中圖分類號(hào):Q34 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1001-8395(2025)05-0666-06
doi:10.3969/j.issn.1001-8395.2025.05.001
1背景
微生物標(biāo)本的固化保藏是連接基礎(chǔ)研究與公眾科學(xué)傳播的關(guān)鍵紐帶,在全球范圍內(nèi),微生物污染是食源性疾病暴發(fā)的主要因素之一,據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),約 65% 的食源性疾病暴發(fā)源于微生物污染,而公眾對(duì)微生物形態(tài)特征認(rèn)知有限是防控意識(shí)薄弱的主要原因之一[].但傳統(tǒng)顯微鏡價(jià)格高昂并且在我國(guó)農(nóng)村地區(qū)普及率不足 12% ,極大程度上限制了微生物科普的推廣2].相比之下,微生物菌落固化標(biāo)本能突破設(shè)備和空間限制,實(shí)現(xiàn)可視化,其應(yīng)用場(chǎng)景已拓展至科普教育、科研存檔和藝術(shù)創(chuàng)作等領(lǐng)域.另外,細(xì)菌標(biāo)本的館藏要求培養(yǎng)的細(xì)菌樣本具有代表性和典型性,能夠反映特定菌群的特征.所制得的細(xì)菌平板應(yīng)凸顯菌落形態(tài)特征,同時(shí)能夠長(zhǎng)期陳列.因此,建立可視化的微生物標(biāo)本的制備方法對(duì)于館藏展覽和科普教育具有重要意義.
現(xiàn)有微生物平板標(biāo)本制作方法主要包括化學(xué)固定、物理包埋、低溫固化、顯微標(biāo)本制備和浸制法,但應(yīng)用于科普推廣仍存在一定局限.例如,化學(xué)固定中的甲醛熏蒸法雖保持菌落的立體度,但殘留甲醛濃度超標(biāo),缺乏生物安全性3;液氮速凍-樹脂復(fù)合技術(shù)雖能瞬間固定細(xì)菌形態(tài)的微結(jié)構(gòu),但設(shè)備成本高昂[4;顯微標(biāo)本制備和浸制法則需借助儀器觀察或定期更換保存液[5-6].因此,建立一種無(wú)毒、易運(yùn)輸、低成本、適用于長(zhǎng)期室溫保藏的微生物平板標(biāo)本制作方法刻不容緩.
UV膠是一種以丙烯酸酯為基礎(chǔ)的光固化材料,其主要成分包括基礎(chǔ)樹脂、活性單體、光引發(fā)劑及穩(wěn)定劑等7],在適當(dāng)波長(zhǎng)的紫外光照射下可以迅速發(fā)生固化反應(yīng),適合用于多種場(chǎng)合的塑封過(guò)程[8.UV膠具有固化速度快、制作過(guò)程簡(jiǎn)易環(huán)保的特點(diǎn),經(jīng)UV膠封層處理后的樣本可以有效隔絕空氣,避免水分喪失或氧化而變質(zhì),并且增大樣本表面硬度,有效避免了外力損傷,有利于長(zhǎng)期儲(chǔ)存和運(yùn)輸.因此,UV膠在制備微生物平板標(biāo)本的方面極具潛力.然而,在長(zhǎng)期儲(chǔ)存過(guò)程中,培養(yǎng)基常發(fā)生泛白、鹽結(jié)晶析出的現(xiàn)象,影響視覺效果.有研究通過(guò)降低培養(yǎng)基中鹽含量,或使用分子緊密度高的瓊脂糖替代瓊脂,以此提高培養(yǎng)基的透光性,進(jìn)而減少鹽結(jié)晶[9-10].此外,當(dāng)UV膠成分中存在某些染料或雜質(zhì)時(shí),紫外線會(huì)被選擇性地吸收導(dǎo)致吸收率下降[1],固化效率降低.過(guò)去研究表明,苯并三氮唑(1H-Benzotriazole,BTA)能夠有效地吸收或屏蔽波長(zhǎng)為 270~380nm 的短波紫外光,常被用作紫外輔助吸收劑,進(jìn)而提高UV膠固化后的透光度[12].紫外線殺菌技術(shù)具有安全性高、殺菌效果好、無(wú)污染的特點(diǎn),且不會(huì)對(duì)材料本身理化特性造成不利影響.紫外線主要通過(guò)破壞微生物核酸結(jié)構(gòu)從而造成突變,使其喪失復(fù)制和繁殖功能,從而達(dá)到殺菌的目的.研究表明,經(jīng)150W紫外燈照射20s后,塑料瓶?jī)?nèi)壁金黃色葡萄球菌和大腸桿菌數(shù)量可減少95% 以上,能有效殺滅大部分微生物[13-14].Lab色彩模型可以用來(lái)描述樣本的顏色要素,相比于人眼感知顏色效果更加穩(wěn)定且客觀,能更好地描述顏色之間的差異或相似度,其主要由亮度 L* 、紅綠偏移 a* 黃藍(lán)偏移b*三個(gè)參數(shù)構(gòu)成[15].
