海洋多黏類芽孢桿菌L1-9菌株抗菌蛋白的分離純化及其抗菌作用

馬桂珍，王淑芳，暴增海，吳少杰，夏振強(qiáng)，李世東

(1.淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院植物保護(hù)研究所，北京 100081)

海洋多黏類芽孢桿菌L1-9菌株抗菌蛋白的分離純化及其抗菌作用

馬桂珍1,2，王淑芳1，暴增海1,2，吳少杰1，夏振強(qiáng)1，李世東3

(1.淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院植物保護(hù)研究所，北京 100081)

通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow柱層析、Sephadex G-200柱層析，以小麥蠕孢病菌和金黃色葡萄球菌為指示菌采用抑菌活性追蹤和SDS-PAGE跟蹤檢測(cè)，從分離自連云港海域、對(duì)多種病原真菌具有抑菌作用的多黏類芽孢桿菌L1-9菌株發(fā)酵液中分離純化得到一種對(duì)金黃色葡萄球菌和小麥蠕孢病菌的菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)具有抑制作用的抗菌蛋白，分子質(zhì)量約31kD。

海洋多黏類芽孢桿菌L1-9菌株；抗菌蛋白；純化

植物病害的防治主要依靠化學(xué)防治，化學(xué)防治所帶來(lái)的環(huán)境污染、農(nóng)產(chǎn)品殘留以及病原物產(chǎn)生抗藥性等副作用已引起人們的高度重視，化學(xué)農(nóng)藥的大量使用作為種植業(yè)的源頭污染已經(jīng)嚴(yán)重威脅著食品安全。應(yīng)用有益微生物防治植物病害彌補(bǔ)了化學(xué)防治的不足，也是保障食品安全的有效途徑，已經(jīng)成為植物病害防治的重要手段，受到人們的廣泛關(guān)注。

多黏類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)中很多菌株作為重要的生物防治資源，用于多種植物病害的生物防治，該菌對(duì)人畜安全、無(wú)環(huán)境污染、對(duì)植物非致病性，美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(EPA)已將其列為可商業(yè)上應(yīng)用的微生物種類之一[1]，我國(guó)農(nóng)業(yè)部也將其列為免做安全鑒定的一級(jí)菌種[2]。Nielsen等[3]篩選到一株多黏類芽孢桿菌，該菌能產(chǎn)生細(xì)胞壁水解酶，抑制一些病原真菌生長(zhǎng)；多黏類芽孢桿菌BRF-1菌株的無(wú)菌代謝產(chǎn)物抑制黃瓜尖孢鐮刀菌和番茄枯萎病菌分生孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，對(duì)黃瓜枯萎病和番茄枯萎病具有明顯的防治效果，對(duì)大豆具有明顯的防病促生作用，其生物防治機(jī)制主要是分泌拮抗物質(zhì)[4]；W3菌株培養(yǎng)液和去菌液對(duì)番茄植株抗灰霉病有較強(qiáng)的誘導(dǎo)作用[5]，徐玲等[6]將篩選到的多黏

類芽孢桿菌菌株HY96-2研制成了0.1×108CFU/g多黏類芽孢桿菌細(xì)粒劑(KDLD)，已登記并在生產(chǎn)上應(yīng)用，對(duì)番茄青枯病具有良好的防治效果。多黏類芽孢桿菌已經(jīng)成為重要的生防資源，用于植物病害的生物防治?，F(xiàn)已報(bào)道的多黏類芽孢桿菌均分離自土壤，而有關(guān)分離自海洋環(huán)境的多黏類芽孢桿菌的研究較少。

L1-9菌株是從連云港海域海泥中分離獲得的對(duì)多種植物病原真菌和細(xì)菌有抗菌作用的多黏類芽孢桿菌優(yōu)良菌株[7]，該菌株能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、蛋白酶和纖維素酶等細(xì)胞壁水解酶[8]。本實(shí)驗(yàn)從L1-9菌株代謝產(chǎn)物中分離純化抗菌蛋白，為明確該菌株的生物防治作用機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

海洋多黏類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)L1-9菌株分離自連云港海域海泥，本實(shí)驗(yàn)室保存；

供試細(xì)菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)，由本實(shí)驗(yàn)室保存；供試病原真菌：小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、小麥孺孢病菌(Helminthosporium sativum)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基

L1-9菌株菌種培養(yǎng)及保藏培養(yǎng)基：海水配制的PDA培養(yǎng)基。

植物病原真菌菌種活化及抑菌實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；大腸桿菌(E. coli)、金黃色葡萄球菌(S. aureus)使用的培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

