小麥TaLFNR1-7A基因的生物信息學(xué)及表達(dá)分析

中圖分類號：S512 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號： 1000-4440（2025）06-1041-09

Abstract：Feritin-NADP+reductase（FNR）isan important enzyme that playsa crucial role inphotosynthesis and cellularrespiration processs.Thisstudyusedcommon wheatChinese Spring as the materialandcloned the TaLFNR1-7A geneusing RT-PCR technology.Bioinformaticsand gene expresion analysis were performedon it.The resultsshowed that the CDS sequence length of TaLFNR1-7A gene was 1O86bp，encoding 361 aminoacids.The encoded protein was a nontransmembrane stablehydrophilicprotein，withoutasignalpeptide，containing atotalof39phosphorylation sites.It was predicted tobelocalizedinthechloroplast.Phylogeneticanalysisandmultipleaminoacid sequence alignmentrevealed that common wheat（Chinese Spring）and emmer wheat exhibitedcloserphylogenetic proximity basedon the TaLFNR1-7A gene，with a sequence similarity of 97.01% . Analysis of promoter cis-acting elements revealed that the TaLFNRl-7A gene contained17cis-acting elements，including seven light-responsive elements.TheqRT-PCRanalysisrevealed that the expresionof TaLFNR1-7Agene was highestin wheat leaves，folowedbystems and germs，with thelowestlevelobserved in

roots.TheTaLFNR1-7A generespondedtomultipleabioticstresses，including drought（PEG-6OOO treatment），methyl jasmonate（MeJA），sodiumchloride（NaCl），andabscisicacid（ABA）.The findings ofthisstudyprovideasignificantfoundation forfurther exploringthe functionalmechanisms of the TaLFNR1-7A gene in wheat growth anddevelopment.

Keywords：wheat；TaLFNRl-7A gene；bioinformatics；gene cloning；expression analysis

小麥（TriticumaestivumL.）作為全球主要糧食作物之一，在世界范圍內(nèi)具有不可或缺的地位。作物的光合效率在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，因?yàn)樽魑锷L發(fā)育和產(chǎn)量的形成離不開光合作用，光合效率直接決定了作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，因而發(fā)掘、鑒定并利用與光合能力相關(guān)的主要功能基因，對小麥品種遺傳改良具有重要作用。

鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶是一種重要的酶，廣泛存在于植物、藍(lán)藻和一些細(xì)菌中，它在光合作用和細(xì)胞呼吸中起到核心作用，主要負(fù)責(zé)催化鐵氧還蛋白（FD）與NADP+之間的電子傳遞。FNR是一種包含黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）輔因子的黃素蛋白。FAD在電子轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用。植物中FNR蛋白可根據(jù)其功能和定位差異分為兩類：一類是位于光合組織（主要是植物葉片的葉綠體）中的LFNR（葉型FNR蛋白）；另一類是存在于非光合組織（主要是根部質(zhì)體）中的RFNR蛋白（根型FNR蛋白），這兩類FNR蛋白各自有多個同源蛋白[4]。根型FNR在非光合質(zhì)粒中催化相反的反應(yīng)（鐵氧還蛋白的還原）[5-8]；葉型FNR主要催化光合作用中線性電子傳遞（LET）的最后一步反應(yīng)，即促使電子從還原態(tài)的FD轉(zhuǎn)移至 NADP⁺ ，生成的還原型輔酶Ⅱ主要用于卡爾文循環(huán)中的 CO₂ 固定以及葉綠體內(nèi)其他代謝過程[9-10]。前人研究結(jié)果表明，在擬南芥中兩種不同的核基因編碼兩種LFNR亞型，它們的等電點(diǎn)（pI）不同[1]，這兩種LFNR蛋白（LFNR1和LFNR2）只在綠色組織中積累，并存在于3種不同的葉綠體區(qū)室（類葉綠體膜、基質(zhì)和內(nèi)膜）中。在擬南芥fmr2突變體中，AtLFNR1既以與類囊體膜結(jié)合的形式存在，也以可溶性蛋白的形式存在，而在fnr1突變體中，AtLFNR2僅以可溶性蛋白的形式存在于基質(zhì)中，這表明在擬南芥中，AtLFNR1對于AtLFNR2的膜附著至關(guān)重要，且AtLFNR1-AtLFNR2異源二聚體的形成可能介導(dǎo)了這種附著[12]。在玉米中研究發(fā)現(xiàn)，其基因組中含有3個同源的LFNR基因，分別命名為ZmLFNR1、ZmLFNR2、ZmLFNR3，這3種LFNR基因之間相似性達(dá) 83% ＼～92% 。然而，前人研究發(fā)現(xiàn)，3個ZmLFNR具有不同的膜結(jié)合特征，ZmLFNR1特異性定位在類囊體膜上，ZmLFNR3蛋白不與膜結(jié)合，只存在于葉綠體基質(zhì)中，而ZmLFNR2蛋白既能與膜結(jié)合，又存在于葉綠體基質(zhì)中[4，13]。在水稻中研究發(fā)現(xiàn)有2個同源的

