基于微流控芯片的腫瘤細(xì)胞球三維培養(yǎng)及藥物篩選研究

中圖分類號(hào)：TB39文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Research on three-dimensional culture and drug screening of tumor cell spheres based on microfluidic chips

XUE Zhiwei， ZHENG Lulu （School of Optical-Electrical and Computer Engineering， University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 20oo93，China）

Abstract： Three-dimensional culture of tumor cell spheres can truly simulate the growth environment of tumor cels in vivo， and thus be more suitable for drug screening and other related research. Combined with microfluidic technology， there are more ways to implement threedimensional cell culture technology. In this study，a microfluidic chip for high-throughput threedimensional tumor cell spheres culture was designed to enable rapid cultivation and drug screening of tumor cell spheres based on microcavity arrays. Compared to the current mainstream threedimensional culture that takes 4 days， microfluidic chips only require 15h to form tumor spheres. It significantly saves cultivation time. The reliability of three-dimensional culture in the chip was verified by tumor growth morphology monitoring and fluorescence imaging technology.

Meanwhile， this research realized multi-drug rapid screening based on chip， presented good gradient dependence and verified the feasibility of drug screening in chip. This high-throughput microfluidic chip can be applied in multiple research fields such as oncology， providing a new technological means and experimental platform for achieving rapid drug screening in tumors.

Keywords： microfluidic chip; three-dimensional culture; drug screening

引言

在世界范圍內(nèi)，癌癥患者的發(fā)病和死亡數(shù)量持續(xù)增長(zhǎng)。根據(jù)中國國家癌癥中心與美國癌癥協(xié)會(huì)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：2022年，中國和美國分別有大約482萬和192萬的新發(fā)癌癥病例，以及321萬和 61萬的癌癥死亡病例[1-2]。腫瘤學(xué)中最具挑戰(zhàn)性的問題之一就是抗癌藥物的開發(fā)與藥效評(píng)估速度。與其他適應(yīng)癥藥物相比，腫瘤藥物從臨床前研發(fā)到I期臨床試驗(yàn)獲得批準(zhǔn)的成功率低至7% 。考慮到腫瘤藥物臨床開發(fā)的高成本和長(zhǎng)耗時(shí)，迫切需要更好的臨床前藥物篩選平臺(tái)[3]

在培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞時(shí)，通常采用的是二維培養(yǎng)技術(shù)。但越來越多的研究表明，相比于真實(shí)人體環(huán)境，二維培養(yǎng)單層腫瘤細(xì)胞的過程中既缺失了許多組織特異性結(jié)構(gòu)，也缺少細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用4。而采用三維培養(yǎng)獲得的腫瘤細(xì)胞球、類器官、器官芯片等則保留了許多重要的生物學(xué)功能[5-。有些功能在二維培養(yǎng)的單層細(xì)胞中會(huì)遭到破壞。這使得人們對(duì)三維培養(yǎng)技術(shù)愈發(fā)感興趣。

多細(xì)胞球培養(yǎng)方法最早由Sutherland及其同事于1970年提出，用于研究腫瘤細(xì)胞的功能表型及其療效觀察。自此，球體培養(yǎng)作為一種新的培養(yǎng)方式，應(yīng)用于多種細(xì)胞的培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，從腫瘤細(xì)胞球體表面到內(nèi)部致密細(xì)胞結(jié)構(gòu)之間可以形成氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)、代謝物及藥物等的含量梯度差。這對(duì)研究人體中腫瘤細(xì)胞的耐藥性具有重大意義[7-8]。Karlsson 等[]提出，相比于孔板培養(yǎng)的單層細(xì)胞，三維腫瘤細(xì)胞球因?yàn)樗幬飻U(kuò)散障礙、增殖緩慢、具有干細(xì)胞特征等原因，對(duì)同一種化療藥物會(huì)表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐藥性，更加接近臨床模型。然而，在腫瘤細(xì)胞球的培養(yǎng)過程中，如何促進(jìn)細(xì)胞聚團(tuán)，以及保證球體大小均勻是一項(xiàng)高難度的挑戰(zhàn)。常規(guī)腫瘤細(xì)胞球的培養(yǎng)方法有4種：使用低吸附培養(yǎng)板培養(yǎng)、懸滴培養(yǎng)、動(dòng)態(tài)灌注培養(yǎng)和基于微流控技術(shù)的細(xì)胞3D打印。