本研究基于紫外殺菌和UV膠的紫外固化特性,建立了一種適用于長(zhǎng)期室溫儲(chǔ)存的細(xì)菌平板標(biāo)本制備方法.通過(guò)選用丙烯酸酯型UV膠實(shí)現(xiàn)固化,并使光強(qiáng)梯度分布以提高固化均勻性.鑒于微生物平板標(biāo)本制作對(duì)美觀性的要求,我們針對(duì)于固化工藝開展了進(jìn)一步的優(yōu)化,包括調(diào)整培養(yǎng)基中的含鹽量以及添加一定比例的BTA至UV膠中,通過(guò)色差參數(shù)和視覺打分對(duì)其光學(xué)特性進(jìn)行評(píng)估,最終實(shí)現(xiàn)了基于UV膠光固化反應(yīng)制作細(xì)菌平板標(biāo)本方法的建立和優(yōu)化,為微生物平板標(biāo)本的制作提供了一種安全、高效、低成本的新方法,擴(kuò)大微生物平板標(biāo)本的科普應(yīng)用價(jià)值.
2 材料和方法
2.1主要儀器和試劑主要儀器:電子天平、立式壓力蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、50W紫外線燈、色差儀.
主要試劑:胰蛋白肺、酵母提取物、精制酵母粉、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、瓊脂、瓊脂糖、丙三醇、UV膠(卡速特品牌)BTA(純度 gt; 99.95% ).
2.2實(shí)驗(yàn)菌株本研究使用細(xì)菌菌株為大腸桿菌(Escherichiacoli)和解烷烴游動(dòng)微菌(Planomicro-biumokeanokoites).
2.3 實(shí)驗(yàn)方法
2.3.1UV膠制作細(xì)菌平板標(biāo)本新方法的建立LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成為:瓊脂 5g/L ,胰蛋白脈 10g/L 酵母提取物 5g/L ,氯化鈉 10g/L 按照上述組分稱量并溶于去離子水中, 121°C 高壓滅菌 20min 后倒平板,使每個(gè)培養(yǎng)血中培養(yǎng)基體積為 15mL 具體操作流程如圖1所示.將已活化的Escherichiacoli和Planomicrobiumokeanokoites分別接種至培養(yǎng)基上, 37°C 培養(yǎng) 24h. ,待細(xì)菌生長(zhǎng)至合適時(shí)期時(shí),使用36W紫外線燈照射殺菌 3~5h 以固定菌落后,于 45°C 條件下干燥,并將已預(yù)熱的UV膠鋪倒至菌落上,36W紫外線燈照射 5min 進(jìn)行光固化封層.置于室溫避光條件下 48h ,測(cè)定 L*,a*,b* 進(jìn)行色差分析,記錄 L*,a*,b*, 按照以下公式計(jì)算色差ΔE* 及色調(diào)角偏移.
2.3.2低鹽培養(yǎng)基優(yōu)化低鹽培養(yǎng)基組成為:胰蛋白肺 4.0g/L ,精制酵母粉 2.0g/L ,磷酸二氫鉀2.0g/L ,磷酸氫二鈉 10.67g/L ,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1% 的瓊脂糖.按照上述組分稱量并溶于去離子水中,其余步驟同2.3.1.實(shí)驗(yàn)組為低鹽培養(yǎng)基,對(duì)照組為基礎(chǔ)LB培養(yǎng)基.
2.3.3抗結(jié)晶培養(yǎng)基優(yōu)化抗結(jié)晶培養(yǎng)基組成為:胰蛋白膚 5.6g/L ,精制酵母粉 3.0g/L ,氯化鈉1.0g/L ,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1% 瓊脂糖,質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1% 丙三醇.按照上述組分稱量并溶于去離子水中,其余步驟同2.3.1.實(shí)驗(yàn)組為抗結(jié)晶培養(yǎng)基,對(duì)照組為基礎(chǔ)LB培養(yǎng)基.
2.3.4BTA優(yōu)化法向UV膠中添加體積分?jǐn)?shù) 0.5% 的BTA制成優(yōu)化膠,其余步驟同2.3.1.實(shí)驗(yàn) 組為優(yōu)化膠,對(duì)照組為UV膠,所用培養(yǎng)基均為基礎(chǔ) 培養(yǎng)基.
