一例北美型和歐洲型豬藍耳病病毒混合感染的診斷

豬繁殖與呼吸綜合征（PorcineReproductive andRespiratorySyndrome，PRRS），俗稱豬藍耳病，臨床上主要表現(xiàn)為仔豬呼吸困難、生長緩慢、共濟失調；母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎等癥狀，是一種高度傳染性疾病，且具有較高的致病性。豬藍耳病的致病病原為藍耳病病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus，PRRSV），其基因變異和重組的發(fā)生率極高，因此，豬藍耳病在我國乃至世界都是防控的難點。

2024年3月，廣東省河源市某豬場引進豬苗2748頭，飼養(yǎng)日齡達82日齡時，豬陸續(xù)出現(xiàn)喘氣、呼吸障礙和死亡，其中發(fā)病568頭，發(fā)病率約 20.7% ；病死170頭，病死率約30% 。為減少豬場損失，確定其發(fā)病原因，養(yǎng)殖戶送檢樣品通過實驗室檢測分析進行診斷。

1材料與方法

1.1樣品來源

對豬場送檢三頭豬的血液進行檢測，待血清析出后，將血清轉移至1.5mLEP管中， 10000r/min 離心 ?5min ，取出上清液保存至 .80^qC 環(huán)境中備用。

1.2歐洲型和北美型豬藍耳病病毒二重PCR檢測

根據(jù)反應體系（ 25μL ）：PrimeScript 1 step Enzyme Mix1μL ， 2×1 step Buffer 12.5μL ，引物NA-ORF5-F、NA-ORF5-R、EU-ORF5-F、EU-ORF5 ?R^[2] （ 10μmolΛ ）各 0.5μL ，模板3 μL 無菌超純水 .6.5μL 反應條件如下： 50^qC 反轉錄 30min ： 95^°C 預變性3min； 95°C 變性 20s ， 58^°C 退火 20s ， 72% 延伸 60s 共計35個循環(huán)； 72% 終延伸5 imin_c 。將PCR產(chǎn)物進行 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像分析儀拍照保存分析。

1.3序列克隆

將確定為目標樣品的條帶進行切膠，將擴增出的豬藍耳病病毒陽性樣品PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4序列對比分析

使用megalign軟件進行序列比對，使用MEGA軟件、Chiplot繪制進化樹，進行遺傳進化分析。

2結果

2.1PRRSV二重PCR擴增結果

針對3份血液樣品進行歐洲型和北美型豬藍耳病病毒二重RT-PCR擴增（圖1），結果顯示，1、3號樣品中均擴增得到900bp大小的目的條帶，為北美型藍耳病病毒序列（包括ORF5全長基因序列）；2、3號樣品擴增含有1036bp大小的片段，為歐洲型豬藍耳病病毒序列（包括ORF5全長基因序列），其中3號樣品為歐洲型豬藍耳病病毒與北美型豬藍耳病病毒混合感染。

2.2同源性分析

將獲得的4條GP5基因序列HY-20240319-GP5-1（ 603bp ）HY-20240319-GP5-3（ 603bp ）、HY-20240319-Eu-GP5-2（ 606bp ）和HY-20240319-Eu-GP5-3（ 606bp ）與參考株進行同源性分析（圖2）。其中，HY-20240319-Eu-GP5-2和HY-20240319-Eu-GP5-3與歐洲型豬藍耳病病毒毒株BJEU06-1相似度最高，分別為 85.8% 和 186.0% ；HY-20240319-GP5-1、HY-20240319-GP5-3與北美型豬藍耳病病毒毒株QYYZ相似度最高，分別為 89.1% 和 88.9% ，詳見圖2。

2.3遺傳進化分析

將測序所得PRRSV毒株序列基于ORF5序列構建遺傳進化樹（圖3和圖4），所得序列HY-20240319-Eu-GP5-2和HY-20240319-Eu-GP5-3在同一個分支上，且與GDHY-3親緣關系較近，同屬于歐洲型毒株（圖3）；HY-20240319-GP5-1和HY-20240319-GP5-3與QYYZ等毒株在同一個大分支上，親緣關系較近，同屬于北美型毒株譜系3（圖4）。

