基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的藤梨根治療結(jié)直腸癌的機(jī)制研究

[摘要] 目的 通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，探討藤梨根治療結(jié)直腸癌的作用機(jī)制。方法 通過中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫和疾病數(shù)據(jù)庫篩選出藤梨根主要化學(xué)成分的作用基因和疾病基因。通過蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析主要基因，對主要化學(xué)成分和關(guān)鍵靶點進(jìn)行分子對接。測定藥物對腫瘤細(xì)胞的影響，檢測信號通路關(guān)鍵蛋白水平。結(jié)果 藤梨根治療結(jié)直腸癌的主要成分為槲皮素、β-谷甾醇、蘆薈大黃素、兒茶素；作用靶點144個；蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的主要基因是AKT1、TP53、MAPK1、JUN及TNF等；識別網(wǎng)絡(luò)中的模塊共5個，參與多種生物過程和信號通路。各主要成分與靶點的對接活性極佳或較好。一定濃度的藥物可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，且影響細(xì)胞PI3K/AKT信號通路。結(jié)論 藤梨根通過多途徑、多靶點治療結(jié)直腸癌，PI3K/AKT信號通路是可能的機(jī)制。

[關(guān)鍵詞] 藤梨根；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接；結(jié)直腸癌

[中圖分類號] R259" """"[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A""" [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2025.17.011

Study on the mechanism of Actinidia Chinensis Planch Radix in treating colorectal cancer based on network pharmacology

MA Chenyang， WANG Yu， YANG Shaohui， LU Jun

Department of Colorectal Surgery， Ningbo Medical Center Lihuili Hospital ， Ningbo 315000， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To explore the medicinal mechanism of Actinidia Chinensis Planch Radix （ACPR） in the treatment of colorectal cancer （CRC） by network pharmacology and molecular docking technology. Methods The genes involved in the effects of the main chemical components and disease genes of ACPR were screened from the TCM database and disease database. The main genes were analyzed through protein interaction network analysis， and molecular docking was performed on the main chemical components and key targets. The effects of the drug on tumor cells were measured， and the levels of key proteins in the signaling pathway were detected. Results The primary components of ACPR for treating CRC include quercetin， β-sitosterol， aloe baicalin， and catechin. It targets 144 protein interaction sites and were involved in the protein interaction network， with key genes including AKT1， TP53， MAPK1， JUN， and TNF. The recognition network includes five modules that were involved in various biological processes and signaling pathways. The main components exhibited excellent or good activity when interacting with these targets. At a certain concentration， the drug could inhibit the proliferation， invasion， and migration of colorectal cancer cells and affect the PI3K/AKT signaling pathway. Conclusion ACPR has been used to treat colorectal cancer through multiple pathways and multiple targets， among which the PI3K/AKT signaling pathway may be the mechanism.

[Key words] Actinidia Chinensis Planch Radix; Network pharmacology; Molecular docking; Colorectal cancer

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，除常規(guī)的手術(shù)和放化療外，傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療CRC的價值逐漸受到重視^[1-2]。藤梨根（Actinidia Chinensis Planch Radix，ACPR）作為治療惡性腫瘤的經(jīng)典用藥，在腫瘤細(xì)胞生物過程中的作用和功效逐漸被發(fā)掘^[3]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，探討ACPR治療CRC的分子生物學(xué)過程和機(jī)制。

1 "資料與方法

1.1 "ACPR化學(xué)成分及相對應(yīng)作用靶點的檢索和篩選

通過傳統(tǒng)中醫(yī)藥化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫（TCMSP數(shù)據(jù)庫、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫、ETCM數(shù)據(jù)庫等）以關(guān)鍵詞“藤梨根”“獼猴桃根”檢索。考慮到ACPR及其相關(guān)方劑大都經(jīng)口服用，故有效化學(xué)成分的口服生物利用度需gt;30%，類藥性需gt;0.18。將檢索到的化學(xué)成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索對應(yīng)的目標(biāo)基因，利用Unitprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步整理。

1.2" 基因靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析

在OMIM數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索CRC疾病相關(guān)基因，去除重復(fù)和評分較低部分。將作用靶點和疾病靶點進(jìn)行匯總，導(dǎo)入FunRich 3.1.3 軟件繪制韋恩圖，交集部分即是藥物作用疾病的核心靶點。使用Cytoscape3.8.2軟件，繪制“藥物-化學(xué)成分–靶點–疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 "蛋白–蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將核心靶點提交STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行蛋白–蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。PPI網(wǎng)絡(luò)中密度較高區(qū)域可能代表分子復(fù)合體，稱為模塊。通過其具有的MCODE功能識別出 PPI網(wǎng)絡(luò)的子網(wǎng)，并對其參與的生物學(xué)過程進(jìn)行描述。

1.4" 基因本體論分析和京都基因與基因組百科全書富集分析

將得到的核心基因靶點導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫平臺，行基因本體論（gene ontology，GO）生物過程（biological process，BP）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。進(jìn)一步預(yù)測其參與的生物過程和信號通路。通過SwissDock平臺模擬藥物成分和蛋白結(jié)構(gòu)的對接結(jié)合能。

