早孕因子單克隆抗體對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、遷移及調(diào)亡的影響

關(guān)鍵詞：早孕因子；單克隆抗體；宮頸癌；HeLa細(xì)胞；增殖；遷移；凋亡中圖分類號：R711.74 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：0439-8114（2025）05-0117-06DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.05.018

Effects of monoclonal antibody against early pregnancy factor on proliferation，migration and apoptosisofcervical cancer HeLa cells

DUANFu-chun，REN Hong-lin，HU Pan，LI Yan-song，LIUXi-lin，WANGHan， LIU Meng-di，LI Hao-song，LU Shi-ying

eyLaboratoryforDiagnosisandTreatmentofSevereZoonoticInfectiousDiseases/KeyLabratoryofZoonosisResearch，Ministryof Education/Instituteof Zoonosis/College of VeterinaryMedicine，JilinUniversity，Changchun13oo62，China）

Abstract：Theinibitoryefectofmonoclonalantibodyagainstearlypregnancyfactor（EPF-B6）onthebiologicalbehaviorofcervical cancer HeLacellswasinvestigatedbystudyingtheeectsofEPF-B6ontheproliferation，migration，cloningandapoptosisofHeLa cells.RT-PCR and Western Blot were used to detect the expression of EPF gene in six common cancer cells and EPF protein in cell culture medium.TheeffctsofdiferentconcenrationsofEPF-B6monolonalantibodyontheproliferation，migrationndpopulation dependenceofHeLacelsweredetectedbyCCK8assaycellscrathassayandplatecloning assay，espectively.Theapoptosisand cycleofHeLacellswere detected by flowcytometry.Results showed that EPF gene was present in common tumor cells.EPF protein was expresed in theculture medium ofcervicalcancer HeLacells，breastcancer MCF-7celsandovariancancer A2780cels.The resultsshowedthatEPF-B6monoclonalantibodycouldsignificantlyinhibit theproliferation，migrationandcolonyformationofHeLa cells，it was concentration-dependent （ Plt;0.01 ）.The results of cell cycle analysis showed that EPF-B6 monoclonal antibody blocked the DNA replication process of HeLa cells at G2/M phase.

Key Words：earlypregnancyfactors；monoclonalantibody;cervicalcancer;Helacells；proliferation;migration；apoptosis

早孕因子（Earlypregnancy factor，EPF）是澳大利亞學(xué)者在孕鼠血清中首次發(fā)現(xiàn)的，是一種具有免疫抑制和生長調(diào)節(jié)作用的微量蛋白[12]，其與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。多種腫瘤疾病患者血清中存在早孕因子蛋白的表達(dá)，其不僅作為生長因子促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[3]，還可能觸發(fā)機(jī)體免疫耐受機(jī)制，幫助腫瘤細(xì)胞規(guī)避機(jī)體的免疫清除[4.5]。人絨毛膜癌、卵巢癌、葡萄胎、惡性滋養(yǎng)層、黑色素瘤、膀胱癌和腸癌等腫瘤患者血清中均檢測到EPF表達(dá)，且表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后呈顯著相關(guān)性[6。睪丸癌患者血清中EPF或EPF樣活性物質(zhì)呈陽性表達(dá)，而健康對照組均為陰性，說明EPF具有作為辜丸癌早期篩查的特異性生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值[。體內(nèi)研究表明，將早孕因子單克隆抗體注入小鼠移植瘤模型可顯著抑制腫瘤生長[8]。體外試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，EPF單抗對多種腫瘤細(xì)胞系具有劑量依賴性的增殖抑制作用[9]。EPF是維持腫瘤細(xì)胞增殖和存活的關(guān)鍵分子，同時(shí)提示EPF單抗可能是一種潛在的抗腫瘤治療靶點(diǎn)。