LFNR基因，分別命名為OsLFNR1和OsLFNR2，兩者的相似性達(dá)到 80% ，有趣的是，這兩個LFNR基因的表達(dá)具有拮抗現(xiàn)象，即當(dāng)其中一個LFNR基因超表達(dá)時，另一個LFNR基因的表達(dá)不管是在轉(zhuǎn)錄水平還是在蛋白質(zhì)水平都會受到明顯的抑制[14]。在小麥中研究發(fā)現(xiàn)有4個不同的LFNR同源蛋白。這些LFNR可以劃分成2個組：LFNRI和LFNRⅡ，每組都包括2個不同的LFNR，2個LFNR之間只在N-端存在幾個氨基酸的差異[13，15]，小麥LFNR蛋白N-端的差異可能會導(dǎo)致其活性、葉綠體內(nèi)分布以及對不同鐵氧還蛋白親和力的改變[16]。在大腸桿菌中，F(xiàn)NR 是活性氧（ROS）清除所必需的[17-18]。從小麥fnr1基因突變體可見，小麥葉片黃化、光合作用受阻、生長發(fā)育不良，相關(guān)研究結(jié)果表明，這種現(xiàn)象是由于突變體中NADPH/NADP+的比值顯著下降所致，而NADPH參與葉綠體中活性氧的清除和氧化還原平衡的維持，其較差的活性氧清除能力導(dǎo)致小麥更容易遭受脅迫傷害?？偠灾?，LFNR基因在植物抵抗脅迫的過程中非常重要。

綜上所述，LFNR基因在植物生長發(fā)育過程中以及在應(yīng)對環(huán)境脅迫時均發(fā)揮至關(guān)重要的作用。本研究在中國春小麥中克隆TaLFNR1-7A基因并探究其在非生物脅迫中的響應(yīng)，同時進(jìn)行生物信息學(xué)分析并預(yù)測其相關(guān)功能，用RT-PCR和qPCR檢測該基因在小麥各組織中的時空表達(dá)差異和在脅迫中的響應(yīng)，初步解析TaLFNR1-7A基因在小麥中的生物學(xué)功能，為后期深入研究奠定基礎(chǔ)，并為選育優(yōu)良小麥品種提供候選基因。

材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以普通小麥中國春種子胚芽以及15d幼苗的根、莖、葉片為供試材料。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1植物總RNA提取與cDNA的合成將中國春小麥胚芽以及幼苗的根、莖、葉片分別利用RNA提取試劑盒（廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司生產(chǎn)的OMEGA試劑盒）提取RNA，用紫外分光光度計測定RNA的濃度并檢測其重量。利用南京諾唯贊生物科技股份有限公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成根、莖、葉片以及胚芽的cDNA。

1.2.2 TaLFNR1-7A基因的克隆 從本實(shí)驗(yàn)室

ZY96-3轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中分析篩選獲得TaLFNR1-7A基因，根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫已有的基因登錄號從Ensem-blPlants數(shù)據(jù)庫中下載目的基因核苷酸序列，設(shè)計特異性引物（表1），并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。以中國春小麥 15d 組培苗cDNA為模板，使用 2× PhantaMaxMasterMix以及特異性引物對基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送至北京擎科生物科技股份有限公司對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。

