廣西積雪草內(nèi)生真菌多樣性分析

關鍵詞：積雪草[Centellaasiatica（L.）Urban]；內(nèi)生真菌；分離鑒定；多樣性；廣西

中圖分類號：Q948.12;Q949.32 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）05-0090-12

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.05.014 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Analysis of endophytic fungal diversity of Centella asiatica of Guangxi

LIANG Lu ?¹ ，LIANG Wen-jing2，SONG Li-sha2，WAN Ling-yun2，TANGui-yu2，ZHANG Zhan-jiang2， PAN Li-mei2， ZHANG Kun2，TU Dong-ping1，WEI Shu-gen1，2 （1.FacultyofPhrmacy，GuangxiUniversityofChineseMedicine，aning530oo，China;.GuangxiBotanicalGardenofMedicialants/ Guangxi Key Laboratory of High-QualityFormation and Utilizationof Dao-Di Herbs，Nanning 530o23，China）

Abstract：Inordertoinvestigatethedistributionofendopyticfungiintherots，stemsandleavesofCentellasiatica（L.）Urban， thecompositionofendophyticfungi groupsofCentellasiaticainGuangxiwasanalyed.HealthyCentellasiaticaspecimenswerecollectedfromsixdistinctregionsinGuangxi，ncludingLiuzou，Qinzou，Beihai，Guilin，HezhoundBaiseities，folowedbydo phyticfungalisolationfromtheirroot，stem，andleaftissues.Theendophyticfungiwereidentfiedbycombining morphologicaland molecularbiologicalmethods，followedbydiversityanalysis.Theresultsshowdthatatotalof114endophticfungalstrainsweeiso lated，belongingtoplum，3classes，9orders，2fmilies，and17genera，withtetaxonomicstatusof1geusreminigudetermined.ThegeneraColetotricumandDiaporthewereidentifidastedominantendohtcfungiinCentellasiatica.Thedopt icfungidiversityofCentellasiaticaindiferntregionswassgnificantlydiferent.TheendohicfungiinGuilinCityndLuzou City were themostabundant，andtheendopyticfungiinBeihai CityandQinzhouCitywere the mostsimilar，folowedbyGuilinCity andLiuzhouCity.Throughcomparativeanalysis，itwasfoundthatheendophyticfungiinrootshadthehighestabundance，andthe similaritycoeficientofendophticfungiinstemsandlavesasthehighest.ThefindingsindicatedthatCentellasiaticinGuangxi exhibitedhighdiversityandrelativelyunifordistributionofendophyticfungi，withbothgrowthnvironmentandplantisuetypesignificantly influencing their community composition and diversity.

KeyWords：Centella asiatica；endophytic fungi；isolation and identification；diversity；Guangxi

收稿日期：2024-10-10

積雪草［Centellaasiatica（L.）Urban]為傘形科植物，是中國傳統(tǒng)中藥材。歷年版《中華人民共和國藥典》均有收錄，積雪草以干燥全草入藥，具有清熱利濕，解毒消腫等功效，主要用于濕熱黃疸、癰腫瘡毒、跌打損傷等癥[1]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，積雪草含有多種生物活性物質，如積雪草苷、積雪草酸、圓柚酮、亞油酸甲酯等，這些物質不僅可以抗衰老，促進傷口愈合，修復痘印，還可以促進毛發(fā)生長、預防脫發(fā)，故積雪草廣泛應用于醫(yī)藥和美容等領域[2-4]積雪草在兩廣地區(qū)常用于制作涼茶、煲湯等，具有極高的藥用價值和食用價值，市場需求量大。然而，由于城市化進程的高速推進，自然生態(tài)環(huán)境發(fā)生劇烈改變，加之除草劑在農(nóng)業(yè)及城市綠化管理中的廣泛施用，積雪草的適生環(huán)境遭到嚴重破壞，在人居環(huán)境周邊區(qū)域，積雪草的分布范圍大幅收縮，植株數(shù)量急劇減少，并且由于對野生資源的無序采挖，其種群規(guī)模不斷縮減，造成了積雪草資源日益減少，難以滿足市場發(fā)展的需要。