宮頸癌作為人獸共患病的一種常見惡性腫瘤，在人類女性生殖系統(tǒng)中發(fā)病率持續(xù)上升[10]，2020年中國新發(fā)病例達(dá)11萬例，與2018年相比增加3.5%^[11-13] ，且發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢[14]。另外，宮頸癌在動物中也時(shí)常發(fā)生，特別是犬、貓、牛等動物中發(fā)病率較高[15-17]，對寵物業(yè)和畜牧業(yè)的發(fā)展也構(gòu)成一定威脅?，F(xiàn)有對宮頸癌的治療仍以手術(shù)、放療和化學(xué)藥物等手段為主，但易致宮頸瘢痕及機(jī)能不全[18]；引起膀胱炎、腸炎等放射性并發(fā)癥狀[19]，且復(fù)發(fā)率高[20]。鑒于宮頸癌現(xiàn)有治療方法的局限性，開發(fā)新型治療藥物具有重要的臨床意義。

本研究通過RT-PCR、WesternBlot等6種方法檢測腫瘤細(xì)胞中EPF基因的表達(dá)情況，且在宮頸癌和乳腺癌細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達(dá)較強(qiáng)，進(jìn)一步以宮頸癌HeLa細(xì)胞為重點(diǎn)研究對象，將前期制備的早孕因子EPF單克隆抗體EPF-B6與HeLa細(xì)胞體外共培養(yǎng)，通過CCK8細(xì)胞毒性試驗(yàn)、平板克隆、細(xì)胞劃痕及流式細(xì)胞術(shù)等在細(xì)胞水平分析EPF-B6單抗對HeLa細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響，探討利用早孕因子單克隆抗體抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡等生物學(xué)行為在腫瘤治療中的潛力，為開發(fā)以EPF為靶點(diǎn)的宮頸癌治療策略提供試驗(yàn)依據(jù)。

F 材料與方法

1.1材料

人宮頸癌細(xì)胞（HeLa）、人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）、人肝癌細(xì)胞（ Hepg-2 由人獸共患傳染病重癥診治全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供；人卵巢癌細(xì)胞（A2780）、人前列腺癌細(xì)胞（DU145）、人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞（Ishikawa 3-H-12）購自Applied Biological Ma-terials（ABM）公司;EPF-B6早孕因子雜交瘤細(xì)胞由人獸共患傳染病重癥診治全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期制備。GoatpAbtoEPF商品化抗體（貨號CR3255931-1）購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基和RPMI1640低糖培養(yǎng)基購自格來賽生命科技（上海）有限公司；胎牛血清購自美國Gemini公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購自Novoprotein;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（Cellcountingkit8，CCK8）、細(xì)胞凋亡試劑盒、ECL發(fā)光顯影液購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 EPF-B6早孕因子單克隆抗體制備及純化

早孕因子單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞EPF-B6由人獸共患傳染病重癥診治全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期融合制備，復(fù)蘇后進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。取6＼～8周齡BALB/c雌性小鼠，采用腹水誘導(dǎo)法與辛酸-硫酸銨法獲得并純化單克隆抗體。間接ELISA測定純化后的EPF-B6單抗效價(jià)。

1.3常見腫瘤細(xì)胞中EPF基因的擴(kuò)增

HeLa細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞、 Hepg-2 細(xì)胞、DU145細(xì)胞復(fù)蘇后使用含 10% 胎牛血清 ，1% 青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。A2780細(xì)胞、Ishikawa3-H-12細(xì)胞復(fù)蘇后使用含 10% 胎牛血清、 1% 青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。每株細(xì)胞各取 2×10⁶ 個(gè)，Trizol提取細(xì)胞中總RNA，經(jīng)cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。于NC-BI網(wǎng)站獲取人源性 EPF 基因序列（序列號為 NM_- 002157.3），采用Primer permier 5.0軟件設(shè)計(jì)上、下游引物（表1）。以cDNA為模板，PCR特異性擴(kuò)增 EPF 基因片段，擴(kuò)增體系見表2，PCR產(chǎn)物經(jīng) 2% 瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.4WesternBlot檢測腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中EPF蛋白的表達(dá)

將6株癌細(xì)胞分別計(jì)數(shù) 2×10⁶ 個(gè)，接種至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中， 3mL 完全細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng) ^48h ，取細(xì)

