刺槐蜂蜜的高特異性PCR檢測(cè)技術(shù)體系的建立

中圖分類(lèi)號(hào)：R126.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1674-5124（2025）07-0104-07

Abstract：Honey is rich in nutrientsand widely cherished.As the world's largest honey producerand consumer， China faces a growing issue with adulterated honey entering the market due to increased demand. Existing nucleic acid detection systems for honey plants often fail to distinguish related species due to the lack of target specificity. This study employed bioinformatics methods to addressthis isue by comparing the highthroughput sequencing data of Robinia pseudoacacia with the genomes of related species and the NCBI NT nucleic acid database. We successfully identified a 3141 bp genome-specific DNA fragment of R. pseudoacacia. Based on this DNA fragment， we designed a PCR primer pair， RpsF1/RpsR13，with an amplification length of 257 bp. We then established a PCR system for the qualitative detection of locust honey. This system effectively distinguishes R. pseudoacacia from related Leguminosae species，such as Erythrina variegata. The system's sensitivity is notable， detecting a minimum template amount of 8.55 ag in a 20μL （2號(hào) reaction， equivalent to 2.0 DNA copies. Testing of 20 locust honey samples yielded a 100% positive detection rate，demonstrating the system's high specificity and sensitivity.This new PCR detection assay ofers a robust technical solution for identifying authentic honey，thus helping to address the issue of adulterated honey in the market.

Keywords： honey; Robinia pseudoacacia; specific DNA fragment; PCR; detection assay

0 引言

蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜或蜜露與自身分泌物結(jié)合后釀造而成的天然甜味物質(zhì)，是我國(guó)家庭常備食品，富含葡萄糖、果糖和蔗糖等多種營(yíng)養(yǎng)素，及豐富的氨基酸、維生素、活性酶、類(lèi)黃酮、多酚類(lèi)、類(lèi)胡蘿卜素等活性物質(zhì)及多種礦物質(zhì)[1]。蜜蜂采蜜時(shí)會(huì)吸人一部分花粉到蜜囊中，蜂蜜中不可避免地混人了蜜源植物的花粉，因此根據(jù)蜂蜜中花粉的種類(lèi)可區(qū)分蜂蜜的品種。由于市場(chǎng)供需關(guān)系和追求利益的驅(qū)使，大量人造蜂蜜、摻假蜂蜜涌入市場(chǎng)。蜂蜜摻假方式很多，如借以葡萄糖、果糖糖漿等作為原料添加各種食品添加劑如色素等；用白糖熬制糖漿或者通過(guò)硫酸裂解白糖而成的假蜂蜜；在蜂蜜中添加甘蔗糖漿、玉米糖漿、木薯糖漿、甜菜糖漿，以低價(jià)單（雜）花蜜冒充或摻入到高價(jià)單花蜜中等[2-3]。研究表明多種摻假蜂蜜會(huì)增加消費(fèi)者患糖尿病、肥胖、高血脂、高血壓等疾病的風(fēng)險(xiǎn)，影響肝臟、腎臟、心臟和大腦健康[4]。2021年9月1日，美國(guó)藥典（USP）正式發(fā)布了蜂蜜鑒別標(biāo)準(zhǔn)，其在對(duì)食品造假的分析中發(fā)現(xiàn)蜂蜜在最常見(jiàn)的摻假食品中排名第3至第5位。