植物的生長不僅受基因控制，還與植物微生物群落（內(nèi)生菌、根際微生物等）密切相關。已有研究表明，內(nèi)生真菌廣泛存在于植物組織內(nèi)，是影響植物生長的重要因子，也是多種活性代謝物的重要來源[5-7]。內(nèi)生真菌的生物多樣性受多種因素影響，如地域、氣候條件、植被類型、植物組織、季節(jié)等[8]。內(nèi)生真菌與宿主植物在長期的協(xié)同進化過程中，形成了互惠共生關系，這種關系能夠促進宿主植物生長發(fā)育、增強宿主植物的抗病和抗逆性[9.10]。內(nèi)生真菌不僅能產(chǎn)生與宿主植物相同或類似的活性成分，還能將宿主植物代謝產(chǎn)生的物質作為前體，通過自身的代謝途徑生成新的代謝產(chǎn)物，具備多樣的生理功能[1]。因此，植物內(nèi)生真菌在群落演替過程中具有重要的生態(tài)學意義[12]。已有研究從積雪草葉片中分離出膠孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioi-des），該菌株能產(chǎn)生生物活性物質積雪草苷，為積雪草苷的來源提供了新的研究思路與潛在方向[13]

積雪草多應用于科研以及臨床領域，關于其化學成分和藥理作用方面的研究較多，而在內(nèi)生真菌方面的研究較少。目前，從積雪草葉片中已經(jīng)分離出了13種內(nèi)生真菌，并分析了這些內(nèi)生真菌在夏季、冬季及雨季時成熟葉片與幼葉中的定殖率及多樣性[14]。但尚缺乏對積雪草不同組織部位內(nèi)生真菌的研究報道。因此，為了解不同地區(qū)積雪草根、莖、葉的內(nèi)生真菌分布情況，本研究擬以廣西的桂林市、柳州市、北海市、欽州市、百色市、賀州市6個地區(qū)的積雪草為研究對象，分析積雪草根、莖、葉中內(nèi)生真菌群落組成和多樣性。探究積雪草內(nèi)生真菌在不同地區(qū)、不同組織部位的分布規(guī)律，以期為尋找內(nèi)生真菌與外部環(huán)境的相關性提供一定的線索，為后續(xù)深入探究內(nèi)生真菌與積雪草相互作用機制奠定基礎，也為后續(xù)積雪草栽培利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1供試植物材料于廣西采集積雪草植株，依據(jù)采樣點所屬區(qū)域，將采集的植株劃分為桂林市、柳州市、北海市、欽州市、百色市、賀州市6個地區(qū)的樣本。本試驗所用植株材料經(jīng)廣西壯族自治區(qū)藥用植物園韋樹根研究員鑒定，確認為積雪草。將積雪草樣品編號后封存于自封袋中，帶回實驗室置于 4^°C 冰箱保存，并在 48h 內(nèi)開展內(nèi)生真菌分離試驗。廣西不同地區(qū)積雪草樣品采集信息見表1。

1.1.2培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：去皮馬鈴薯 200.00g ，葡萄糖 20.00g ，瓊脂17.00g，pH 自然。

1.2 方法

1.2.1樣品處理參考方中達《植病研究方法》[15]的常規(guī)組織法分離，選取新鮮健康的積雪草樣品，用自來水沖洗樣品表面的泥土和灰塵，晾干后置于超凈工作臺內(nèi)，然后在無菌操作臺上進行表面消毒。將積雪草樣品的根、莖、葉依次在 75% 乙醇溶液中浸泡 30s，2.5% 次氯酸鈉溶液中浸泡 2.5min 75% 乙醇溶液中浸泡 30s ，再用無菌水洗滌3次，每次