1.2.3生物信息學(xué)分析使用在線軟件對TaLFNR1-7A基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。使用Ex-PASy-ProtParam （ https：//web. expasy. org/prot-param）、Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu. edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2）、TMHMM（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）、NCBI Con-served Domain Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi） 、SingalP 4.O Server（ht-tps：//services. healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1）、Expasy ProtParam（https：//web.expasy.org/protscale/）、PSIPRED（http：//bioinf. cs.ucl.ac.uk/psipred/）、NetPhos 3.1 Server（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）、Blast（ht-tps：//blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）和 SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）等在線軟件，分別對蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)域、保守結(jié)構(gòu)域等進(jìn)行分析。Blast在線獲取TaLFNR1-7A的同源氨基酸序列，并對TaLFNR1-7A基因構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化樹，篩選出與TaLFNR1-7A基因同源性比較高的基因，最后對基因序列進(jìn)行比對。1.2.4組織表達(dá)分析為了檢測TaLFNR1-7A基因表達(dá)情況，利用中國春小麥種子胚芽以及幼苗的根、莖、葉片cDNA為模板并使用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR檢測。反應(yīng)體系為： 1.0μL cDNA 模板、10.0μL TaqPro Universal SYBRqPCR Master Mix 、上下游引物各 0.4μL （濃度為 10μmol/L ） 8.2μL ddH₂0 ，總體積為 20.0μL 。反應(yīng)條件設(shè)置為：預(yù)變性 95°C3min ，接著進(jìn)行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括：（204號 95%10s，60c30s ，使用 2^-ΔΔCt 計算各組織中的相對表達(dá)量。

1.2.5TaLFNR1-7A基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應(yīng)分別對 15d 苗齡中國春小麥?zhǔn)┘?50mmol/L 脫落酸（ABA）、 100mmol/L 茉莉酸甲酯（MeJA）、250mmol/L氯化鈉（NaCl）以及 20% 聚乙二醇（PEG-6000）模擬干旱處理，分別在 0h，3h，6h，12h，24 h，48h，72h 取葉片提取植物總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后進(jìn)行qRT-PCR檢測基因表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaLFNR1-7A基因的克隆

以普通小麥中國春 15d 幼苗的葉片cDNA為模板，利用引物TaLFNR1-7A-F和TaLFNR1-7A-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳。由圖1可見TaLFNRI-7A基因在 1086bp 處有明顯條帶，測序結(jié)果與基因組數(shù)據(jù)庫中的基因序列一致。

2.2TaLFNR1-7A基因編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位

利用ExPASy-ProtParam工具對TaLFNR1-7A基因編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析。結(jié)果顯示，該基因編碼的蛋白質(zhì)共有361個氨基酸。其分子式為C1 776H2799N469O532S.9，相對分子量為39842.73，等電點(diǎn)為8.48。此蛋白質(zhì)包含44個帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（ Asp+Glu ），48個帶正電荷的氨基酸殘基（ Arg+Lys） 。據(jù)分析該蛋白質(zhì)總原子數(shù)為5595，脂溶性指數(shù)為74.04，而不穩(wěn)定系數(shù)為34.36。綜合推測該蛋白質(zhì)屬于穩(wěn)定性蛋白質(zhì)。使用Cell-PLoc2.0在線工具進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果顯示TaLFNR1-7A基因編碼的蛋白質(zhì)定位在葉綠體上。

2.3TaLFNR1-7A基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)以及二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)

對TaLFNR1-7A基因編碼蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)其不含有跨膜結(jié)構(gòu)域，說明TaLFNR1-7A蛋白為非跨膜蛋白。

應(yīng)用NetPhos3.1Server在線工具分析結(jié)果（圖3）表明，TaLFNR1-7A基因編碼的蛋白質(zhì)共含有39個磷酸化位點(diǎn)，其中有17個絲氨酸（Serine）、13個蘇氨酸（Threonine）和9個酪氨酸（Tyrosine）磷酸化位點(diǎn)，這些磷酸化位點(diǎn)可能在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性、穩(wěn)定性和相互作用中發(fā)揮重要作用。