L1-9菌株種子液制備培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、海水1000mL，自然pH值。

L1-9菌株發(fā)酵培養(yǎng)基(g/100mL)：豆餅粉1、玉米粉1.5、麥麩1、大米粉0.5、KH2PO40.07、MgSO40.03、CaCO30.1，海水配制，自然pH值。

1.3 方法

1.3.1 L1-9菌株的活化與培養(yǎng)

將保藏的菌株劃線接種于海水配制的PDA培養(yǎng)基斜面上，25℃恒溫培養(yǎng)24h。

1.3.2 L1-9菌株種子液的制備

挑取活化后的L1-9菌株5環(huán)，接入裝有50mL種子液培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28℃、180r/min振蕩培養(yǎng)24h，得到種子液。

1.3.3 L1-9菌株發(fā)酵液的制備

按5%的接種量將種子液接種到裝有70mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28℃、180r/min振蕩培養(yǎng)36h，發(fā)酵液在4℃、12000r/min(離心力為15984×g)條件下離心20min，去沉淀，上清液即為發(fā)酵液。

1.3.4 硫酸銨的分級(jí)沉淀

取L1-9菌株發(fā)酵上清液緩緩加入固體硫酸銨至30%飽和度，4℃靜置2h ，10000r/min(離心力為11100×g)，4℃離心30min ，分別收集上清液和沉淀。向收集的上清液中繼續(xù)加入固體硫酸銨，依次按照同樣的方法調(diào)節(jié)到40%、50%、60%、70%和80%硫酸銨飽和度。分別收集每一個(gè)飽和度的沉淀蛋白，用適量的0.05mol/L pH7.2的PB緩沖液溶解，裝入透析袋中用相同濃度的PB緩沖液流動(dòng)透析冰浴過(guò)夜。以小麥蠕孢病菌為指示菌，用挖孔法和濾紙片法測(cè)定各組分的抑菌活性。

1.3.5 DEAE Sepharose Fast Flow離子交換柱層析

對(duì)發(fā)酵液硫酸銨沉淀后的沉淀復(fù)溶物進(jìn)行DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析[9]。先用0.05mol/L pH7.2的PB緩沖液洗脫平衡柱床，將濃縮的樣品上樣，用100%的PB緩沖液洗脫一個(gè)柱體積，然后用0～1mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫速度為1.5mL/min，儀器檢測(cè)到波長(zhǎng)280nm處的A280nm≥0.03時(shí)，自動(dòng)部分收集器按每管4mL收集，凍干濃縮，檢測(cè)其抑菌活性。

1.3.6 Sephadex G-200凝膠層析

將經(jīng)過(guò)DEAE離子交換柱層析洗脫收集到的樣品液濃縮，用Sephadex G-200柱層析進(jìn)行進(jìn)一步純化。

先用0.05mol/L pH7.2的PB緩沖液充分平衡至A280nm基線。將1～1.5mL的樣品液上樣，用相同緩沖液洗脫，洗脫速度為0.5mL/min。波長(zhǎng)280nm處的A≥0.03時(shí)，自動(dòng)部分收集器按每管2mL收集，分段收集合并吸收峰，凍干濃縮后分別進(jìn)行活性檢測(cè)和純度檢測(cè)。

1.3.7 SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)純度

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳( SDS-PAGE) 參照文獻(xiàn)[10]的方法。蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。濃縮膠和分離膠濃度分別為4%和12%。

1.3.8 抑菌活性的檢測(cè)

1.3.8.1 對(duì)病原真菌的抑制作用

采用平板打孔法。在PDA平板中央接種直徑為5mm的受試病原菌菌苔，距培養(yǎng)皿邊緣15mm處，對(duì)稱打直徑為5mm的孔，每個(gè)孔內(nèi)滴200μL L1-9菌株的無(wú)菌發(fā)酵液，25℃恒溫培養(yǎng)4d后，觀察病原真菌的菌落生長(zhǎng)狀況，測(cè)量抑菌帶寬度。

1.3.8.2 對(duì)細(xì)菌的抑制作用

采用牛津杯法和濾紙片法。將在細(xì)菌培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)24h的供試指示細(xì)菌用0.85%的無(wú)菌生理鹽水洗下，制備成濃度為5×106個(gè)/mL菌懸液，取0.2mL菌懸液滴在平板培養(yǎng)基表面中央，用無(wú)菌涂布棒涂布均勻。在