30s ，洗凈后用無菌濾紙吸干組織表面水分，備用。1.2.2內(nèi)生真菌分離和純化在無菌環(huán)境下，將經(jīng)過表面消毒處理的積雪草根、莖、葉組織分別用無菌剪刀剪成約 5mm×5mm 組織方，每個處理選取5個組織方塊，置于同一無菌PDA培養(yǎng)基平板上，每個處理設3個生物學重復（PDA培養(yǎng)基中加人利福平粉末，以抑制細菌的生成，保證分離效果）。將培養(yǎng)基置于 28^°C 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2～3d 。待組織邊緣長出菌絲后，挑取外觀不同且生長良好的菌絲邊緣，轉接至新的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)反復純化操作得到單一的純菌落。無菌條件下將純化的單一菌落轉移至PDA固體斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 7～10d 。鏡檢觀察無污染后，置于 4^°C 冰箱短期保藏（3＼～6個月）[16]。所有菌株均保存在廣西藥用植物園中藥材工程技術研究中心。在內(nèi)生真菌分離過程中，采用漂洗液檢測法和組織印跡法作為陰性對照，用以檢驗組織表面消毒是否徹底，從而確保積雪草內(nèi)生真菌分離的準確性[17]

1.2.3內(nèi)生真菌形態(tài)學鑒定在菌株生長最佳時期，觀察菌落顏色、大小、性狀、生長情況、菌絲體、孢子的形態(tài)特征和表面特征，并結合《真菌鑒定手冊》18]進行鑒定。

1.2.4內(nèi)生真菌分子生物學鑒定使用真菌DNA提取試劑盒提取純化菌株的DNA作為模板，以真菌通用引物ITS1（ 5^′ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3^′ ）和ITS4（ 5^′ -TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3^′ ）、β -tubulin引物Bt2a（ 5^′ -GGTAACCAAATCGGTGCT-GCTGCTTTC- ?3^′ ）和 Bt2b （ 5^′ -ACCCTCAGTGTAGT-GACCCTTGGC- -3^′ ）進行序列擴增[19-22]。擴增反應體系： 2× MightyAmpBuffer 25μL ， 10× AddtiveforHighSpecificity 5μL ，引物（ 各 1.5μL ，加ddH₂O 定容至 50μL 。PCR反應條件： 98^°C 預變性2min ， 98^°C 變性 10s ， 60^°C 退火 45s，68‰ 延伸1min ，共進行35個循環(huán)，最后 68^°C 延伸 10min 。 為空白對照。所得的PCR產(chǎn)物用 1% 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，隨后采用凝膠成像法檢測目的條帶，將含有目的條帶的PCR產(chǎn)物進行測序。將測序結果與GenBank中的序列進行Blast比對，根據(jù)比對結果下載相似性高的菌株序列。ITS、Tubulin、ITS+Tubulin聯(lián)合序列用clustal1.83程序進行多序列比對，利用MEGA11.0軟件的Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Bootstrap（重復1000次）進行檢驗。最后，通過基因測序結果并結合之前的形態(tài)學鑒定結果，最終確定內(nèi)生真菌的屬種[23]。

1.2.5數(shù)據(jù)分析采用分離率、分離頻率、香農(nóng)-威納指數(shù)、種類豐富度指數(shù)、均勻度指數(shù)、Sorensen相似性指數(shù)等指標來反映不同地區(qū)、不同組織部位積雪草內(nèi)生真菌的分離情況

分離率（Isolationrates， IR ）：用于衡量植物組織中內(nèi)生真菌的豐富程度和每個組織塊受多重侵染的發(fā)生頻率[24]，計算公式如下。

IR= 內(nèi)生真菌菌株總數(shù)/組織塊總數(shù) ×100%

分離頻率（Isolation frequency， IF ）：多用于反映不同種（類）的內(nèi)生真菌在總菌群中的優(yōu)勢程度， IF ?10% 的內(nèi)生真菌為優(yōu)勢屬， IF≥1% 的內(nèi)生真菌為常見屬， IFlt;1% 的為稀有屬[25]，計算公式如下。