保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果如圖4所示，TaLFNR1-7A基因編碼蛋白質(zhì)屬于PLN03115家族蛋白質(zhì)。其翻譯的LFNR在葉綠體線性電子轉(zhuǎn)移中起著很好的作用，也與光系統(tǒng)I（PSI）周圍的循環(huán)電子轉(zhuǎn)移有關(guān)。

根據(jù)SignalP4.1Server進(jìn)行的蛋白質(zhì)信號肽分析結(jié)果顯示，TaLFNR1-7A蛋白的信號肽可能性得分為0.261，這表明該蛋白質(zhì)沒有信號肽。此外，應(yīng)用SignalP3.0Server預(yù)測顯示TaLFNR1-7A蛋白為非分泌蛋白。

TaLFNR1-7A蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果見圖7，預(yù)測其為一種葉片鐵氧還蛋白-NADP+還原酶，氨基酸序列一致性為 84.03% ，推測該蛋白質(zhì)可能參與光合電子轉(zhuǎn)遞途徑中的非環(huán)式電子傳遞。

2.4基于TaLFNR1-7A基因的同源關(guān)系

在NCBI-BLAST中得到烏拉爾圖小麥（Triticumurartu）節(jié)節(jié)麥（Aegilopstauschii）水稻（OryzasativaL.）等22個物種的LFNR蛋白氨基酸序列。使用MEGA11工具構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖8），從圖8可知，基于TaLFNR1-7A基因普通小麥中國春與二粒小麥、烏拉爾圖小麥、節(jié)節(jié)麥的同源關(guān)系較近。

2.5 TaLFNR1-7A順式作用元件

利用PlantCARE在線工具進(jìn)行TaLFNR1-7A基因啟動子順式作用元件預(yù)測，結(jié)果顯示共有17種順式作用元件，其中含赤霉素響應(yīng)元件（P-box）、脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）、參與茉莉酸甲酯反應(yīng)的順式調(diào)控元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）等，以及7個光響應(yīng)元件（AE-box、GATA-motif、GT1-motif、Sp1、TCCC-motif、TCT-motif、ARE）和與分生組織表達(dá)相關(guān)的順式調(diào)控元件（CAT-box）等。

2.6TaLFNR1-7A基因的組織表達(dá)

為比較TaLFNR1-7A基因在普通小麥中國春不同組織中的表達(dá)量，對TaLFNR1-7A基因進(jìn)行qRT-PCR檢測（圖10）。利用中國春小麥幼苗根、莖、葉片以及種子胚芽的cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR，以Actin為內(nèi)參基因。結(jié)果顯示，TaLFNR1-7A基因在葉片中表達(dá)量最高，其次是在莖中和胚芽中，表達(dá)量最低的為根部。

2.7TaLFNR1-7A基因在不同脅迫下的表達(dá)

15d苗齡的普通小麥中國春TaLFNR1-7A基因在 50mmol/L ABA、100mmol/L MeJA .250mmol/L NaCl、 20% PEG-6000模擬干旱脅迫下不同時間的表達(dá)量如圖11所示，在PEG-6000模擬干旱處理后6h 和 ^48h 基因表達(dá)量與 0h 相比極顯著增高（ Plt; 0.01）， ^12h 和 72h 與 ^0h 相比顯著增高（ Plt; 0.05）;MeJA脅迫 6h 時TaLFNR1-7A基因表達(dá)量顯著低于 0h （ Plt;0.05） ，其余脅迫時間極顯著低于 （ Plt;0.01 ）； NaCl 脅迫處理 ^12h 時基因表達(dá)量與0h 相比極顯著增高， ³h 和 ^72h 與 ^0h 相比極顯著降低；ABA脅迫處理 24h 基因表達(dá)量與 0h 相比極顯著增高， ³h 和 ^12h 與 0h 相比極顯著降低。綜上可知，TaLFNRI-7A基因?qū)EG-6OOO、MeJA、NaCl和ABA脅迫均有一定程度的響應(yīng)。