目前已報(bào)道的蜂蜜鑒定技術(shù)包括傳統(tǒng)鑒定技術(shù)、化學(xué)鑒定技術(shù)、核酸鑒定技術(shù)。傳統(tǒng)鑒定技術(shù)包括感官鑒別、花粉鑒別等，感官鑒別法通常由經(jīng)驗(yàn)豐富的專(zhuān)家依據(jù)蜂蜜的色澤、狀態(tài)、氣味、滋味等感官特性來(lái)進(jìn)行品質(zhì)鑒別[5]，花粉鑒別法是通過(guò)對(duì)蜂蜜進(jìn)行稀釋、離心，再利用顯微技術(shù)對(duì)蜂蜜中的花粉類(lèi)型、含量等進(jìn)行鑒定[5]；化學(xué)鑒定技術(shù)包括色譜鑒定法和光譜鑒定法兩大類(lèi)，主要是通過(guò)檢測(cè)蜂蜜當(dāng)中的特定化合物以鑒別蜂蜜的真假[6-7；核酸鑒定技術(shù)主要通過(guò)檢測(cè)蜂蜜中的蜜源植物成分來(lái)鑒別蜂蜜的真假，包括多重PCR技術(shù)[8]、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)[9]、液滴數(shù)字PCR技術(shù)[10]等。其中核酸檢測(cè)技術(shù)是一種通過(guò)DNA判定物種類(lèi)型的檢測(cè)技術(shù)，靈敏度高、操作簡(jiǎn)便，是物種判別的\"金標(biāo)準(zhǔn)”，已在物種分類(lèi)、疾控、食品等眾多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。我國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T4848即規(guī)定使用核酸檢測(cè)方法（實(shí)時(shí)熒光PCR）對(duì)出口蜂蜜中常見(jiàn)蜜源植物進(jìn)行定性檢測(cè)，該標(biāo)準(zhǔn)中的檢測(cè)靶標(biāo)多為特定功能基因或轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)。但基于轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)、特定功能基因等靶標(biāo)的分子檢測(cè)技術(shù)受限于序列差異小等原因，難以將靶標(biāo)物種與其近緣物種區(qū)分開(kāi)。因此，發(fā)掘新的分子檢測(cè)靶標(biāo)開(kāi)發(fā)方便快捷的核酸檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于真假蜂蜜的鑒別乃至國(guó)家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的更新升級(jí)均具有重要意義。

本研究基于生物信息學(xué)方法挖掘刺槐物種特異的基因組DNA片段，并以此作為分子檢測(cè)靶標(biāo)，開(kāi)發(fā)了一套高特異性的刺槐蜂蜜分子檢測(cè)技術(shù)體系。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

大腸桿菌（Escherichiacoli）Transl0感受態(tài)細(xì)胞（Transgen，CD101-01）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.2 蜂蜜樣品

從沃爾瑪、永輝、京東及紅旗連鎖等大型商超或電商平臺(tái)購(gòu)買(mǎi)20款不同品牌的槐花蜂蜜，并記錄各樣品的品牌、配料、生產(chǎn)廠家、產(chǎn)地、執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)等信息。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 刺槐物種特異的基因組DNA片段挖掘與引物設(shè)計(jì)

1）從 https：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/中 下載刺槐近緣種的基因組。

2）近緣篩選： ① 從NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra. cgi？）下載刺槐的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，并比對(duì)到刺槐的近緣種基因組上； ② 提取未能比對(duì)到近緣種基因組上的測(cè)序數(shù)據(jù)； ③ 未比對(duì)的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行denovo組裝（候選特異序列）。

3）NT篩選： ① 下載NCBI的NT數(shù)據(jù)庫(kù)； ② 候選特異序列與NT數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，刪除比對(duì)上的序列。4）GC篩選：計(jì)算候選序列的GC含量，篩除GC含量異常的序列，剩余序列即為物種特異序列。5）依據(jù)刺槐特異的基因組DNA序列片段，以PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物（引物長(zhǎng)度20bp ，GC含量 40%60% ，退火溫度 60^°C ，擴(kuò)增長(zhǎng)度 200～500bp ），并由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2.2 DNA的提取

采摘新鮮的植物葉片，利用植物DNA提取試劑盒（EasyPure Plant Genomic DNA Kit， Transgen，EE111-01）提取基因組DNA，并通過(guò) 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。