IF= 樣本中分離到的某種內(nèi)生真菌的菌株數(shù)/分 離到的內(nèi)生真菌菌株總數(shù) ×100% （2）

香農(nóng)-威納指數(shù)（Shannon-Weinerdiversityindex，H^′） ：用于比較分析不同組間內(nèi)生真菌種群的多樣性水平[26]，計算公式如下。

式中， K 為樣品中內(nèi)生真菌種數(shù)； pi 為某樣品中某種（屬）內(nèi)生真菌 i 數(shù)量占全部內(nèi)生真菌菌株總數(shù)的百分數(shù)。

種類豐富度指數(shù)（Margalef'sindex， M ）：用于分析類群的豐富度，計算公式如下。

M=（S-1）/lnN

式中，S為物種數(shù)； N 為菌株總數(shù)。

均勻度指數(shù)（Pielou'sevenness index， E 用于分析內(nèi)生真菌菌群在不同地區(qū)、不同組織中分布的均勻程度[27]，計算公式如下。

E=H^′/lnS

式中， H^′ 為香農(nóng)-威納指數(shù)；S為物種數(shù)。

Sorensen 相似性指數(shù)（Sorensen's similarity coef-ficient， Cs ：用于比較兩個樣品地或兩種器官組織內(nèi)生真菌種類組成的相似程度[28]，當 Cs 取值范圍為0.00＼～0.25時，二者極不相似；當 Cs 取值范圍為 0.25～ 0.50時，二者中等不相似；當 Cs 取值范圍為 0.50～ 0.75時，二者中等程度相似；當 Cs 取值范圍為 0.75～ 1.00時，二者極為相似[29]。計算公式如下。

C_s=2j/（a+b）

式中 ，j 為兩個樣品地或兩種組織器官中共有的內(nèi)生真菌種類數(shù)； α_a 為樣品地或組織器官A的內(nèi)生真菌種類數(shù)； b 為樣品地或組織器官B的內(nèi)生真菌種類數(shù)。

采用 Excel2021 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，利用Ori-ginPro 2023軟件和EVenn平臺（http：//www.ehbio.com/test/venn/）分別對數(shù)據(jù)進行堆疊柱狀圖、Upset圖的繪制與分析。

2 結果與分析

2.1積雪草內(nèi)生真菌鑒定

選取菌落形態(tài)特征不同的36株內(nèi)生真菌作為代表菌株，對其ITS、Tubulin序列進行分析，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。參考菌株的種類、菌株號、寄主、登錄號（表2）。ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1，Tubulin序列系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2，ITS+Tubulin序列聯(lián)合構建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1包含代表從A到M的13個進化分枝，分枝A包括炭疽菌屬（Colletotri-chum）;分枝B包括土赤殼屬（Ilyonectria）和鐮刀屬（Fusarium）；分枝C包括柄孢殼屬（Zopfiella）;分枝D包括梨孢屬（Apiospora）黑孢屬（Nigrospora）；分枝E包括間座殼屬（Diaporthe）；分枝F包括Nothophysa-lospora;分枝G包括Mycoleptodiscus;分枝H包括青霉屬（Penicillium）；分枝I包括葉點霉屬（Phyllostic-ta ）；分枝J包括葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）；分枝K包括小球腔菌屬（Leptosphaeria）小光殼屬（Lepto-sphaerulina）及Setophoma;分枝L包括鏈格孢屬（Al-ternaria）;分枝M包括彎孢屬（Curvularia）。在該系統(tǒng)發(fā)育樹上，將GaertneriomycessemiglobiferusAY997051設為外群。13個分枝都各自聚集在一起，且各個分枝有較高的支持強度。