1.5 "實驗驗證

1.5.1 "材料與方法" 用不同濃度（分別設(shè)為0、100μg/ml、500μg/ml）ACPR水提物培養(yǎng)基，培育 正常生長的腫瘤細(xì)胞48h；隨后恢復(fù)普通培養(yǎng)基繼續(xù)培育，進(jìn)行相關(guān)的實驗操作。人腸癌細(xì)胞系 SW480 由寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院實驗室提供。ACPR水提物由浙江中醫(yī)藥大學(xué)提供。MTT 試劑盒（中國碧云天公司）；Western blot試劑盒（中國碧云天公司）；Matrigel 膠采（美國Corning公司）；Transwell 小室（美國Costar公司）；單克隆抗體（美國Abcam公司）。

1.5.2 "測定細(xì)胞增殖能力 "提取適量正常狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞常規(guī)接種于96孔板，并設(shè)置12h、24h、48h、72h的培養(yǎng)時間梯度。依據(jù)設(shè)定的各時間節(jié)點，按照MTT比色法，加入試劑盒內(nèi)提供的20μl MTT溶液。根據(jù)說明書檢測570nm吸光度值。

1.5.3 "腫瘤細(xì)胞侵襲實驗和遷移實驗 "①侵襲實驗：Transwell上室內(nèi)平鋪50μl稀釋后的Matrigel膠晾干后備用。各組SW480細(xì)胞替換為不含胎牛血清的培養(yǎng)基，并配置為細(xì)胞懸液，以密度（1～2）×10?個/ml、容量200μl接種至Transwell上室，下室為500μl含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基。常規(guī)培育48h，擦除Matrigel膠。0.1%結(jié)晶紫溶液染色20min。隨機(jī)選取5個100倍視野進(jìn)行統(tǒng)計。②遷移實驗：將CRC細(xì)胞在六孔板內(nèi)平鋪接種，每孔2ml，密度（2～3）×10?個/ml，3個復(fù)孔。培育24h；在確認(rèn)腫瘤細(xì)胞正常平鋪生長后，以200μl的移液器槍頭在六孔板內(nèi)垂直劃線，間距0.5～1.0cm范圍內(nèi)，隨后替換更改為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培育24h。測量培養(yǎng)前后所畫細(xì)胞間隙間的垂直距離，得到劃痕愈合率。

1.5.4" 蛋白免疫印跡法對標(biāo)志蛋白的測定 "收集各實驗組的細(xì)胞，運用預(yù)冷的裂解液提取細(xì)胞的總蛋白，并加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟化物避免樣品中蛋白水解，測定其濃度，留取樣本備用。根據(jù)濃度進(jìn)一步計算和配置樣品，按照試劑盒說明書進(jìn)行上樣、電泳和轉(zhuǎn)膜，用BSA封膜。常溫下，將硝酸纖維素膜浸入封閉液內(nèi)1h，進(jìn)行封閉。依次在冰箱冷藏環(huán)境（4℃）孵育一抗約10～12h，常溫下孵育二抗2h。條帶顯影使用試劑盒內(nèi)提供的增強型化學(xué)發(fā)光液，拍照并記錄各條帶情況。用Image J軟件完成條帶灰度值的計算。

1.6 "統(tǒng)計學(xué)方法

采用 SPSS 18.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（"）表示，組間比較采用t檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 "結(jié)果

2.1 "ACPR 關(guān)鍵靶點預(yù)測

共檢索到ACPR有效成分26種，按照條件篩選，得到的6種主要化學(xué)成分為槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、蘆薈大黃素、兒茶素、（+）-表兒茶素。6種化學(xué)成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫中共檢索到173個作用靶點，見表1。在疾病數(shù)據(jù)庫中檢索到1337個CRC較高評分的靶點。藥物作用靶點和疾病功能靶點交集的共同靶點114個。

2.2 "“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

基于“藥物–靶點–成分–藥物”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系信息繪制“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)中不同成分、靶點及其關(guān)系分別用不同節(jié)點和灰色連線表示。其中，化學(xué)成分作用的靶點越多，其“藍(lán)色方形”越大。軟件分析計算各化學(xué)成分節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)鋵W(xué)數(shù)據(jù)信息，見表1。槲皮素作用靶點最多，β-谷甾醇、蘆薈大黃素和（+）-表兒茶素作用靶點較少，而豆甾醇和兒茶素幾乎無作用靶點，見圖1。

2.3" PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

基于114個核心靶點構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)中各基因靶點與其他基因相關(guān)關(guān)系的密切程度進(jìn)行排序，與其他基因靶點關(guān)系越密切，則作為核心靶點基因的可能性越高；其中就包括AKT1、TP53、JUN、MAPK1、TNF、RELA、IL-6等。經(jīng)Metascape數(shù)據(jù)庫MCODE功能對核心靶點進(jìn)一步分析其潛在的子網(wǎng)，識別模塊，見圖3。部分生物學(xué)過程的功能描述見表2。