3討論

豬藍耳病是困擾世界養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病，如今給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。引起該病的傳染性病原為豬藍耳病病毒（PRRSV），PRRSV是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬。根據(jù)病毒的抗原性、基因組及致病性差異可分為2個型：歐洲型（PRRSV-1）以LV株為代表，主要分布在歐洲；北美型（PRRSV-2）以VR2332株為代表，主要分布在美洲和亞洲PRRSV-1和PRRSV-2雖然可引起感染豬出現(xiàn)相似的臨床癥狀，但兩者基因組核苷酸序列存在較大差異，同源性僅有50%～60%^[3] 。我國報道出現(xiàn)最多的是北美型，歐洲型相對少見[4]。盡管實施大規(guī)模疫苗接種手段，但該疾病仍在世界范圍內造成巨大的經(jīng)濟損失。PRRSV具有變異速度快、極易發(fā)生重組的特點，導致其不斷演化產(chǎn)生大量新毒株[5目前，國內有關豬藍耳病歐洲型和北美型毒株混合感染的病例較少，但其造成的影響不容忽視。

PRRSV基因組全長約15kb，包含至少10個開發(fā)閱讀框，編碼8個結構蛋白（GP5、M、N、GP2a、E、GP3、GP4、GP5a）和14個非結構蛋白（NSP1至NSP14）[。PRRSV北美型和歐洲型均能在機體內、外引起細胞凋亡。而PRRSV所引發(fā)的細胞凋亡作用與GP5蛋白密切聯(lián)系[]。GP5是PRRSV結構蛋白中最易變異的區(qū)域之一，并存在多種突變類型，包括氨基酸的替換、缺失和插入。GP5蛋白常用于遺傳進化分析，且在病毒入侵、吸附、增殖及誘導宿主的中和抗體產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用，對于PRRSV的致病性、診斷、預防和控制具有重要意義[]。因此，本文采用二重RT-PCR擴增三份送檢血清，通過對測序所得GP5基因的核昔酸序列同源性分析和遺傳進化分析。結果表明：HY-20240319-GP5-1和HY-20240319-GP5-3屬于PRRSV-2（北美型）豬藍耳病毒Lineage3（QYYZ-like）亞型毒株；HY-20240319-Eu-GP5-2和HY-20240319-Eu-GP5-3屬于PRRSV-1（歐洲型）毒株。

該豬場存在PRRSV-1（歐洲型）和PRRSV-2（北美型）毒株混合感染，可能是購買豬苗時，沒有做到及時的豬藍耳病檢疫，造成混群后PRRSV-1和PRRSV-2相互感染傳播，引起重大的經(jīng)濟損失。本文的啟示是在今后購買豬苗時，一定要做好豬藍耳病等重要疫病的檢測檢疫，尤其是購買大量豬苗時，要做到分圈飼養(yǎng)、科學管理；實時關注疫病流行趨勢，發(fā)現(xiàn)疑似藍耳病癥狀出現(xiàn)立即隔離，并采集血液組織樣品進行檢測，一經(jīng)確診嚴格進行撲殺及無害化處理，并對豬場進行全面消毒，避免重大疫病暴發(fā)，最大程度上保障豬群健康，降低疫病造成的經(jīng)濟損失。

結語

豬藍耳病在我國流行近三十年，至今仍未能得到有效控制。如今我國養(yǎng)豬行業(yè)中，多為規(guī)?；B(yǎng)豬場，這使得豬場一旦感染藍耳病病毒就會迅速傳播，其重組、變異的速度也是越來越快，新的變異株和重組毒株的出現(xiàn)導致疫苗保護效力受到影響，使流行難以控制，最終對豬場的生產(chǎn)和經(jīng)濟造成影響。自1996年我國首次報道CH-1a株以來，我國所報道病例主要是感染北美型豬藍耳病病毒株，同時感染歐洲型和北美型豬藍耳病病毒的病例相對較少。本文對廣東省河源市某豬場送檢的血液樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)該豬場感染豬藍耳病病毒，并檢測到存在PRRSV-1（歐洲型）和PRRSV-2（北美型）毒株混合感染，對豬場造成了較大的經(jīng)濟損失。根據(jù)回顧性調查發(fā)現(xiàn)，豬場在選購豬苗時，從多家養(yǎng)殖場選購，并沒有執(zhí)行嚴格的豬藍耳病檢疫，故在豬苗混養(yǎng)后一段時間后，豬群發(fā)生豬藍耳病，造成較大的經(jīng)濟損失。針對藍耳病的防控，豬場應采用規(guī)范的免疫程序，定期免疫，定期抽檢、監(jiān)測，提高豬場生物安全，并密切關注豬藍耳病病毒流行趨勢和重組變異情況，提前做好預防措施，從而降低感染風險減少經(jīng)濟損失。

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收稿日期：2025-03-16

作者簡介：賈晗鐸（2002—），男，漢族，在讀碩士。研究方向：豬傳染病。*通訊作者：張偉（1979—），男，漢族，碩士，高級實驗師。研究方向：動物疫苗研發(fā)與疫病防控。