與圖1所示的ITS系統(tǒng)發(fā)育樹不同，Tubulin序列系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）中沒有分枝C、分枝G、分枝K-1、分枝I以及分枝M。菌株L5、L19、L21、L22經(jīng)多次Tubulin序列測序，均未出現(xiàn)條帶，因此未獲得其Tubulin序列。如圖3所示， ITS+ Tubulin序列聯(lián)合建樹所構建的系統(tǒng)發(fā)育樹，與ITS系統(tǒng)發(fā)育樹相比，不存在分枝C、分枝G、分枝K-1、K-2、分枝I及分枝M;而與Tubulin系統(tǒng)發(fā)育樹相比，不存在分枝K-2。

2.2積雪草內(nèi)生真菌菌群組成

從廣西6個地區(qū)采集的810個積雪草組織塊中分離到114株內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定分屬于3綱9目12科17屬，其中1個屬分類地位未定，積雪草內(nèi)生真菌總體分離率為 14.05% （表3）。在綱分類水平上，這些內(nèi)生真菌主要隸屬于糞殼菌綱（Sordariomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）和散囊菌綱（Eurotiomy-cetes）。其中以糞殼菌綱（Sordariomycetes）為優(yōu)勢綱，共分離到82株，占菌株總數(shù)的 71.93% ，其次是座囊菌綱（Dothideomycetes），共分離到28株，占比為24.56% 。在目水平上，優(yōu)勢目為小叢殼目（Glomer-ellales），共分離到47株，占菌株總數(shù)的 41.23% ，其次是間座殼目（Diaporthales），分離到14株，占菌株總數(shù)的 12.28% 。在屬水平上，以炭疽菌屬和間座殼屬為優(yōu)勢屬，分別占總菌株數(shù)的 41.23% 、 12.28% 。隨后為黑孢屬（ 6.14% ）、Mycoleptodiscus （6.14% ）、葉點霉屬（ 5.26% ）。上述結果表明，積雪草內(nèi)生真菌在種類上呈現(xiàn)出豐富的多樣性特征。

2.3不同地區(qū)、組織器官間積雪草內(nèi)生真菌群落組成差異

2.3.1不同地區(qū)、組織間積雪草內(nèi)生真菌的分布桂林市、柳州市、北海市、欽州市、百色市、賀州市的積雪草樣本組織塊數(shù)量分別為405、180、45、90、45、45塊。從這些樣本中分離的內(nèi)生真菌的分離頻率見表4。從表4可以看出，從桂林市積雪草中分離的菌株最多，鑒定出13個屬，共55株，分離瀕率為48.25% 。其中炭疽菌屬（ 19.30% ）為優(yōu)勢屬，梨孢屬0 0.88% ）、土赤殼屬（ 0.88% ）葉點霉屬（ （0.88%） 和Setophoma （0.88% ）為稀有屬，其余8個屬為常見屬；其次是柳州市積雪草樣本，分離到11個屬，共38株，分離頻率為 33.33% ，炭疽菌屬（ 14.04% ）為優(yōu)勢屬，Nothophysalospora、小球腔菌屬、青霉屬為稀有屬，分離頻率均為 0.88% ，其余7個屬為常見屬；欽州市積雪草樣本分離到3個屬，共10株，分離頻率為8.77% ，柄孢殼屬（ 0.88% ）為稀有屬，其余2個屬為常見屬；北海市積雪草樣本中分離到4個屬，共7株，分離頻率為 6.14% ，炭疽菌屬（ 0.88% ）、葉點霉屬1 （0.88% ）為稀有屬，黑孢屬（ 1.75% ）、Mycoleptodiscus1 2.63% ）為常見屬。百色市積雪草樣本中分離到2個屬，共2株，分離頻率為 1.76% ，均屬于稀有屬，分別是炭疽菌屬（ 0.88% ）、間座殼屬（ 0.88% ）、賀州市積雪草樣本中分離到1個屬，共2株，該屬屬于常見屬，為間座殼屬（ 1.75% ）。分析不同地區(qū)積雪草內(nèi)生真菌的組成分布和分離頻率，結果表明積雪草內(nèi)生真菌的分布具有一定的地理分布差異。