距離培養(yǎng)皿邊緣1.5cm處的含菌平板四周擺放牛津杯(濾紙片)，每個(gè)牛津杯(濾紙片)中注入50μL供試樣品，以等量的PD培養(yǎng)基和PB緩沖液為對(duì)照。28℃培養(yǎng)箱中恒溫，培養(yǎng)24h后觀察測(cè)定抑菌圈直徑。

1.3.8.3 對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用

將培養(yǎng)7d的小麥蠕孢病菌用10mL無(wú)菌水洗下孢子，4層紗布過(guò)濾去除菌絲，室溫下5000r/min離心5min，沉淀(孢子)用無(wú)菌水稀釋，至濃度為106個(gè)/mL。在孢子懸浮液中加入等體積的抑菌蛋白溶液，混均后取20μL涂布在無(wú)菌玻片中央，將載玻片置于裝有2層濾紙的滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)保濕，22℃恒溫培養(yǎng)，分別在2、4、6、8h和10h觀察孢子萌發(fā)情況，每處理低倍鏡下檢查100～120個(gè)孢子，計(jì)算孢子萌發(fā)率，測(cè)定芽管長(zhǎng)度。用PB緩沖液稀釋孢子作為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。

1.3.9 抗菌蛋白酶活性檢測(cè)

[8]的方法，采用平板透明圈法，檢測(cè)抗菌蛋白的幾丁質(zhì)酶、蛋白酶和葡聚糖酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 L1-9菌株發(fā)酵液的抑菌作用

平板抑菌活性實(shí)驗(yàn)表明，L1-9菌株無(wú)菌代謝產(chǎn)物對(duì)供試的植物病原真菌有很強(qiáng)的抑菌活性，100μL無(wú)菌代謝產(chǎn)物在PDA培養(yǎng)基上對(duì)小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、小麥孺孢病菌(Helminthosporium sativum)以及金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)均有明顯的抑菌活性，而CK(添加PD液體培養(yǎng)基)則無(wú)抑菌活性(圖1)；發(fā)酵液對(duì)于大腸桿菌(Escherichia coli)沒(méi)有抑菌活性。

圖1 細(xì)菌L1-9菌株發(fā)酵液的抑菌活性檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Antimicrobial effects of the fermentation supernatant of strain L1-9

2.2 硫酸銨沉淀的結(jié)果

用不同飽和度的硫酸銨沉淀L1-9菌株代謝產(chǎn)物，分段收集沉淀，透析后對(duì)沉淀物質(zhì)抑菌活性檢測(cè)結(jié)果表明：抑菌活性隨硫酸銨飽和度的提高而增加，當(dāng)飽和度提高到70%時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)增加硫酸銨的飽和度時(shí)抑菌活性下降，說(shuō)明該抗菌物質(zhì)存在于70%飽和度的硫酸銨中。

圖2 不同飽和度硫酸銨沉淀蛋白對(duì)小麥蠕孢病菌的抑菌活性Fig.2 Anti-Fusarium graminearum effects of ammonium sulfateprecipitated fractions of the fermentation supernatant of strain L1-9

2.3 DEAE離子交換柱層析純化抗菌蛋白及活性蛋白檢測(cè)

圖3 抗菌蛋白的DEAE離子交換層析圖Fig.3 Elution profile of redissolved ammonium sulfate-precipitatedfractions of the fermentation supernatant of strain L1-9 on DEAE Sepharose Fast Flow column

如圖3所示，發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸銨沉淀并透析除鹽后，所得到的粗蛋白經(jīng)DEAE離子交換層析分離，出現(xiàn)了明顯的峰1，該處蛋白對(duì)應(yīng)的吸光度達(dá)到0.9，將峰1單獨(dú)收集，NaCl溶液繼續(xù)洗脫得到的峰2，該處蛋白對(duì)應(yīng)的吸光度未超過(guò)0.2，并且峰2包含多種雜蛋白。

圖4 DEAE柱層析峰1對(duì)金黃色葡萄球菌和小麥孺孢病菌的抑制作用Fig.4 Antimicrobial effects of peak 1 obtained from DEAE Sepharose Fast Flow column fractionation

如圖4所示，以金黃色葡萄球菌(S. aureus)和小麥孺孢病菌(H. sativum)為指示菌進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，峰1具有抑菌活性，峰2對(duì)供試菌沒(méi)有抑制作用。

2.4 Sephadex G-200柱層析結(jié)果

圖5 抗菌蛋白的Sephadex G-200 凝膠柱層析圖Fig.5 Elution profile of peak 1 on Sephadex G-200 column