3討論

本研究結(jié)果表明，普通小麥中國春TaLFNR1-7A基因在葉片、莖和胚芽中的表達(dá)量極顯著高于在根中的表達(dá)量，而且預(yù)測發(fā)現(xiàn)TaLFNR1-7A基因編碼蛋白質(zhì)定位于葉綠體，這與趙秀秀等[9的研究結(jié)果相同。由此可知TaLFNR1-7A基因編碼葉型鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶，催化鐵氧還蛋白和NADP+之間的電子轉(zhuǎn)移，在光合作用和細(xì)胞呼吸過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，TaLFNR1-7A基因CDS序列長度為 1086bp ，共編碼361個氨基酸，這一結(jié)果與吳曉佩[20]對文心蘭的研究結(jié)果有所不同。通過生物信息學(xué)分析特定基因編碼的蛋白質(zhì)，可以預(yù)測其相關(guān)生物學(xué)功能，有助于揭示基因的結(jié)構(gòu)和功能，為進(jìn)一步深入研究該基因的生物學(xué)功能提供指導(dǎo)。

TaLFNR1-7A蛋白屬于非跨膜的穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)，無信號肽，這些與趙秀秀等[19]對黃金芽茶樹LFNR基因預(yù)測分析結(jié)果相同。通過對TaLFNR1-7A相近的多個基因序列及分子進(jìn)化關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，TaLFNR1-7A基因與來自于二粒小麥中的LFNR基因生物學(xué)功能比較接近。這些結(jié)果表明，TaLFNR1-7A基因序列在不同小麥中相對保守。本研究中TaLFNRI-7A基因?qū)BA、MeJA、NaCl和PEG-6000模擬干旱等脅迫處理均有響應(yīng)，MeJA是廣泛存在于植物中的植物生長調(diào)節(jié)劑，對植物生長發(fā)育以及抵抗不良環(huán)境影響有積極影響[21-22]，TaLFNR1-7A在 100mmol/L MeJA脅迫下基因表達(dá)量與脅迫前相比顯著下降，與文心蘭LFNR基因在0.2mmol/LMeJA脅迫下的表達(dá)趨勢有所不同[23]非生物脅迫條件下，植物細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的穩(wěn)態(tài)被破壞，導(dǎo)致ROS迅速積累，調(diào)控基因表達(dá)和細(xì)胞代謝，使植物迅速響應(yīng)脅迫并作出調(diào)整以適應(yīng)環(huán)境變化。而FNR基因的缺失則會導(dǎo)致植物內(nèi)ROS的過度累積，本研究中，在 NaCl 脅迫處理下隨著時間增加TaLFNRI-7A基因表達(dá)量出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在 ^12h 時達(dá)到最高，與李蓉等[23]的研究結(jié)果一致。PEG-6000模擬干旱處理在 6h.48h 表達(dá)量顯著升高，維持NADPH/NADP+的穩(wěn)定，提高對ROS的清除能力以抵御脅迫對植物的侵害。本試驗(yàn)對TaLFNR1-7A基因的研究結(jié)果為今后更深層次研究提供了重要信息。

4結(jié)論

普通小麥中國春TaLFNR1-7A基因的功能機(jī)制涉及多個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究成功克隆了中國春小麥中的TaLFNR1-7A基因，對其進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)和表達(dá)分析。結(jié)果表明，TaLFNR1-7A蛋白屬于非跨膜的穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)，定位于葉綠體。TaLFNR1-7A基因在葉片中表達(dá)量最高，表明其在光合作用中發(fā)揮重要作用。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，TaLFNR1-7A基因與二粒小麥LFNR基因具有高度相似性，表明其在不同小麥物種中具有較高的保守性。此外，TaLFNR1-7A基因響應(yīng)多種非生物脅迫（如PEG-6OOO 模擬干旱、NaCl、ABA和MeJA），表明其在植物應(yīng)對環(huán)境脅迫中可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。這些結(jié)果為進(jìn)一步解析TaLFNR1-7A基因在普通小麥生長發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)中的分子機(jī)制提供了重要基礎(chǔ)。今后可以通過功能驗(yàn)證試驗(yàn)（如基因敲除或過表達(dá)）進(jìn)一步探索其具體調(diào)控機(jī)制，為小麥抗逆育種提供理論支持和分子靶點(diǎn)。

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（責(zé)任編輯：黃克玲）