積雪草根、莖、葉3個不同部位組織塊各270塊，分離出的內(nèi)生真菌其分離頻率情況見表5。從表5可以看出，根部分離出29株，11個屬，分離頻率為25.43% ，在根部分離頻率最高的類群是間座殼屬（7.02% ），其次是分離頻率均為 2.63% 的炭疽菌屬、鐮刀菌屬、土赤殼屬、青霉屬4個屬，小球腔菌屬、黑孢屬、Setophoma3個屬分離頻率均為 0.88% ，為稀有屬，其余8個屬為常見屬；莖部分離出43株，隸屬于10個屬，分離頻率為 37.72% ，炭疽菌屬（ 18.42% ）為優(yōu)勢屬，梨孢屬（ 0.88% ）、鐮刀菌屬（ 0.88% ）、小光殼屬（ 0.88% ）為稀有屬，其余6個屬為常見屬；從葉片分離出42株，隸屬于11個屬，分離頻率為 36.85% ，優(yōu)勢屬與莖的優(yōu)勢屬相同，為炭疽菌屬 20.18% ），稀有屬有5個，分別是Nothophysalospora、柄孢殼屬、小光殼屬、鏈格孢屬、青霉屬，分離頻率均為 0.88% ，其余5個屬為常見屬。上述結果表明，在積雪草的不同組織中，其內(nèi)生真菌菌群組成和數(shù)量具有一定差異。

2.3.2各地區(qū)、組織間積雪草內(nèi)生真菌多樣性分析香農(nóng)-威納指數(shù)越大，說明對應樣品中的真菌群落多樣性越大；豐富度指數(shù)越高，說明群落越豐富；均勻度指數(shù)越高，說明群落越均勻。積雪草內(nèi)生真菌菌群多樣性指數(shù)如表6所示，香農(nóng)-威納指數(shù)從高到低依次為桂林市（1.33）、柳州市（1.01）、欽州市（0.28）北海市（0.25）百色市（0.08）賀州市（0.07）；豐富度指數(shù)從高到低依次為桂林市（2.99）柳州市（2.75）北海市（1.54）、百色市（1.44）欽州市（0.87）、

圖3基于ITS、Tubulin序列聯(lián)合構建的積雪草內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育進化樹

賀州市（0）。均勻度指數(shù)從高到低依次為桂林市（0.52）柳州市（0.42）欽州市（0.25）北海市（0.18）、百色市（0.12）。從香農(nóng)-威納指數(shù)分析可知，桂林市積雪草樣本中真菌群落多樣性最大，賀州市積雪草樣本中真菌群落多樣性最??；根據(jù)豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)數(shù)據(jù)可以看出，賀州市積雪草樣本真菌群落豐富度最低；桂林市積雪草樣本真菌群落豐富度最高且分布最均勻。由此可以看出，積雪草內(nèi)生真菌在不同地區(qū)的香農(nóng)-威納指數(shù)、豐富度指數(shù)、均勻度指數(shù)存在差異。

從積雪草各組織間內(nèi)生真菌的香農(nóng)-威納指數(shù)來看，莖 （1.02）gt; 葉 （0.98）gt; 根（0.91）；豐富度指數(shù)表現(xiàn)為根 （2.97）gt; 葉（2.68）gt;莖（2.39）；均勻度指數(shù)表現(xiàn)為莖（0.44） gt; 葉（0.41） |gt; 根（0.38）。結果表明，豐富度指數(shù)最大的是根，其次是葉，莖的豐富度指數(shù)最低，說明從根中分離得到的內(nèi)生真菌種群最為豐富，其次是葉，莖中最少。從香農(nóng)-威納指數(shù)及均勻度指數(shù)可以看出，莖內(nèi)生真菌群落多樣性最大且分布最均勻，其次是葉，根內(nèi)生真菌群落多樣性最低且分布最不均勻。該結果表明不同組織積雪草內(nèi)生真菌的菌落組成、豐度及多樣性存在差異（圖4）。