3結(jié)果
3.1UV膠制作細(xì)菌平板標(biāo)本新方法效果評(píng)價(jià)本研究通過(guò)色差參數(shù)對(duì)UV膠固化封存細(xì)菌標(biāo)本的光學(xué)特性進(jìn)行評(píng)估,總色差 ΔE* 綜合考慮了顏色明度、色相和飽和度3個(gè)方面,色相誤差 Δh* 反映了顏色在色相上的差異. E. coli和 P. ,okeanokoites體系封膠處理后的平板標(biāo)本示例如圖2所示.表1的數(shù)據(jù)顯示,在 E ,coli體系中,封膠處理使 L* 正向偏移,由39.36增至39.97, a 軸最大偏移為 +0.54,b *軸最大偏移為 +1.37 ,對(duì)應(yīng)的色調(diào)角偏移 Δh* 為 2.2° ,說(shuō)明封膠處理提高了培養(yǎng)基亮度,有利于細(xì)菌平板標(biāo)本觀察,基本符合館藏展覽的要求.同時(shí),在 P. okeanokoites體系中也表現(xiàn)出相似趨勢(shì), ?L* 由38.15增至39.64即亮度提高,對(duì)應(yīng)的色調(diào)角偏移 Δh* 為 2.8° .上述結(jié)果說(shuō)明在兩種細(xì)菌體系中,UV膠封存處理后的色度穩(wěn)定性均能滿足細(xì)菌平板標(biāo)本的觀賞需求[16.同時(shí),封膠后E.coli和 P- okeanokoites總色差 ΔE* 分別為1.59和1.94,均處于可接受色差范圍內(nèi) (ΔE*?3.0)[17 .因此,封膠處理能夠在較大程度上保持細(xì)菌平板標(biāo)本的原始光學(xué)特征,并提高標(biāo)本的亮度.
3.2低鹽條件對(duì)培養(yǎng)菌色差參數(shù)的影響如表2所示,經(jīng)UV膠封存處理后,低鹽培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌平板標(biāo)本的光學(xué)特性產(chǎn)生一定影響,低鹽培養(yǎng)基組中 E coli體系的 L* 由39.97提升到了40.75,在色度軸向上發(fā)生紅移和藍(lán)移,色調(diào)角偏移 Δh* 為 3.6° ,同時(shí),在 P ,okeanokoites體系中 L* 呈正向偏移,表現(xiàn)為亮度提升,同時(shí) a* 軸綠移, b* 軸黃移,色調(diào)角偏移 Δh* 為3.8° .上述兩種細(xì)菌的色差參數(shù)均說(shuō)明低鹽條件可在一定程度上提高培養(yǎng)基亮度,且維持菌落色彩的保真度.此外,封膠后 E? coli和 P? ,okeanokoites總色差 ΔE* 分別為0.82和0.76,符合CIEDE2000色差標(biāo)準(zhǔn)即 ΔE*lt;1.0 [18].綜上所述,低鹽培養(yǎng)基結(jié)合UV封膠技術(shù)有助于改善細(xì)菌平板標(biāo)本的亮度,同時(shí)又保持平板標(biāo)本上的細(xì)菌菌落色彩不受影響.
3.3丙三醇添加對(duì)培養(yǎng)基抗結(jié)晶能力的影響表 3的結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,添加丙三醇的培養(yǎng)基 對(duì)應(yīng) L* 呈現(xiàn)輕微偏移, E? ,coli體系對(duì)應(yīng) L* 由39.97 降至39.04,P.okeanokoites對(duì)應(yīng) L* 由39.64變?yōu)?39.69,說(shuō)明在培養(yǎng)基中添加丙三醇對(duì)于標(biāo)本的亮 度無(wú)太大影響.由表3可見,E.coli和P.okeanokoites總色差 ΔE* 分別為0.82和0.13,符合 CIEDE2000色差標(biāo)準(zhǔn)即 ΔE*lt;1.0[18] ,并且色度軸向 發(fā)生變化, a* 軸均呈現(xiàn)弱紅移, b* 軸均呈現(xiàn)藍(lán)移.據(jù) 此可知,添加丙三醇的培養(yǎng)基體系兼具亮度和色彩 的保真度,且在一定程度上降低培養(yǎng)基的黃化程 度,相比于基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出更優(yōu)的光學(xué)特性.