隨著超精密加工技術(shù)的進(jìn)步，微腔結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)聚團(tuán)的影響效果得到重視，越來越多的研究者開始使用微孔陣列進(jìn)行三維細(xì)胞形態(tài)的培養(yǎng)。2017年，Gumuscu等[10]制作了約含500個(gè)水凝膠隔間的微流控三維培養(yǎng)平臺(tái)，用于人腸道細(xì)胞與腸道細(xì)菌相互作用的高通量研究。Baptista等[1]利用聚合物薄膜微腔陣列進(jìn)行了人類支氣管類器官的培養(yǎng)。他們先在基質(zhì)膠液滴中進(jìn)行了器官預(yù)培養(yǎng)，然后將預(yù)培養(yǎng)的器官轉(zhuǎn)人到微腔陣列芯片中。結(jié)果顯示，類器官在微腔中可繼續(xù)生長(zhǎng)7周，從而驗(yàn)證了類器官能夠在微腔環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)。Brandenberg等[12在聚合物-水凝膠底物的微腔陣列中培養(yǎng)了數(shù)千個(gè)胃腸道細(xì)胞球，并進(jìn)行了實(shí)時(shí)分析。

本研究基于微流控芯片加工技術(shù)，設(shè)計(jì)了一種微腔陣列芯片。采用該芯片，構(gòu)建了同步完成腫瘤細(xì)胞球快速三維培養(yǎng)與高效藥物篩選的全流程解決方案。討論了常見化療藥物，吉西他濱（Gemcitabine）與伊立替康（Irinotecan）對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞系（4T1）腫瘤細(xì)胞球的抑制作用。結(jié)果顯示，細(xì)胞死亡率與所用藥物濃度成正比。相比于傳統(tǒng)孔板，采用微流控芯片可縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間、減少試劑消耗、簡(jiǎn)化操作流程。本研究為三維細(xì)胞球的快速培養(yǎng)及藥物篩選提供了新的技術(shù)方案。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)所用試劑：磷酸鹽緩沖鹽溶液（phos-phatebuffer solution，PBS）、RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetalbovine serum，F(xiàn)BS）、青霉素/鏈霉素溶液（ 100× ）購于賽默飛公司，Calcein-AM/PI雙染試劑盒購于東仁化學(xué)科技（上海）有限公司，光刻膠SU-82150購于MicroChem公司，CountingKit-8（CCK-8）細(xì)胞增殖試劑盒購于UElandy公司，伊立替康（CPT-11）、吉西他濱（LY-188011）均購于美國Selleck公司。

主要儀器：紫外曝光機(jī)（SUSSMicroTecMJB4，德國）、臺(tái)式勻膠機(jī)（SC-1B，中國）、激光共聚焦顯微鏡（CarlZeissLSM900，德國）、酶標(biāo)儀（TECANMNano，瑞士）。

1.2 微流控芯片的制備

采用autoCAD軟件進(jìn)行微流控芯片的設(shè)計(jì)，使用軟光刻方法制作兩層結(jié)構(gòu)的微流控芯片。用第一層光刻基座制作圍欄，見圖1（a）；用第二層光刻微柱陣列模型制作微腔陣列，見圖1（b）。在直徑為 100mm 的硅片拋光面上依次進(jìn)行勻膠和光刻。首先，通過第一層掩膜版「見圖1（c）對(duì)光刻膠進(jìn)行曝光，顯影后形成基座結(jié)構(gòu)；然后，利用套刻對(duì)準(zhǔn)系統(tǒng)將第二層掩膜版「見圖1（d）]的微腔結(jié)構(gòu)與基座精確對(duì)準(zhǔn)，進(jìn)行二次光刻。