2.3.3各地區(qū)、組織間積雪草內(nèi)生真菌的共有屬和特有屬從不同地區(qū)積雪草內(nèi)生真菌群落的Upset圖（圖5）分析可知，分別從桂林市、柳州市、欽州市、北海市、百色市、賀州市地區(qū)分離出的積雪草內(nèi)生真菌菌株沒有共有屬，但是，個別地區(qū)間存在相同的內(nèi)生真菌，如除了賀州市積雪草樣本，其他5個地區(qū)積雪草樣本均分離出了炭疽菌屬。間座殼屬是桂林市、柳州市、百色市、賀州市的共有屬。葉點霉屬是桂林市、柳州市、北海市的共有屬。Mycoleptodiscus為柳州市、北海市、欽州市3個地區(qū)積雪草內(nèi)生真菌的共有屬。一些真菌具有一定的特異性和專一性，地區(qū)不同也會有各自特有的類群。其中，桂林市積雪草中的特有屬最多，有5個，分別是鐮刀菌屬、小光殼屬、鏈格孢屬、彎孢屬、Setophoma。其次是柳州市積雪草有2個特有屬，分別為Nothophysalospora、小球腔菌屬。其他地區(qū)無特有屬。綜上所述，不同地區(qū)積雪草內(nèi)生真菌群落組成與分布存在較明顯差異

從積雪草根、莖、葉組織中分離出的菌株有3個共有屬，分別為炭疽菌屬、黑孢屬、間座殼屬。一些類群還具有一定的組織特異性和偏好性。根有4個特有屬，分別為土赤殼屬、小球腔菌屬、彎孢屬、Setophoma。葉僅有1個特有屬，即Nothophysalospora。莖無特有屬。總的來說，積雪草各組織的內(nèi)生真菌群落組成與分布存在一定的差異

2.4各地區(qū)、組織間積雪草內(nèi)生真菌的相似性

不同地區(qū)積雪草內(nèi)生真菌組成相似性如表7所示，不同地區(qū)的積雪草內(nèi)生真菌類群的相似性系數(shù)為0＼～0.67。其中，積雪草樣本百色市-賀州市之間的相似系數(shù)最高，為0.67，屬于中等相似；此外，相似性指數(shù)屬于中等相似的還有桂林市-柳州市、北海市-欽州市，分別為0.58、0.57；柳州市-欽州市、柳州市-北海市、欽州市-百色市、桂林市-北海市、北海市-百色市、柳州市-百色市、桂林市-百色市之間的相似性系數(shù)均屬于中等不相似，分別為0.43、0.40、0.40、0.35、0.33、0.31、0.27；相似性系數(shù)均屬于極不相似的有柳州市-賀州市、桂林市-賀州市、桂林市-欽州市，分別為0.17、0.14、0.13；欽州市-賀州市、北海市-賀州市的相似系數(shù)最低，為0，說明欽州市、北海市與賀州市之間無相似的內(nèi)生菌群。

積雪草不同組織內(nèi)生真菌菌群相似性系數(shù)見表8。在不同組織中，莖與葉的相似性系數(shù)最高，為0.76，表明莖、葉的內(nèi)生真菌種類組成極為相似；其次是根與莖，相似性系數(shù)為0.48，屬于中等不相似；根與葉的相似性系數(shù)最低，為0.45，屬于中等不相似。這表明積雪草不同組織間內(nèi)生真菌的分布具有一定的相似性。