1.2.3 DNA片段的TA克隆

基于1.2.1中所設(shè)計(jì)的PCR引物，利用2× EasyTaq？ PCR SuperMix（Transgen，AS111-11）對(duì)刺槐基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，以EasyPure QuickGelExtractionKit（Transgen，EG101-01）純化目的片段，參照pEASY -T1 Simple Cloning Kit（Transgen，CT111-01）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行TA克隆，挑選單克隆通過(guò)菌落PCR初步鑒定，陽(yáng)性克隆送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列一致的陽(yáng)性菌落經(jīng)液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至 OD600≈1.0 ，參照EasyPure？ Plasmid MiniPrep Kit（Transgen，EM101-02）說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，作為后續(xù)PCR體系優(yōu)化和靈敏度檢測(cè)的模板。

1.2.4PCR模板用量和退火溫度的優(yōu)化

根據(jù) 2× EasyTaq？PCRSuperMix說(shuō)明書(shū)設(shè)計(jì)PCR初始體系： 2× EasyTaq PCR Super Mix 10μL 正向引物 1μL ，反向引物 1μL ，重組質(zhì)粒 1μL ddH₂O7 μL。初始反應(yīng)程序?yàn)椋?94^9C 預(yù)變性 3min 94^°C 變性 30s，58^qC 退火 延伸 20s. 循環(huán)30次； 72^°C 補(bǔ)充延伸 5min 。測(cè)定重組質(zhì)粒溶液的濃度，以重組質(zhì)粒10倍梯度稀釋液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用 1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

基于上述PCR初始體系和模板用量?jī)?yōu)化結(jié)果，進(jìn)一步對(duì)PCR的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化：1）在52.0～67.0^qC 之間設(shè)置8個(gè)不同的退火溫度，以重組質(zhì)粒pEASY-Rps257為模板，對(duì)引物RpsF1/RpsR1的退火溫度進(jìn)行初步優(yōu)化；2）基于初步優(yōu)化結(jié)果，設(shè)置 57.0，57.7，58.9，60.8，63.1，65.0， 66.3，67.0°C 共8個(gè)退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用 1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5 PCR靈敏度測(cè)定

以梯度稀釋的重組質(zhì)粒為模板，在 20μL 的PCR反應(yīng)體系中，以優(yōu)化后的退火溫度進(jìn)行42個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用 1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，找到能檢測(cè)到擴(kuò)增條帶的最低質(zhì)粒模板濃度。

1.2.6 PCR特異性檢測(cè)

以刺槐、刺桐、龍爪槐、羊蹄甲、皂莢、豌豆、野豌豆、四季豆、蠶豆、紫荊等豆科植物的基因組DNA為模板，以優(yōu)化后的退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用 1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分析引物的物種特異性。

1.2.7 市售蜂蜜樣本的檢測(cè)

取蜂蜜樣 20g 至 50mL 離心管，于 55^°C 水浴至完全融化；離心管中加入提前預(yù)熱的 55^°C 蒸餾水 30mL ，振蕩混勻，分裝為2管，分別在4500r/min 離心 10min ，去上清;加入 1mL 蒸餾水重懸沉淀，移至 2mL 離心管， 4500r/min 離心 10min 去上清，重復(fù)清洗1次；所得沉淀首先用液氮速凍10s. ，隨后于離心管中加入直徑 0.3cm 的鋼珠，在渦旋振蕩儀上研磨 20s. ，重復(fù)速凍和研磨步驟3次；用EasyPure Plant Genomic DNA Kit，（Transgen，EE111-01）提取花粉的DNA。將提取出的花粉DNA作為模板，使用優(yōu)化后的PCR體系對(duì)20份市售槐花蜂蜜進(jìn)行PCR擴(kuò)增（模板用量 8μL ），擴(kuò)增產(chǎn)物用 1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1刺槐物種特異的基因組DNA片段挖掘

從NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)下載刺槐的高通量測(cè)序reads數(shù)據(jù)，并進(jìn)行多輪DNA序列相似性比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)刺槐基因組DNA中存在1個(gè)長(zhǎng)3141bp的物種特異DNA片段。以該片段為分子檢測(cè)靶標(biāo)，設(shè)計(jì)得到PCR引物RpsF1（ 5' -ACCAGCGAGTCTGCTATTCC-3'）和RpsR1（ 5' -GGTAACAACTGGCACGAACA-3'），該引物對(duì)的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 257bp 。

2.2 PCR的模板用量的優(yōu)化

以RpsF1/RpsR1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增得到的刺槐基因組DNA片段（ 257bp 進(jìn)行TA克隆，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEASY-Rps257，重組質(zhì)粒濃度為 10.26ng/μL ，對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)為2429817201copies /μL ，稀釋5/6倍后濃度為的2024847667copies /μL ，約 2×109 copies/μL。對(duì)該模板進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)瑯?gòu)建 2×10⁹ ！ 2×10⁸ 、 2×10⁷ 、 2×10⁶ 2×10⁵ 、 2×10⁴ 、 2×10³ 、 2×10² ！ 2×10¹ copies /μL 的重組質(zhì)粒梯度稀釋液，并作為模板進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增：隨著質(zhì)粒模板拷貝數(shù)的降低，RpsF1/RpsR1擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳條帶亮度不斷降低，當(dāng)模板濃度降低至 2×10⁴ copies/ μL 時(shí)條帶亮度明顯降低，如圖1所示。因此初步選擇 2×10⁴ copies 'μL 作為后續(xù)PCR體系優(yōu)化時(shí)的模板用量。

1：陰性對(duì)照（ ）；2-5：質(zhì)粒模板濃度依次為 2×10⁵ 2×10⁴ ，2×10³ 2×10² copies/μL。

2.3 PCR的退火溫度的優(yōu)化

在 52.0～67.0^°C 之間設(shè)置8個(gè)不同的退火溫度（52.0、53.1、54.9、57.7、61.1、64.0、65.9、 67.0°C ），以 2×10⁴ copies /μL 的重組質(zhì)粒pEASY-Rps257為模板，對(duì)引物RpsF1/RpsR1的退火溫度進(jìn)行初步優(yōu)化，以 1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)退火溫度過(guò)低（ 52.0C，53.1C 和 54.9‰ ）時(shí)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，退火溫度設(shè)置為 67.0‰ 依然有清晰單一的目的條帶。進(jìn)一步以57.0、57.7、58.9、60.8、63.1，65.0，66.3，67.0^°C 為退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示以8個(gè)不同退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增均獲得了單一的擴(kuò)增條帶，其中退火溫度為58.9、60.8、63.1⁶C 和 65^°C 時(shí)，條帶亮度最高，如圖2所示。條帶6與條帶7亮度一致且都較為明亮，故選擇63.1°C 作為引物RpsF1/RpsR1的退火溫度。

2.4PCR體系的靈敏度

以重組質(zhì)粒pEASY-Rps257梯度稀釋液為模板，在 20μL 的PCR反應(yīng)體系中以優(yōu)化后的退火溫度下進(jìn)行42個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增，當(dāng)模板濃度高于

1：陰性對(duì)照（ ；2-9：退火溫度依次為57.0、57.7、58.9、60.8、

63.1、65.0、66.3、67.0℃。

2×10⁵ copies /μL 時(shí)候，模板量飽和，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶亮度沒(méi)有明顯區(qū)別。隨著模版濃度的降低，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶的亮度不斷降低，當(dāng)模板拷貝數(shù)降低至2copies μL 時(shí)依舊可以擴(kuò)增出目的片段，如圖3所示。因此， 20μL 的PCR反應(yīng)體系中，引物RpsF1/RpsR1可檢測(cè)出的最低質(zhì)粒模板量為 8.55× 10^-9ng ，即8.55ag，對(duì)應(yīng)拷貝數(shù)為2.0copies。