完成陽模制備后，將聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMs）預(yù)聚體與固化劑按 10：1 質(zhì)量比混合，并充分?jǐn)嚢?，?jīng)真空脫氣后澆注至經(jīng)三甲基氯硅烷疏水化處理后的模具表面，經(jīng) 80^°C 加熱固化 ^2h 后剝離。將剝離得到的PDMS層浸泡在異丙醇中，洗去表面殘留的三甲基氯硅烷，再用去離子水清洗3遍，得到PDMS微流控芯片結(jié)構(gòu)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

器在芯片的每個(gè)大腔室中注入 4μL 消化好的細(xì)胞懸液（約含5000個(gè)細(xì)胞）。將芯片置于培養(yǎng)皿中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置 30～45min ，待細(xì)胞自然沉降后，向芯片中加入培養(yǎng)基，至沒過整塊芯片。再將芯片置于培養(yǎng)箱（溫度 37^°C ，濕度95% ， CO₂ 體積分?jǐn)?shù) 5% ）中培養(yǎng)。每隔1d，將芯片內(nèi)舊的培養(yǎng)基沿微腔邊緣抽出，再注入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行換液。

小鼠乳腺癌細(xì)胞系（4T1）購自美國細(xì)胞培養(yǎng)協(xié)會(huì)細(xì)胞庫，用RPMI1640培養(yǎng)基（按體積分?jǐn)?shù)添加 10% 胎牛血清、 1% 青霉素和 1% 鏈霉素）在細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Corning，430641）中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔1d更換1次培養(yǎng)基，每隔3d傳代1次，傳代比例為 1：4 。細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為：溫度 37^°C ！濕度 95% ！ CO₂ 體積分?jǐn)?shù) 5% 。

1.4芯片中細(xì)胞接種

接種細(xì)胞前，需將制作完成的PDMS微流控芯片用錫紙包裹，放入壓力鍋進(jìn)行高溫滅菌（ 0.1MPa ， 120°C ， 20min ）。傳代時(shí)，用移液

1.5 細(xì)胞熒光染色

腫瘤細(xì)胞球在芯片上生長(zhǎng)完成后，使用Calcein-AM/PI雙染試劑盒進(jìn)行細(xì)胞染色，染色時(shí)間為 30min 。Calcein-AM可進(jìn)人活細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)酯酶作用下水解產(chǎn)生綠色熒光；PI則不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞，但可進(jìn)入膜破損的死細(xì)胞并與核酸結(jié)合產(chǎn)生紅色熒光。通過檢測(cè)綠色熒光（活細(xì)胞）和紅色熒光（死細(xì)胞）的分布與強(qiáng)度，可區(qū)分細(xì)胞存活狀態(tài)及評(píng)估化合物或環(huán)境的毒性效應(yīng)。

1.6 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)

藥物處理后細(xì)胞的活性檢測(cè)采用CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒，并利用酶標(biāo)儀進(jìn)行陣列掃描，獲得檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 微流控芯片的設(shè)計(jì)

為了實(shí)現(xiàn)高通量的腫瘤細(xì)胞球培養(yǎng)，芯片設(shè)計(jì)為由多組規(guī)則間隔的微腔組成，其核心設(shè)計(jì)思路包括：1）培養(yǎng)初期，單個(gè)微腔可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞快速聚集，這是形成均勻腫瘤細(xì)胞球的關(guān)鍵；2）微腔為細(xì)胞提供穩(wěn)定且獨(dú)立的生長(zhǎng)環(huán)境，促使細(xì)胞排列為規(guī)則陣列；3）通過調(diào)控微腔幾何結(jié)構(gòu)及微環(huán)境，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞球的多樣化操作。