3討論與小結

本研究從廣西6個地區(qū)采集了新鮮健康的積雪草樣品，并進行了內(nèi)生真菌的分離，共分離出114株內(nèi)生真菌。采用形態(tài)學方法及構建系統(tǒng)發(fā)育樹的方式進行鑒定，共鑒定出17屬。由于某些屬存在復雜的復合種，本研究采用ITS和Tubulin兩種序列聯(lián)合構建系統(tǒng)發(fā)育樹，僅能鑒定到屬的水平，尚無法鑒定到種的水平。因此，可能存在一些重復的菌種，限制了對其物種組成的準確鑒定。后續(xù)將采用多基因序列聯(lián)合分析的方法，進一步明確積雪草內(nèi)生真菌的分類地位及種間關系。

經(jīng)多樣性分析，發(fā)現(xiàn)炭疽菌屬為桂林市、柳州市、北海市、欽州市、百色市5個地區(qū)的共有屬，同時也為積雪草根、莖、葉的共有屬。炭疽菌屬0 （41.23% 和間座殼屬（ 12.28% ）為積雪草的主要優(yōu)勢類群。炭疽菌屬和間座殼屬廣泛存在于植物的各組織部位中，在植物與微生物互作過程中扮演著重要的角色。炭疽菌屬在廣西夾竹桃、荷葉等植物中被發(fā)現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)從廣西夾竹桃中分離的炭疽菌屬菌株可以抑制蠟樣芽孢桿菌，從新鮮荷葉分離出的炭疽菌屬菌株可以產(chǎn)果膠酶[29.30]。間座殼屬的菌株在油茶中具有抗氧化與抑菌活性，在日本紫衫中可以產(chǎn)生活性物質紫杉醇[31，32]，綜上，這2個屬的內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主植物相關的代謝產(chǎn)物。因此，可將炭疽菌屬和間座殼屬的內(nèi)生真菌作為重點研究目標，在后續(xù)的研究中，對其次生代謝產(chǎn)物進行化合物分離，期望從中找到與積雪草相關的萜類等物質，進一步揭示積雪草次生代謝產(chǎn)物與積雪草內(nèi)生真菌的關聯(lián)，從而促進積雪草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

內(nèi)生真菌的組成和分布受多種因素的影響，如基因型、生長階段、地域差異等[33-38]。以北回歸線為界線，從植物生長環(huán)境看，廣西北部地區(qū)（桂林市，柳州市）較南部地區(qū)（北海市，欽州市）的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)高。這表明同一植物在不同生境下，受地區(qū)環(huán)境因素如海拔、氣候、光照、濕度、植被豐富程度以及土壤肥力等的影響，內(nèi)生真菌的分布及組成會有所不同。同時，也取決于積雪草在不同環(huán)境下專性內(nèi)生真菌種類數(shù)量、外界非專性內(nèi)生真菌的侵入和增殖、以及專性和非專性內(nèi)生真菌的相互競爭等內(nèi)在因素[39]。廣西北部地區(qū)內(nèi)部（百色市與賀州市，桂林市與柳州市）南部地區(qū)內(nèi)部（北海市與欽州市）的相似性系數(shù)最高，北部地區(qū)與南部地區(qū)之間（北海市與賀州市，欽州市與賀州市）的相似性系數(shù)最低，表明地理位置相近的積雪草內(nèi)生真菌菌群組成有一定的相似性。研究揭示了廣西積雪草植株內(nèi)含有豐富的內(nèi)生真菌資源，生長環(huán)境和植物組織部位對其內(nèi)生真菌的組成分布和多樣性均有影響。

從植物營養(yǎng)器官水平看，莖部的分離率高于葉片，這與孫劍秋等28的研究結果類似，這可能與植物不同的組織結構及其營養(yǎng)物質的分布不均有關。而根部的豐富度指數(shù)高于莖部與葉片，這可能與真菌傳播途徑的便利程度有關[40]。由相似性系數(shù)可以看出，從地下到地上部分的植物器官間，其內(nèi)生真菌菌群相似性逐漸增加。積雪草特定營養(yǎng)器官中有其特有種屬，具有一定的宿主特異性。

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（責任編輯 丁艷紅）