1-10：質(zhì)?？截悢?shù)依次為 2×10⁹ 2×10⁸ / 2×10⁷ ， 2×10⁶ 2×10⁵ 2×10⁴，2×10³，2×10²，2×10¹， 2×10⁰ copies/uL。

2.5 PCR體系的特異性檢測(cè)

為分析基于刺槐基因組特異DNA片段設(shè)計(jì)的PCR引物的特異性，分別提取刺槐、刺桐、龍爪槐、羊蹄甲、皂莢、豌豆、野豌豆、四季豆、蠶豆、紫荊等豆科植物的基因組DNA，以RpsF1/RpsR1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明引物RpsF1/RpsR1具有良好的特異性：除刺槐DNA外，其余DNA樣品均未能擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的DNA；雖然以龍爪槐DNA為模板同樣檢測(cè)到擴(kuò)增條帶，但其大小與預(yù)期大小不一致，如圖4所示。

1-10分別為以刺槐、蠶豆、皂莢、龍爪槐、刺桐、豌豆、羊蹄甲、野豌豆、紫荊、四季豆基因組DNA為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.6 市售蜂蜜樣本的PCR檢測(cè)

從沃爾瑪、永輝、京東及紅旗連鎖賣(mài)場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)20份刺槐（洋槐）蜂蜜，如表1所示。其中19份蜂蜜的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為GB14963，1份執(zhí)行德國(guó)瑯尼斯企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。從蜂蜜中分離花粉并提取DNA，以前述PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果顯示：從四川健生、江西景福和江西偉多利購(gòu)買(mǎi)的3份洋槐蜂蜜樣本擴(kuò)增得到2個(gè)

DNA片段，其中較大的DNA片段與預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致，另一較小的DNA片段與龍爪槐的擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致，說(shuō)明該蜂蜜中含有龍爪槐花粉;其余17款刺槐蜂蜜樣品均成功擴(kuò)增得到單一、明亮的目的DNA條帶，說(shuō)明這17款蜂蜜中均含有刺槐花粉，如圖5所示。

3分析與討論

刺槐（RobiniapseudoacaciaL.）也被稱(chēng)為洋槐，是豆科刺槐屬落葉喬木，具有很高的園林綠化觀賞價(jià)值，其花香濃郁，花粉在醫(yī)藥上用作健胃劑和鎮(zhèn)靜劑。洋槐蜂蜜具有洋槐特有的清香，在我國(guó)出口的蜂蜜品種當(dāng)中，洋槐蜂蜜的出口量很大，深受?chē)?guó)外消費(fèi)者喜愛(ài)。我國(guó)出人境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T4848規(guī)定的洋槐蜂蜜實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法和季小榮等[11]所用檢測(cè)靶標(biāo)為葉綠體matK基因，該基因序列保守，標(biāo)準(zhǔn)中所用引物（F：GCTCAACCAGGA ACGATC; R： GCAGCATTTGACTACGTACCA）與毛洋槐（Robiniahispida）、毒鼠豆（Gliricidiasepium）、朝鮮槐（Maackiaamurensis）、多枝棘豆（Oxytropisramosissima）等近緣種及阿薩姆蓼（Persicariaassamica）、春蓼（ P. maculosa）等遠(yuǎn)緣種基因組的特定區(qū)段 100% 匹配，無(wú)法有效區(qū)分這些近緣種和遠(yuǎn)緣種。將李紅亮[12]和劉桐羽[13]所設(shè)計(jì)的引物和探針提交NCBI的核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列相似性比對(duì)，均能與多個(gè)植物甚至動(dòng)物物種的核酸序列高度匹配，說(shuō)明這兩種核酸檢測(cè)方法的物種特異性均沒(méi)有保障。陳誼[14]、楊術(shù)鵬[15]等開(kāi)發(fā)的洋槐蜜鑒別方法，均未對(duì)檢測(cè)方法的特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究將 SRA 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi？）下載的刺槐高通量測(cè)序read與近緣種基因組比對(duì)后淘汰比對(duì)上的數(shù)據(jù)，未比對(duì)上的數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝并提交NCBI的NT數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列相似性比對(duì)，選擇未能與NT數(shù)據(jù)庫(kù)任何核酸序列比對(duì)上的DNA片段作為刺槐物種特異的DNA片段，成功挖掘到1條長(zhǎng)度為3141bp的物種特異DNA片段。因目前刺槐基因組尚未公布，該序列未能定位至刺槐基因組的任何一條染色體上，且將其提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)不上任何基因序列。因此，本研究所用的分子檢測(cè)靶標(biāo)序列挖掘方法即對(duì)后續(xù)所設(shè)計(jì)引物的特異性奠定了良好基礎(chǔ)。隨后我們選擇了刺桐、龍爪槐、羊蹄甲、皂莢、豌豆、野豌豆、四季豆、蠶豆、紫荊等豆科近緣種的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，也證實(shí)了我們所設(shè)計(jì)的引物具有良好的物種特異性，能有效區(qū)分刺桐等豆科近緣種。