最終確定，芯片采用直徑為 500μm 的微腔陣列結(jié)構(gòu)，并采用軟光刻的方法進(jìn)行塑模，見圖2（a）。制作完成后的微流控芯片外觀呈正方形，見圖2（b）。單個(gè)微腔直徑為 500μm ，每2個(gè)微腔間隔為 50μm ，9個(gè)微腔組成一個(gè)大的腔室，即構(gòu)成一個(gè)單陣列，如圖2（c）所示。單個(gè)陣列為邊長(zhǎng) 2mm 的正方形，每2個(gè)陣列之間間隔 1mm ，整個(gè)芯片由 6×6 個(gè)單陣列組成，如圖2（d）所示。每個(gè)單陣列包含 3×3 個(gè)微腔陣列，整個(gè)芯片總計(jì)324個(gè)微腔，最多可同時(shí)對(duì)6種不同藥物進(jìn)行檢測(cè)，每種藥物可設(shè)置6個(gè)濃度梯度。整塊芯片可放在細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2芯片中細(xì)胞球的培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)選用源于BALB/c小鼠常見的小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1，它被廣泛用于研究人類乳腺癌的體外腫瘤模型中。將正常傳代生長(zhǎng)的4T1細(xì)胞消化后，取部分細(xì)胞懸液進(jìn)行芯片接種。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，單個(gè)微腔接種細(xì)胞數(shù)約為500個(gè)。微腔的限域效應(yīng)可促進(jìn)細(xì)胞快速聚團(tuán)。接種完成后，通過顯微鏡持續(xù)拍攝以記錄細(xì)胞球形成過程，結(jié)果如圖3所示?？梢钥吹剑航臃N1h后，細(xì)胞完全沉入微腔中；6h后，細(xì)胞開始慢慢聚團(tuán)生長(zhǎng)； 15h 后，細(xì)胞開始明顯聚團(tuán)，并形成細(xì)胞球體； 48h 后，細(xì)胞形成致密腫瘤細(xì)胞球，可用于

藥物篩選實(shí)驗(yàn)。

傳統(tǒng)三維細(xì)胞培養(yǎng)通常采用包被過的普通細(xì)胞培養(yǎng)板或超低吸附圓底培養(yǎng)板，細(xì)胞接種后48h 才出現(xiàn)聚團(tuán)效應(yīng)，至第4d才形成成熟的腫瘤細(xì)胞球。而采用微流控芯片可將腫瘤細(xì)胞球形成周期縮短至 15h ，有助于顯著提升高通量藥物篩選效率。

為檢測(cè)微腔培養(yǎng) 48h 后細(xì)胞的活性，使用Calcein-AM/PI在微腔內(nèi)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，染色后的共聚焦熒光顯微鏡成像結(jié)果見圖4?？梢钥吹?，微腔內(nèi)腫瘤細(xì)胞球直徑約為 200μm 。其中圖4（a）為PI染色結(jié)果，顯示有少量細(xì)胞核呈紅色熒光；圖4（b）為Calcein-AM染色結(jié)果，顯示細(xì)胞球形態(tài)完整，僅外圍存在未聚團(tuán)的零散細(xì)胞；圖4（c）為雙染色疊加圖像，微腔內(nèi)細(xì)胞大部分呈綠色熒光，極少量細(xì)胞核呈紅色熒光，表明腫瘤細(xì)胞球中細(xì)胞狀態(tài)良好。

為觀察微腔培養(yǎng)的細(xì)胞球體的立體結(jié)構(gòu)，使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)單個(gè)微腔中的腫瘤細(xì)胞球進(jìn)行 z 軸掃描三維重構(gòu)，掃描間隔 1μm ，總計(jì)掃描120層，重構(gòu)得到的三維模型結(jié)構(gòu)如圖5所示?？捎^察到，腫瘤細(xì)胞球整體結(jié)構(gòu)完好，細(xì)胞存活率大于 95% 。