3.4BTA添加對(duì)UV膠性狀的影響針對(duì)于 E coli體系在UV膠中添加體積分?jǐn)?shù) 0.5% BTA進(jìn)行改性.由表4可見,與基礎(chǔ)UV膠組相比,BTA改性組L* 由39.97增高為41.07,發(fā)生正向偏移,表明BTA改性在一定程度上提高UV膠的亮度.BTA改性組的 a 軸最大偏移由-1.08變?yōu)?1.26,表明BTA改性對(duì)UV膠的紅綠色度影響較??; b* 軸最大偏移由-2.13變?yōu)?1.62,呈現(xiàn)藍(lán)移.上述結(jié)果說(shuō)明BTA能夠有效減少短波紫外光透過(guò),有效抑制UV膠照射后的黃變現(xiàn)象.綜上所述,利用BTA改性UV膠平板能夠在提升亮度的同時(shí),維持細(xì)菌平板標(biāo)本的色度穩(wěn)定性,使其光學(xué)特性更符合精細(xì)產(chǎn)品的需求[19].
3.5UV膠封存細(xì)菌平板標(biāo)本的觀察評(píng)價(jià)在統(tǒng)一光照條件下,以基礎(chǔ)LB培養(yǎng)基覆蓋UV膠組作為對(duì)照,對(duì)不同封存處理的細(xì)菌平板標(biāo)本進(jìn)行肉眼觀察,并采用“ + ”符號(hào)進(jìn)行量化,“ + ”越多表示觀察效果越優(yōu).結(jié)果如表5所示,與對(duì)照組相比,低鹽優(yōu)化培養(yǎng)基的亮度有所提升,增強(qiáng)了標(biāo)本的可視清晰度,而BTA改性UV膠在亮度和色彩穩(wěn)定性方面表現(xiàn)最佳,標(biāo)本色彩更自然,提升了可觀賞性.此外,三組實(shí)驗(yàn)組處理均不同程度地減輕了培養(yǎng)基久置后發(fā)生的泛白現(xiàn)象,降低了封膠層的泛黃程度,使標(biāo)本在長(zhǎng)期儲(chǔ)存過(guò)程中能夠保持較穩(wěn)定的外觀.因此,整體來(lái)看,優(yōu)化培養(yǎng)基配方與改性UV膠能改善細(xì)菌平板標(biāo)本的亮度和色彩穩(wěn)定性,基本滿足館藏展示的需求.
4討論
本研究成功建立并優(yōu)化了一種基于UV膠光固化反應(yīng)制作長(zhǎng)期室溫保藏細(xì)菌平板標(biāo)本的方法,并通過(guò)色差光學(xué)數(shù)據(jù)深入分析了該方法在色彩穩(wěn)定性和光學(xué)特性方面的優(yōu)勢(shì).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,UV封膠處理可有效提高培養(yǎng)基亮度,并維持細(xì)菌平板標(biāo)本色彩的穩(wěn)定性.例如,在 E .coli體系中,封膠處理使 L* 由39.36增至 39.97,P. :okeanokoites體系 L* 由38.15增至39.64,總色差 ΔE* 分別為1.59和1.94,均處于可接受范圍內(nèi) (ΔE*?3.0) ,表明UV封膠能保持標(biāo)本在長(zhǎng)期展示過(guò)程中的色度的穩(wěn)定性.為了進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)菌平板標(biāo)本在儲(chǔ)存及展覽中的美觀性,我們針對(duì)于培養(yǎng)基成分和UV膠配方進(jìn)行了適當(dāng)調(diào)整,主要通過(guò)降低培養(yǎng)基含鹽量并建立緩沖體系來(lái)優(yōu)化培養(yǎng)基配方.首先,低鹽培養(yǎng)基優(yōu)化后, E. coli和 P. ,okeanokoites體系的 L* 值均有所提升,總色差 ΔE* 分別為0.82和0.76,符合CIEDE2000色差標(biāo)準(zhǔn) (ΔE*lt;1.0) .這些結(jié)果表明,低鹽培養(yǎng)基不僅提高了細(xì)菌平板標(biāo)本的亮度和可視度,同時(shí)還能保持菌落的色彩保真度.此外,添加丙三醇的培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)顯示, E. coli和 P? okea-nokoites體系的亮度變化不明顯,但在色度軸向上發(fā)生一定程度的紅移和藍(lán)移.同時(shí),E.coli和 P okeanokoites的總色差 ΔE* 分別為1.20和0.13,處于可接受范圍內(nèi).表明添加丙三醇培養(yǎng)基可有效降低培養(yǎng)基的黃化程度,在一定程度上改善其光學(xué)特性,抑制培養(yǎng)基晶體析出從而提高穩(wěn)定性.另外,本研究通過(guò)添加BTA對(duì)UV膠進(jìn)行了改性,發(fā)現(xiàn) L* 由39.97增至41.07, b* 軸方向藍(lán)移,表明BTA改性UV膠不僅提高了平板標(biāo)本的亮度,還有效抑制了黃變現(xiàn)象.這可能是因?yàn)锽TA在光引發(fā)黏結(jié)過(guò)程中作為紫外吸收劑,吸收短波紫外線[20],從而減少因光照引起的化學(xué)降解,最終提高封膠層的光學(xué)穩(wěn)定性.本研究的優(yōu)化策略包括降低培養(yǎng)基鹽濃度、添加丙三醇提高抗結(jié)晶能力,以及采用BTA改性UV膠提升亮度和抗黃變能力.這些改進(jìn)措施在維持細(xì)菌平板標(biāo)本色彩保真度的同時(shí),提高了整體光學(xué)表現(xiàn),使標(biāo)本更適用于館藏展示.微生物學(xué)與藝術(shù)在過(guò)去一個(gè)世紀(jì)內(nèi)已有多次交叉融合,細(xì)菌作為視覺媒介在科學(xué)研究和藝術(shù)創(chuàng)作中均得到了廣泛應(yīng)用[21].因此,基于UV膠光固化的細(xì)菌平板標(biāo)本制作方法的開發(fā)在科學(xué)展示和科普教育方面展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用潛力.