如圖5所示，DEAE離子交換柱層析收集到的峰1經(jīng)過(guò)凍干濃縮，用Sephadex G-200分子篩層析柱進(jìn)行進(jìn)一步純化。洗脫后出現(xiàn)兩個(gè)峰，峰1處蛋白的吸光度為0.05，峰2處蛋白的吸光度明顯高于峰1，達(dá)到了0.25，按峰收集。

圖6 Sephadex G-200層析峰2收集液對(duì)細(xì)菌和病原真菌的抑制作用Fig.6 Antimicrobial effects of peak 2 obtained from Sephadex G-200 column fractionation

如圖6所示，分別檢測(cè)峰1和峰2的抑菌活性，峰1沒(méi)有抑菌活性，峰2具有抑菌活性。

2.5 SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)抗菌蛋白純度和分子質(zhì)量

圖7 抗菌蛋白各純化階段電泳圖譜Fig.7 Electrophoresis profile of target protein-containing products during separation and purification

由圖7可見(jiàn)，經(jīng)硫酸銨沉淀得到的具有抑菌活性的粗蛋白含有多種蛋白組分，表明L1-9菌株的代謝產(chǎn)物除含有抗菌蛋白外，同時(shí)還含有多種不同分子質(zhì)量的雜蛋白，而粗蛋白DEAE柱層析后有抑菌活性的峰1也出現(xiàn)了多條條帶，峰1繼續(xù)使用Sephadex G-200層析純化后的有活性的峰2經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)呈現(xiàn)單一條帶，表明已分離得到了電泳純的抗菌蛋白，其表觀分子質(zhì)量約31kD。

2.6 抗菌蛋白對(duì)小麥蠕孢病菌分生孢子萌發(fā)的影響

圖8 純化后的蛋白組分對(duì)小麥孺孢病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用Fig.8 Inhibitory effect of the purified target protein against the spore germination of Helminthosporiu sativum

圖9 抗菌蛋白對(duì)小麥孺孢病菌分生孢子芽管長(zhǎng)度的影響結(jié)果Fig.9 Inhibitory effect of the purified target protein against germ tube length of Helminthosporiu sativum

圖10 抗菌蛋白處理后小麥孺孢病菌分生孢子萌發(fā)情況(10×40)Fig.10 Conidiophore sprouting of Helminthosporiu sativum with and without treatment with the purified target protein examined under electron microscope (10×40)

從圖8～10可以看出，以無(wú)菌培養(yǎng)液為對(duì)照，經(jīng)過(guò)蛋白組分處理的小麥孺孢病菌的分生孢子萌發(fā)率明顯下降，6h時(shí)對(duì)照的萌發(fā)率達(dá)到了90%，而處理的萌發(fā)

率僅為51.4%?？咕鞍撞粌H降低孢子的萌發(fā)率，同時(shí)也抑制芽管的伸長(zhǎng)，處理的芽管生長(zhǎng)較慢，明顯短于對(duì)照，6h對(duì)照的芽管長(zhǎng)度為22.3μm，處理的僅為12.9μm。

2.7 抗菌蛋白的酶活性檢測(cè)結(jié)果

酶活性檢測(cè)結(jié)果表明，從L1-9菌株的代謝產(chǎn)物中分離的到的抗菌蛋白，在幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶和蛋白酶檢測(cè)平板上均未形成透明圈，表明該蛋白不具有3種酶的活性，為一種非酶類的抗菌蛋白。

3 討論與結(jié)論

通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow柱層析、Sephadex G-200柱層析，以小麥蠕孢病菌和金黃色葡萄球菌為指示菌采用抑菌活性追蹤和SDS-PAGE跟蹤檢測(cè)，從分離自連云港海域?qū)Χ喾N病原真菌具有抑菌作用的多黏類芽孢桿菌L1-9菌株發(fā)酵液中分離純化到1種分子質(zhì)量約31kD的抗菌蛋白，該蛋白不具有幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶和蛋白酶活性，為一種非酶類的抗菌蛋白，對(duì)金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用，并抑制小麥蠕孢病菌的菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)及芽管的伸長(zhǎng)。以往的研究表明，該菌株能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、蛋白酶和纖維素酶[8]，而本實(shí)驗(yàn)分離的到的抗菌蛋白卻不具有上述幾種細(xì)胞壁降解酶活性，這可能是由于同種微生物在不同的培養(yǎng)基上產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物不同，同時(shí)幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、蛋白酶和纖維素酶是誘導(dǎo)酶，微生物在含有相應(yīng)底物的培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)生相應(yīng)的酶類，本實(shí)驗(yàn)所用的發(fā)酵培養(yǎng)基中不含有上述酶類的底物，因而未能產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞壁降解酶。說(shuō)明該菌株具有不同的抑菌機(jī)理和良好的應(yīng)用前景。