2.4 "富集分析與分子對接結(jié)果

富集分析各靶點基因可能存在的生物過程包括對無機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、對外來生物刺激的反應(yīng)、對激素的反應(yīng)等?？赡艽嬖诘男盘柾钒[瘤信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化和PI3K/Akt信號通路等。各配體（藥物所含的重要化學(xué)成分）和受體（基因所對應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)）分子對接結(jié)果見圖4。其中β-谷甾醇與MAPK1的結(jié)合能數(shù)值最大（8.52kJ/mol），相互作用更易實現(xiàn)。

2.5 "實驗驗證

對不同藥物濃度處理過的SW-480細(xì)胞系進(jìn)行MTT檢測，當(dāng)藥物濃度達(dá)到一定時（500μg/ml），ACPR對結(jié)腸癌增殖能力產(chǎn)生抑制。通過Transwell侵襲實驗，500μg/ml藥物濃度處理過的高濃度組腫瘤細(xì)胞的侵襲能力與遷移能力差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），見圖5。

檢測不同組的樣品中PI3K和AKT蛋白磷酸化水平發(fā)現(xiàn)，高濃度組腫瘤細(xì)胞的PI3K和AKT蛋白磷酸化水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），提示該信號通路可能受到抑制。

3 "討論

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門新興的交叉學(xué)科，是從多靶點、多通路、多層面利用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)視角審查和研究傳統(tǒng)中醫(yī)藥的有效工具。利用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)逐步解析中醫(yī)藥治療惡性腫瘤的內(nèi)在機(jī)制，以期發(fā)掘傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的獨特價值。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認(rèn)為ACPR性寒味苦，可用于治療腫毒、癌癥^[4]?？紤]到傳統(tǒng)中醫(yī)藥大都經(jīng)口服用、通過胃腸道消化吸收，對數(shù)據(jù)庫中檢索到的藥物成分按照一定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，可見并不是所有的化學(xué)成分均發(fā)揮實際作用。通過這些化學(xué)成分的作用靶點和CRC的疾病靶點進(jìn)行匯總并經(jīng)拓?fù)鋵W(xué)計算，發(fā)現(xiàn)槲皮素是作用靶點最多的化學(xué)成分。研究表明槲皮素可通過抑制M2巨噬細(xì)胞極化和下調(diào)hsa_circ_0006990抑制CRC的發(fā)生，并通過抗炎作用在體內(nèi)抑制腫瘤活性^[5-6]。ACPR提取液對肝細(xì)胞癌的相關(guān)藥物研究就有類似的發(fā)現(xiàn)，ACPR的主要化學(xué)成分槲皮素可通過多種基因靶點和信號通路抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力^[7]。

PPI分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)AKT1、TP53等經(jīng)典腫瘤相關(guān)基因^[8-9]。此外，整個PPI網(wǎng)絡(luò)中還存在密度較高區(qū)域，即模塊，這些區(qū)域可能代表分子復(fù)合體，是具有生物學(xué)意義的集合。這種意義包括兩方面： ①作為蛋白質(zhì)復(fù)合體，多種蛋白間相互協(xié)同發(fā)揮生物學(xué)作用；②作為功能模塊，尤其是位于同一信號通路的多個蛋白分子，通過信號承接，對生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)作用更加密切^[10]。通過對關(guān)鍵靶點基因進(jìn)行富集分析，本研究發(fā)現(xiàn)ACPR作用CRC涉及的信號通路最重要的是在惡性腫瘤方面。Hu等^[11]發(fā)現(xiàn)ACPR提取物可通過Notch信號通路促進(jìn)CRC細(xì)胞凋亡，進(jìn)而顯著抑制腫瘤的生長。Gao等^[3]對胃癌的研究發(fā)現(xiàn)ACPR通過促進(jìn)凋亡、鐵死亡和抑制間質(zhì)轉(zhuǎn)化實現(xiàn)對胃癌細(xì)胞進(jìn)展的抑制作用，并在斑馬魚的動物模型中得到印證。

利用計算機(jī)模擬各個化學(xué)成分間相互作用的可能性，可為相關(guān)基礎(chǔ)實驗提供前期參考。本研究中β-谷甾醇與MAPK1的結(jié)合能數(shù)值最大，二者間最容易發(fā)生相互作用。Sharmila等^[12]的研究表明β-谷甾醇可抑制MAPK1（Erk2）功能，通過MAPK信號通路實現(xiàn)抗腫瘤作用，與本研究結(jié)果類似。

進(jìn)一步的基礎(chǔ)實驗也驗證了前述分析結(jié)果，但基礎(chǔ)實驗是在細(xì)胞水平進(jìn)行的，無法模擬人體內(nèi)復(fù)雜結(jié)構(gòu)和腫瘤所處微環(huán)境。綜上，ACPR可通過多種信號通路和作用靶點實現(xiàn)對CRC的抑制，其中PI3K/AKT信號通路是其可能機(jī)制。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2025–03–07）

（修回日期：2025–05–09）

基金項目：浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（2022KY1081，2023KY1045）

通信作者：魯俊，電子信箱：56389756@qq.com