5 結(jié)論
本研究首次利用UV膠光固化反應(yīng)對(duì)細(xì)菌平板標(biāo)本進(jìn)行安全、透明、高保真的封存,開發(fā)了一種基于UV膠光固化反應(yīng)的細(xì)菌平板標(biāo)本制作工藝,對(duì)細(xì)菌進(jìn)行安全塑封并且不會(huì)對(duì)平板的亮度造成影響,能夠維持美觀并以最大程度保留細(xì)菌菌落形態(tài).為了進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)菌平板標(biāo)本質(zhì)量,本研究對(duì)UV膠及培養(yǎng)基進(jìn)行改良,利用色差相關(guān)指數(shù)進(jìn)行評(píng)估,發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)整基礎(chǔ)培養(yǎng)基的含鹽量或添加丙三醇,能夠提高細(xì)菌平板標(biāo)本的亮度.此外,在UV膠中加入BTA可以在一定程度上緩解培養(yǎng)基變黃程度,使細(xì)菌平板標(biāo)本更具展示價(jià)值和觀賞性.
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A Novel UV-Photocuring Adhesive Method for Long-Term Preservation ofBacterial CulturePlatesforExhibition
ZHANG Jinmei, LI Binyu, YAN Chunmei, WU Wei, LI Chongyan,ZHOU Zhiwei, SUN Qun(College ofLifeSciences,Sichuan University,Chengdu 61oo65,Sichuan)
Abstract;Duetothelimitationsofthetfabrication methodsbytheraditionalbacterialplatespecimenintermsof ighttrasmittance,whitening,andlong-termroomtemperaturepreservation,these methodsareunsuitableformuseumexhibitions.Inthisstudy, a novelspecimenpreservationmethodofthebacterialplateasdevelopedbasedonUV-curableadesive,using Escherichiacolind Planomicrobiumokeanokoitesasrepresentativebacterialmodels.ByoptimizingtheculturemediumcompostionandmodifyingtheUV adhesive,thestudyachievedlong-temoomtemperatureconservatioof thespecimens.Theresultsdmonstratedthattheoptiized culture medium significantly enhanced specimen brightness ( L* ). In the E coli and P .okeanokoites systems,the additionof low-salt or anti-crystallization agents increased L* from 39.36 to 40.75 ( E .coli)and from 38.15 to 40.35( P .okeanokoites),with total color differences ( ΔE* )of 0.82 and O.76,respectively,meeting the requirements for visual fidelity ( ΔE*lt;3.0 ).Furthermore,benzotriazole(BTA)-modified UV adhesive effectively reduced the yellow shift index( Δb* ) by 79. 3% ,with a total color difference( ΔE* )of 1.50,therebysuppresingUVadhesiveyelowng.Thisstudyemploysasynergistic strategycombininglowsaltculure mediumoptimization,anti-rystalizationculturemedimimprovement,andB-modifiedUVdesive,significantlyeancingspecienas parency and optical stability to meet the visual requirements of museum exhibits.
Keywords:UV adhesive lightcuring;chromatic aberration analysis;process optimization;bacterial specimens
(編輯 陶志寧)