多黏類芽孢桿菌能產(chǎn)生多種形式的抗菌因子，菌株不同，其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)及生理活性物質(zhì)也不同，按其物質(zhì)類型可分為多肽抗生素類[11]、植物激素[12]、拮抗蛋白(非酶)類[13]、酶類等。姚烏蘭等[14]從多黏類芽孢桿菌WY110菌株中分離得到一種對(duì)水稻稻瘟病菌具有拮抗活性的蛋白P2，其分子質(zhì)量為26kD，該蛋白具有葡聚糖酶活性。Beatty等[15]研究表明，多黏類芽孢桿菌PKB1 菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)為多種組分的抗菌肽，其分子質(zhì)量分別為883、897、948D和961D的短肽。BS04 菌株產(chǎn)生4個(gè)分子質(zhì)量分別為1144、1126、1104、1086D的短肽[16]。BRF-1菌株的抗菌蛋白表觀分子質(zhì)量約35.14kD[17]，LM-3菌株產(chǎn)生的抗菌蛋白分子質(zhì)量介于6kD和14.2kD之間[9]，L1-9菌株的抗菌蛋白分子質(zhì)量約為31kD，與所報(bào)道的抗菌蛋白不同，有可能為一種新的非酶類抗菌蛋白。張道敬等[18]從多黏類芽孢桿菌H Y96-2發(fā)酵液乙酸乙酯部分分離得到了8個(gè)化合物，對(duì)所分離得到的化合物進(jìn)行了初步的生物活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)化合物Ⅴ和Ⅵ有一定的抗菌活性。

目前用于微生物農(nóng)藥開(kāi)發(fā)的微生物主要來(lái)自于陸源微生物。然而，經(jīng)過(guò)半個(gè)世紀(jì)以來(lái)全球性的篩選，從陸源微生物中發(fā)現(xiàn)新型生物活性物質(zhì)或新化合物的概率已大大降低，海洋高壓、高鹽、低營(yíng)養(yǎng)、低溫的獨(dú)特環(huán)境不僅造就了一些特殊種類的微生物，而且即使與陸地相同的微生物種類，在海洋這種特殊的生境中生活，也會(huì)產(chǎn)生完全不同于陸地微生物的新穎抗菌活性物質(zhì)，因而海洋微生物已經(jīng)成為尋找新的抗菌活性物質(zhì)的重要生物資源[19]，受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。我國(guó)田黎等[20]對(duì)海洋細(xì)菌B-9987菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)及對(duì)幾種植物病原真菌的作用進(jìn)行了研究，為海洋細(xì)菌在植物病害生物防治上的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)L1-9菌株的抗菌蛋白進(jìn)行分離純化，有關(guān)抗菌蛋白的氨基酸序列分析以及該菌株產(chǎn)生的小分子抗菌物質(zhì)的分離純化正在進(jìn)行，今后將進(jìn)一步深入開(kāi)展抑菌作用機(jī)理、抗菌蛋白編碼基因的克隆、高效生防工程菌株的構(gòu)建等研究工作。

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Isolation, Purification and Biological Activity Assessment of an Antimicrobial Protein from Marine Paenibacillus polymyxa Strain L1-9

MA Gui-zhen1,2，WANG Shu-fang1，BAO Zeng-hai1,2，WU Shao-jie1，XIA Zhen-qiang1，LI Shi-dong3
(1. Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China；2. Jiangsu Marine Resources Development Research Institute, Lianyungang 222005, China；3. Plant Protection Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

An antimicrobial protein was obtained from the fermentation broth of a Paenibacillus polymyxa strain isolated from the sea area near Lianyungang (numbered L1-9), which has antagonic effect against a variety of pathogenic fungi, after ammonium sulfate precipitation and DEAE Sepharose Fast Flow ion exchange and Sephacryl G-200 filtration chromatographic separation. This protein was found to have the ability to inhibit the growth of Staphyloccocus aureus and the mycelial growth and spore germination of Helminthosporium sativum and possess a molecular weight of about 31 kD.

marine Paenibacillus polymyxa strain L1-9；antimicrobial protein；purification

Q815

A

1002-6630(2010)17-0335-06

2010-06-29

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK2009165)；連云港市科技局農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(CN0825)；

農(nóng)業(yè)部生物防治重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(KLBC-09-01)；江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(HS08009)

馬桂珍(1963—)，女，教授，博士，主要從事植物病害生物防治研究。E-mail：guizhenma@sohu.com