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    人參莖葉總皂苷脂質(zhì)體與水溶液在大鼠體內(nèi)的血藥濃度及藥代動力學(xué)參數(shù)對比分析

    2017-06-19 01:18查琳趙巖祝洪艷蔡恩博劉雙利楊鶴
    中國中藥雜志 2017年10期
    關(guān)鍵詞:藥代動力學(xué)水溶液脂質(zhì)體

    查琳+趙巖+祝洪艷+蔡恩博+劉雙利+楊鶴+趙英+郜玉鋼+張連學(xué)

    [摘要] 該試驗(yàn)探討人參莖葉總皂苷脂質(zhì)體與水溶液在大鼠體內(nèi)的血藥濃度及藥代動力學(xué)參數(shù)對比差異。通過大鼠靜脈注射人參莖葉總皂苷水溶液和脂質(zhì)體后,用高效液相色譜法檢測血漿不同時(shí)間點(diǎn)的9種主要人參皂苷單體Rg1,Re,Rf,Rb1,Rg2,Rc,Rb2,Rb3,Rd的血藥濃度,通過3p97軟件擬合數(shù)據(jù)。大鼠靜脈給藥后,血漿中可測得9種目標(biāo)皂苷。水溶液的達(dá)峰時(shí)間一般在0.05~0.083 3 h;脂質(zhì)體的達(dá)峰時(shí)間一般在0.5 h之后。經(jīng)軟件擬合后,人參皂苷Rg1,Re,Rf,Rg2,Rc,Rd,Rb3的水溶液均為二室模型,脂質(zhì)體為一室模型;人參皂苷Rb1的水溶液和脂質(zhì)體為三室模型;Rb2的水溶液為三室模型,脂質(zhì)體為一室模型。9種皂苷脂質(zhì)體的藥-時(shí)曲線下面積(AUC)均大于水溶液的曲線下面積,而且脂質(zhì)體在體內(nèi)停留時(shí)間較長,清除率較水溶液的清除率慢,半衰期一般也較水溶液長。研究結(jié)果顯示通過靜脈注射給藥方式,對2種劑型的藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行對比,人參莖葉總皂苷脂質(zhì)體與水溶液在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)顯著不同,脂質(zhì)體使藥物在體內(nèi)的濃度維持較長時(shí)間,降低了藥物體內(nèi)消除速度,提高藥物療效。人參莖葉總皂苷脂質(zhì)體與傳統(tǒng)劑型相比,提高了藥物的緩釋長效,為今后研發(fā)人參皂苷新劑型起到了重要意義。

    [關(guān)鍵詞] 人參莖葉總皂苷; 藥代動力學(xué); 脂質(zhì)體; 水溶液; 靜脈注射

    [Abstract] The experiment was aimed to investigate the difference of plasma concentration and pharmacokinetic parameters between liposome and aqueous solution of toatal ginsenoside of ginseng stems and leaves in rats, such as ginsenosides Rg1, Re, Rf, Rb1, Rg2, Rc, Rb2, Rb3, Rd. After intravenous injection of liposome and aqueous solution in rats, the blood was taken from the femoral vein to detect the plasma concentration of the above 9 ginsenoside monomers in different time points by using HPLC. The concentration-time curve was obtained and 3p97 pharmacokinetic software was used to get the pharmacokinetic parameters. After the intravenous injection of ginsenosides to rats, nine ginsenosides were detected in plasma. In general, among these ginsenosides, the peak time of the aqueous solution was between 0.05 to 0.083 3 h, and the serum concentration peak of liposome usually appeared after 0.5 h. After software fitting, the aqueous solution of ginsenoside monomers Rg1, Re, Rf, Rg2, Rc, Rd, Rb3 was two-compartment model, and the liposomes were one-compartment model; aqueous solution and liposome of ginsenoside monomers Rb1 were three-compartment model; aqueous solution of ginsenoside monomers Rb2 was three-compartment model, and its liposome was one-compartment model. Area under the drug time curve (AUC) of these 9 kinds of saponin liposomes was larger than that of aqueous solution, and the retention time of the liposomes was longer than that of the aqueous solution; the removal rate was slower than that of the aqueous solution, and the half-life was longer than that of the water solution. The results from the experiment showed that by intravenous administration, the pharmacokinetic parameters of two formulations were significantly different from each other; the liposomes could not only remain the drug for a longer time in vivo, but also reduce the elimination rate and increase the treatment efficacy. As compared with the traditional dosage forms, the total ginsenoside of ginseng stems and leaves can improve the sustained release of the drug, which is of great significance for the research and development of new dosage forms of ginsenosides in the future.