因刺槐基因組尚未公布，在對(duì)檢測(cè)體系的靈敏度進(jìn)行分析時(shí)，直接使用刺槐基因組DNA溶液作為模板無(wú)法計(jì)算DNA靶標(biāo)的拷貝數(shù)，因此本研究通過(guò)TA克隆構(gòu)建檢測(cè)靶標(biāo)的重組質(zhì)粒，測(cè)量其濃度并精確換算得到模板的拷貝數(shù)。分析確定本研究所建立檢測(cè)體系的靈敏度達(dá)到8.55ag，對(duì)應(yīng)拷貝數(shù)為2.0copies（ 20μL 的PCR反應(yīng)體系）。而行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T4848和季小榮等所述桉樹(shù)花蜜檢測(cè)體系的靈敏度為 10fg^[11] ，楊艷歌等報(bào)道的麥盧卡蜂蜜核酸檢測(cè)體系的靈敏度為 1pg/μL^[16] ，與本研究類(lèi)似，2套檢測(cè)體系在進(jìn)行靈敏度分析時(shí)所用DNA模板均為重組質(zhì)粒（DNA標(biāo)準(zhǔn)品），但檢測(cè)靈敏度均不如本研究所建立的檢測(cè)體系，這可能與我們所設(shè)計(jì)引物的特異性更好有關(guān)，這與我們前期基于相同策略建立的馬鈴薯晚疫病檢測(cè)技術(shù)體系和釀膿鏈球菌檢測(cè)技術(shù)體系的靈敏度較已報(bào)到的檢測(cè)體系靈敏度更高是一致的[17-18]。

基于上述刺槐蜂蜜檢測(cè)技術(shù)體系對(duì)市售洋槐蜂蜜進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率達(dá)到 100% 。但因?yàn)榉涿跠NA濃度較低，檢測(cè)過(guò)程中模板用了達(dá)到了 8μL 。雖然已有多種蜂蜜中花粉DNA提取方法的報(bào)道，但提取效果仍不夠理想，未來(lái)的蜂蜜檢測(cè)技術(shù)體系開(kāi)發(fā)過(guò)程中還應(yīng)更多關(guān)注高質(zhì)量DNA提取方法的研發(fā)。

4結(jié)束語(yǔ)

本研究結(jié)合生物信息學(xué)成功挖掘到一條刺槐物種特異的基因組DNA片段，并基于該片段開(kāi)發(fā)了一套刺槐蜂蜜定性檢測(cè)技術(shù)體系，該體系具有良好的物種特異性，能有效區(qū)分龍爪槐、刺桐、羊蹄甲等豆科近緣種， 20μL 檢測(cè)體系中，可檢測(cè)出的最低質(zhì)粒模板量為2.0拷貝，能有效檢出市售蜂蜜中的刺槐成分。

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（編輯：徐柳）