圖1）。將溫度-電解質(zhì)滲出率擬合Logistic方程[7-8]，可以求出半致死溫度。實驗結果表明經(jīng)冷馴化的金柑的半致死溫度低于-10℃。當溫度處于-10℃時，未經(jīng)冷馴化的對照組受凍60 min，其葉片的電解質(zhì)滲出率遠大于50%，表現(xiàn)出嚴重的凍害，可以作為抗凍實驗模型的對照組；當溫度處于-10℃時，經(jīng)冷馴化的實驗組受凍60 min，其葉片的電解質(zhì)滲出率低于50%，不會表現(xiàn)出嚴重的凍害，可以作為抗凍實驗模型的實驗組。

2.4 低溫脅迫對金柑葉片中丙二醛（MDA）含量的影響

MDA是膜質(zhì)受氧自由基破壞的產(chǎn)物，是膜損傷的重要指示指標。隨著溫度的降低，凍害加深，MDA含量也逐步增加。到-9℃時處理60 min出現(xiàn)峰值，但到-12℃時MDA含量反而急劇降低。對照組在-12℃時處理60 min的MDA含量較-9℃時處理60 min的MDA含量下降了0.062 6，處理組下降了 0.084 6（圖 2）。

2.5 抗凍實驗模型的檢驗

圖2 不同冰凍溫度處理下金柑葉片MDA含量的變化

根據(jù)對不同溫度和不同處理時間的研究，選定處理溫度為-9～-12℃之間，處理時間為60 min。再通過考察金柑葉片電解質(zhì)滲出率和MDA含量，選定處理溫度為-10℃。對照組和冷馴化組金柑經(jīng)過-10℃條件下冰凍60 min處理，結果如圖3。研究結果表明：未經(jīng)冷馴化的對照組在-10℃條件下冰凍60 min后受到嚴重凍傷。葉片表現(xiàn)為水漬狀、透明，顏色加深呈墨綠色，質(zhì)感變薄，葉片上的細小白點消失，1 h后逐漸卷曲，2~3 d干枯，樹枝變軟、下垂，逐步變黃，數(shù)日后干枯，最后整株死亡；經(jīng)過冷馴化的處理組在-10℃條件下冰凍60 min后受到一定的凍害。葉片呈輕微水漬狀，顏色加深呈淺綠色，葉片上的部分細小白點消失，少部分嫩葉微卷曲；嫩枝變軟，葉片下垂；經(jīng)過28℃恢復1星期，葉色變淺，葉片背面呈白色，細小白點重新出現(xiàn)，嫩枝變硬，葉片抬升；并有少數(shù)腋芽萌動。由此表明：在-10℃條件下冰凍60 min，對照組受到嚴重凍害，而處理組只有輕微凍害并能得到恢復。因此，-10℃可以作為抗凍實驗模型的處理溫度。

圖3 -10℃條件下60 min冰凍處理金柑葉片受凍情況

3 討論

3.1 材料的選擇

柑橘的耐寒性與柑橘品種密切相關，柑橘品種的耐寒能力依次為：枳>金柑>闊皮柑橘>酸橙>甜橙>柚類>檸檬、枸櫞[9-10]。枳耐寒能力最強，但枳到冬天葉片會脫落，無法用其葉片開展抗凍研究[11]。金柑，又名金桔，屬蕓香科，是著名的觀果植物。金柑雖然抗寒能力弱于枳，但其屬常綠植物，而且葉形較大，取材方便，是開展柑橘抗凍研究的理想材料。

3.2 金柑根系的保護

柑橘根系不耐低溫，在自然條件下，柑橘越冬時氣溫雖然低，但根際土壤的溫度仍較高，使根系不受低溫影響。但在實驗時，由于盆栽苗土壤少，冰凍處理時無法維持較高溫度，柑橘根系受損，影響抗凍實驗模型的建立。因此，試驗采用棉絮包裹營養(yǎng)缽及根頸的辦法保護金柑根系。

3.3 處理時間和溫度的選擇

試驗結果表明，冰凍處理時間60 min的效果和70 min的效果相當。由于控溫箱中缺乏光照，時間過長，金柑將受到影響，因此選定處理時間為60 min。

柑橘凍害的氣象指標，按凍害的發(fā)生程度可分為-5℃、-7℃、-9℃、-11℃等 4個溫度等級，分別代表柑橘開始受凍害、輕凍害、凍害和重凍害的指標。但以往的研究表明，冷凍室冰凍處理與自然界冰凍有差異。因此，根據(jù)前期的研究，將溫度設置為0℃、-3℃、-6℃、-9℃和-12℃。

3.4 金柑抗凍實驗模型

以冷馴化后冰凍處理未表現(xiàn)凍害的金柑為抗凍組，以未冷馴化后冰凍處理表現(xiàn)凍害的金柑為對照組建立金柑抗凍實驗模型。研究結果表明：金柑在-10℃條件下冰凍60 min后，對照組受到嚴重凍害，而經(jīng)過冷馴化的處理組只有輕微凍害并能得到恢復。因此，-10℃可作為抗凍實驗模型的處理溫度。

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