    [Key words] toatal ginsenoside of ginseng stems and leaves; pharmacokinetic; liposome; solution; intravenous injection

    人參為五加科植物人參Panax ginseng C. A,Mey.的干燥根[1],是我國傳統(tǒng)的名貴中藥。人參莖葉總皂苷(total ginsenoside of ginseng stems and leaves,GSLS)為五加科植物人參P. ginseng A. Mey.的干燥莖葉經(jīng)加工制成的總皂苷。人參莖葉總皂苷中主要有效成分為人參皂苷Rg1,Re,Rf,Rb1,Rg2,Rc,Rb2,Rb3,Rd等單體皂苷。人參莖葉所含人參皂苷的藥理作用與人參根中皂苷基本相同[2]。研究表明人參皂苷具有多種藥理活性,如保護(hù)心肌細(xì)胞、抗心肌缺血、保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、增強(qiáng)記憶力、提高免疫力、抗癌、抗腫瘤、抗氧化和抗衰老[3-9]等作用。但是,人參皂苷對生物膜的滲透性差,口服生物利用度僅為1%~20%[10]。而改變劑型是一種有效改善人參皂苷生物利用度的方法。

    脂質(zhì)體(liposome)系指將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)而形成的微型泡囊體[11]。主要成分為磷脂和膽固醇。脂質(zhì)體具有組織相容性、細(xì)胞親和性、靶向性、緩釋性、提高藥物穩(wěn)定性、降低藥物毒性和改變給藥途徑等作用[12-15]。目前研究通過制備人參皂苷脂質(zhì)體從而提高其生物利用度,降低體內(nèi)的消除速度,提高療效[16]。

    本文選取人參莖葉總皂苷為研究對象,考察其脂質(zhì)體和水溶液靜脈給藥后在大鼠體內(nèi)的血藥濃度和藥代動力學(xué)性質(zhì)的差異。

    1 材料

    CXTH-3000高效液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司);KQ-250B型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);ABS 320-4N型分析天平(上海島韓實(shí)業(yè)有限公司);電熱恒溫水浴鍋(北京國華醫(yī)療器械廠);Avanti TM J-3OI冷凍高速離心機(jī)(美國BECKMAN);JHD-001氮吹儀(極恒實(shí)業(yè)有限公司);2XZ-4型旋片式真空泵(上海恒科學(xué)儀器有限公司);RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海美普達(dá)儀器有限公司)。

    人參莖葉總皂苷以及人參皂苷單體Rg1,Re,Rf,Rb1,Rg2,Rc,Rb2,Rb3,Rd均購自吉林大學(xué)化學(xué)公共化學(xué)教學(xué)與研究中心(總皂苷含量≥80%,單體皂苷純度均≥98%);淫羊藿苷(上海源葉生物有限公司,純度98%);大豆卵磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司);膽固醇(上海生物化學(xué)試劑公司);甲醇、乙腈均為色譜純,實(shí)驗(yàn)用水為超純水,其他試劑均為分析純。

    雄性SD大鼠,體重180~220 g,購自長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司,動物合格證號SCXK(吉)2011-0004。

    2 方法

    2.1 人參莖葉總皂苷脂質(zhì)體的制備[17]

    采用逆相蒸發(fā)法[18]制備人參莖葉總皂苷脂質(zhì)體。將人參莖葉總皂苷、磷脂和膽固醇用無水乙醇溶解于茄形瓶中,置水浴60~70 ℃溶解,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40 ℃蒸發(fā),形成薄膜。將PBS溶液(pH=7)置于45 ℃水浴中,保溫,待用。再加入乙醚和PBS水相使薄膜溶解,置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上使乙醚揮盡。即得人參莖葉總皂苷脂質(zhì)體混懸液。

    2.2 色譜條件

    以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈(A)-水(B)為流動相,梯度洗脫,0~24 min,18.5%~21.5%A,24~26 min,21.5%A,26~30 min,21.5%~29%A,30~52 min,29%~30.5%A,52~55 min,30.5%~36.5%A,55~60 min,36.5%~38%A,流速1.0 mL·min-1;檢測波長203 nm;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量10 μL;內(nèi)標(biāo)物淫羊藿苷。

    2.3 溶液的制備

    人參皂苷對照品溶液制備:分別精密稱取9種單體人參皂苷置于量瓶中,用甲醇溶解并定容,制成質(zhì)量濃度為0.2 g·L-1的溶液。

    內(nèi)標(biāo)溶液的配制:精密稱取淫羊藿苷置于量瓶中,用甲醇溶解并定容,制成0.02 g·L-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