2.3芯片中藥物篩選

針對(duì)小鼠乳腺癌腫瘤細(xì)胞球，選用吉西他濱和伊立替康這2種臨床常見的化療藥物進(jìn)行篩選測(cè)試。根據(jù)初篩結(jié)果，并參考藥物臨床使用情況[13]，將復(fù)篩濃度梯度確定為： 10nmol/L 、100nmol/L ！ 1μmol/L 7 10μmol/L 和 100μmol/L 。

為驗(yàn)證微流控芯片中藥物篩選結(jié)果的可靠性，同時(shí)使用96孔板進(jìn)行4T1細(xì)胞的培養(yǎng)及藥物篩選實(shí)驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的樣本量為3個(gè)，則1張微流控芯片可同時(shí)進(jìn)行2種藥物5種不同濃度的篩選。

由于所采用的細(xì)胞系不同，測(cè)試中細(xì)胞的死亡情況與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果存在差異。藥物作用^48h 后，使用CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，吉西他濱與伊立替康對(duì)細(xì)胞的殺傷效果存在濃度依賴性，且

4T1細(xì)胞對(duì)吉西他濱相對(duì)敏感，在低濃度組即出現(xiàn)細(xì)胞死亡，而伊立替康只在高濃度時(shí)表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞抑制作用。化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用存在選擇性，這與Lopez等[14]的報(bào)道結(jié)果一致。由于腫瘤細(xì)胞球具有致密性，藥物對(duì)其殺傷效果較在96孔板中培養(yǎng)的二維細(xì)胞更弱，即腫瘤細(xì)胞球存活率更高。該現(xiàn)象符合文獻(xiàn)研究結(jié)果[9]，同時(shí)也證實(shí)了三維細(xì)胞球模型能更好地模擬腫瘤在體內(nèi)的真實(shí)狀況。

3結(jié)論

本文通過軟光刻的方法，制作了一種可用于腫瘤細(xì)胞高效藥物篩選的微流控芯片，通過微腔陣列的微孔結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的快速聚團(tuán)生長(zhǎng)。傳統(tǒng)的二維永生化或原代單層細(xì)胞系不能反映體內(nèi)組織的異質(zhì)性結(jié)構(gòu)，而芯片培養(yǎng)的方法可以克服這些限制，形成更接近人體環(huán)境的腫瘤細(xì)胞球體結(jié)構(gòu)。原有三維細(xì)胞培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)，從細(xì)胞接種到形成致密細(xì)胞球通常需要4d。且基于96孔板或384孔板的藥物篩選涉及繁瑣的細(xì)胞接種與加藥操作，且在大規(guī)模藥物篩選測(cè)試時(shí)，消耗的試劑與細(xì)胞量較多。本文設(shè)計(jì)的微流控芯片制作成本低，細(xì)胞用量少，能同時(shí)進(jìn)行多種藥物的篩選。且每個(gè)單陣列中的9個(gè)微腔可同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞接種與加藥，單個(gè)陣列中不同微腔間的環(huán)境高度相似。微腔結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)有利于腫瘤細(xì)胞快速形成致密性的三維細(xì)胞球結(jié)構(gòu)。單次實(shí)驗(yàn)中，1張芯片可設(shè)計(jì)用于6種藥物6個(gè)濃度梯度的篩選。本文選取了2種臨床常見的化療藥物進(jìn)行藥物篩選測(cè)試，效果良好，證實(shí)了該芯片可用于藥物篩選。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本文設(shè)計(jì)存在幾個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)：快速形成的腫瘤細(xì)胞球更適合用于藥物篩選；減少了培養(yǎng)試劑與藥物試劑的消耗；在進(jìn)行大規(guī)模藥篩時(shí)，極大程度地減少了細(xì)胞培養(yǎng)與藥物篩選所需的時(shí)間。后續(xù)可進(jìn)一步探究不同的微腔環(huán)境，以更好地模擬人體內(nèi)結(jié)構(gòu)和環(huán)境。微腔陣列芯片為快速細(xì)胞培養(yǎng)和藥物篩選提供了一個(gè)重要的平臺(tái)，在腫瘤細(xì)胞藥物篩選方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

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（編輯：李曉莉）