    2.4 血漿樣品處理

    取100 μL血漿置于Eppendof管中,加入淫羊藿苷內(nèi)標(biāo)溶液50 μL,渦旋混勻30 s,加入400 μL純甲醇,渦旋混勻3 min, 13 000 r·min-1離心10 min,吸取上清液,重復(fù)3次,置于氮?dú)饬髦写蹈?,用甲醇:乙腈?∶1)100 μL溶解,13 000 r·min-1離心取上清,10 μL進(jìn)樣分析。

    2.5 方法學(xué)考察

    2.5.1 專屬性考察 取空白血漿100 μL,按2.4項(xiàng)血漿樣品處理方法處理,按照2.2 項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣,得到大鼠血漿空白液相譜圖。將一定濃度的對照品溶液和內(nèi)標(biāo)混合加入到大鼠空白血漿中,同法得液相色譜圖。取含藥血漿藥品依法操作,得液相色譜圖。

    2.5.2 線性關(guān)系考察 取大鼠空白血漿100 μL,加入不同量的混合對照品溶液,質(zhì)量濃度分別為0.2,2,10,40,100,160,200 mg·L-1。按2.4項(xiàng)血漿樣品處理方法處理,按照2.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣,記錄各對照品和內(nèi)標(biāo)的峰面積,以對照品質(zhì)量濃度(X)與對照品和內(nèi)標(biāo)峰面積比值(Y)作線性回歸。以信噪比S/N>10的最低質(zhì)量濃度作為定量限。

    2.5.3 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取空白血漿100 μL,加入混合對照品溶液,質(zhì)量濃度分別為2,40,160 mg·L-1,按2.4項(xiàng)血漿樣品處理方法處理,制備血清樣品各5份。于1 d內(nèi)測定,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度,計(jì)算所得數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)即為批內(nèi)精密度;此后,在1個(gè)月內(nèi)任意4 d,每天分別測定上述3種濃度的樣品液3份,計(jì)算所得數(shù)據(jù)的RSD即為批間精密度。

    2.5.4 回收率試驗(yàn) 取空白血漿100 μL,加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,配制成質(zhì)量濃度分別為2,40,160 mg·L-1的血清樣品各3份,按2.4項(xiàng)血漿樣品處理方法處理,按血樣標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度,除以理論濃度,即為方法回收率。

    2.6 含藥血漿的制備

    將12只SD健康大鼠隨機(jī)分成人參莖葉總皂苷脂質(zhì)體組和水溶液組,每組6只,按大鼠體重計(jì)算給藥量,12只大鼠隔夜禁食后,經(jīng)大鼠股靜脈注射給藥50 mg·kg-1。然后分別于0.05,0.083 3,0.166 7,0.25,0.333,0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,6.0,8.0,12.0 h靜脈取血。將含藥血漿置于肝素化的Eppendof管中,于-20 ℃中保存待測。

    3 結(jié)果

    3.1 方法學(xué)考察

    3.1.1 專屬性考察結(jié)果 在本試驗(yàn)條件下,人參莖葉總皂苷中9種人參皂苷成分與內(nèi)標(biāo)淫羊藿苷均有良好的分離度,血漿中雜質(zhì)不干擾目標(biāo)化合物的測定,表明方法專屬性良好。人參皂苷Rg1,Re,Rf,Rb1,Rg2,Rc,Rb2,Rb3,Rd和內(nèi)標(biāo)淫羊藿苷的保留時(shí)間分別為23.966,24.696,39.988,44.569,45.748,47.563,51.225,52.498,57.799,35.753 min。大鼠空白血漿、加樣血漿、含皂苷脂質(zhì)體血漿、含皂苷水溶液血漿樣品的色譜圖見圖1。

    3.1.2 線性關(guān)系考察結(jié)果 人參莖葉總皂苷中9種人參皂苷成分在0.2~200 mg·L-1質(zhì)量濃度與峰面積比線性關(guān)系良好。定量下限在0.023~0.105 mg·L-1。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),對照品和內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸。人參皂苷Rg1,Re,Rf,Rb1,Rg2,Rc,Rb2,Rb3,Rd的回歸方程分別為Y=0.005 3X+0.003 7,R2=0.995 7;Y=0.020 6X+0.066 8,R2=0.991 3;Y=0.066 5X+0.118 3,R2=0.998 7;Y=0.016 0X-0.030 8,R2=0.997 2;Y=0.021 3X-0.005 4,R2=0.999 6;Y=0.030 0X-0.015 5,R2=0.999 5;Y=0.016 3X-0.004 5,R2=0.998 5;Y=0.016 3X-0.010 6,R2=0.997 2;Y=0.033 8X+0.012,R2=0.999 4。

    3.1.3 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果 質(zhì)量濃度分別為2,40,160 mg·L-1人參皂苷樣品的批內(nèi)精密度在0.93%~7.4%,準(zhǔn)確度在97.00%~102.9%;批間精密度在0.92%~9.8%,準(zhǔn)確度在98.07%~102.7%。

    3.1.4 回收率試驗(yàn)結(jié)果 質(zhì)量濃度分別為2,40,160 mg·L-1人參皂苷樣品回收率在95.57%~103.2%。

    3.2 藥動學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

    3.2.1 血藥濃度-時(shí)間曲線 大鼠靜脈給藥50 mg·kg-1人參莖葉總皂苷水溶液和脂質(zhì)體后,9種人參皂苷組分血藥濃度時(shí)間曲線見圖2。

    3.2.2 藥動學(xué)參數(shù) 血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)通過軟件3p97擬合出大鼠給藥后的藥代動力學(xué)參數(shù),結(jié)果見表1~3。Rg1,Re,Rf,Rg2,Rc,Rd和Rb3的水溶液均為二室模型,脂質(zhì)體為一室模型;Rb1的水溶液和脂質(zhì)體均為三室模型;Rb2的水溶液為三室模型,脂質(zhì)體為一室模型。9種皂苷水溶液經(jīng)靜脈給藥后,出現(xiàn)的血藥濃度峰較脂質(zhì)體均提前,水溶液的達(dá)峰時(shí)間一般在0.05~0.083 3 h;脂質(zhì)體的達(dá)峰時(shí)間一般在0.5 h之后,達(dá)峰時(shí)間較長。9種皂苷脂質(zhì)體的藥-時(shí)曲線下面積(AUC)均大于水溶液的曲線下面積,而且脂質(zhì)體在體內(nèi)停留時(shí)間較長,清除率較水溶液的清除率慢,半衰期一般也較水溶液長。因此,脂質(zhì)體的代謝比水溶液慢。

    4 討論

    人參皂苷因其重要的藥用價(jià)值一直是國內(nèi)外專家和學(xué)者的研究熱點(diǎn)。但是人參皂苷在體內(nèi)的生物利用度較低,難以發(fā)揮它的療效。因此,研發(fā)具有緩釋長效、生物利用度較高的人參皂苷新劑型具有重要的臨床意義。近年來,人參皂苷單體脂質(zhì)體的制備多見報(bào)道,但對于人參莖葉總皂苷脂質(zhì)體的制備目前尚未報(bào)道。由于在人參總皂苷給藥體系中,多種人參皂苷存在彼此間增溶等理化性質(zhì),最明顯的現(xiàn)象就是單體人參皂苷水中幾乎不溶或溶解度極低,而總皂苷則在水中溶解度很好,這也導(dǎo)致人參總皂苷的藥代動力學(xué)性質(zhì)與單體人參皂苷存在顯著差異。本文以人參莖葉總皂苷為研究對象,通過靜脈給藥方式,研究人參莖葉總皂苷脂質(zhì)體與其水溶液在大鼠體內(nèi)血藥濃度及藥代動力學(xué)的參數(shù)差異。靜脈給藥是脂質(zhì)體常見的給藥方式。但是,人參皂苷單體靜脈給藥在體內(nèi)代謝較快,雖然起效快,但難以發(fā)揮更高療效。馬靜等[19]對人參皂苷不同途徑給藥的藥代動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn),靜脈給藥后人參皂苷Rg1,Re代謝較快,6 h以后血漿中很難檢測到。本試驗(yàn)從9種皂苷2種劑型藥時(shí)曲線的趨勢上分析,水溶液一般在0.5 h以內(nèi)會出現(xiàn)最高血藥濃度峰,主要原因是藥物瞬間進(jìn)入血管內(nèi)導(dǎo)致較高的濃度,而脂質(zhì)體由于包裹一層生物膜,具有緩釋性,延長了藥物的釋放,所以出現(xiàn)的血藥濃度峰比較晚。研究結(jié)果表明,與人參莖葉總皂苷水溶液相比,脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)消除速度減慢,AUC明顯提高,并且脂質(zhì)體在一定程度上延長了藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間,從而提高藥物的長效作用。因此,人參莖葉總皂苷脂質(zhì)體與傳統(tǒng)劑型相比,既提高了藥物的緩釋長效,又不影響藥物的起效速度,為今后研發(fā)人參皂苷新劑型起到了重要意義。

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    [責(zé)任編輯 曹陽陽]

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