胞上清液進(jìn)行WesternBlot。1：1O00稀釋EPF-B6單抗和GoatpAbtoEPF商品化抗體作為一抗， 1：5 000 稀釋HRP-羊抗鼠作為二抗，ECL化學(xué)發(fā)光液顯影。

1.5CCK8檢測EPF-B6單抗對HeLa細(xì)胞的生長抑制率

取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞， 5×10³ 個(gè)細(xì)胞每孔鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng) ^12h 至細(xì)胞貼壁，設(shè)置僅完全培養(yǎng)基孔作為空白組，分別加入 0.0.1，.0.2 、0.4AA，0.6AA，0.8mg/mL EPF-B6單抗培養(yǎng) 24h ，更換為100μL/ 孔 10% CCK8完全培養(yǎng)基培養(yǎng) ^2h 后測定OD_450nm ，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。

1.6細(xì)胞劃痕檢測EPF-B6單抗對HeLa細(xì)胞遷移的影響

取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞， 2×10⁵ 個(gè)每孔接種于6孔板中，加入 2mL 細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞密度為80%～90% 。在孔中央人為制造劃痕后，試驗(yàn)組分別加入含低濃度（ 0.1mg/mL ）、中濃度（ 0.4mg/mL ）高濃度（ 0.8mg/mL ）EPF-B6單抗的培養(yǎng)基，定點(diǎn)觀察細(xì)胞狀態(tài)并拍照，計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.7平板克隆檢測EPF-B6單抗對HeLa細(xì)胞克隆形成的影響

取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞，700個(gè)每孔接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后試驗(yàn)組分別加人含低濃度（0.1mg/mL） 、中濃度 （0.4mg/mL） 、高濃度 （0.8mg/mL） EPF-B6單抗的培養(yǎng)基，培養(yǎng) ^48h 后更換為普通培養(yǎng)基，細(xì)胞每隔2～3d換液，繼續(xù)培養(yǎng)10～14d，待形成的細(xì)胞團(tuán)塊大于50個(gè)細(xì)胞時(shí)終止培養(yǎng)，甲醇溶液固定 15min，0.1% 結(jié)晶紫染色 20min ，PBS溶液清洗后觀察并拍照，采用ImageJ軟件計(jì)數(shù)克隆數(shù)目。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測EPF-B6單抗對HeLa細(xì)胞凋亡的影響

取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞， 2×10⁵ 個(gè)每孔接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁，試驗(yàn)組分別加入含低濃度（0.1mg/mL ）、中濃度 （0.4mg/mL） 高濃度 0.8mg/mL ）EPF-B6單抗的培養(yǎng)基， 48h 后棄去舊培養(yǎng)基，細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，按照細(xì)胞凋亡試劑盒操作，用 100μL BindingBuffer與 5μL Annexinv-FITC和 10μL PI混勻后重懸 1×10⁵ 個(gè)細(xì)胞，室溫避光孵育 15min ，檢測細(xì)胞凋亡率。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測EPF-B6單抗對HeLa細(xì)胞周期的影響

取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞， 2×10⁵ 個(gè)每孔接種于6孔板中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，將試驗(yàn)組細(xì)胞分別加入0.4mg/mL 的EPF-B6單抗，培養(yǎng) 48h 后用細(xì)胞刮板收集細(xì)胞，PBS溶液清洗后加入 1mL70% 乙醇溶液， 4^°C 固定過夜，使用細(xì)胞周期檢測試劑盒按說明操作后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPadPrism5.O統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（ Mean±SD ）表示，重復(fù)3次，多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 腫瘤細(xì)胞中EPF基因及EPF蛋白的表達(dá)

PCR結(jié)果（圖1）表明，6種腫瘤細(xì)胞中均擴(kuò)增出126bp 的特異性片段，提示這些細(xì)胞系中存在 EPF 基因的轉(zhuǎn)錄。WesternBlot結(jié)果（圖2）表明，EPF-B6單抗、GoatpAbtoEPF商品化抗體均檢測到人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7的細(xì)胞上清中存在大小約為 120ku 的EPF蛋白，GoatpAb檢測到A2780細(xì)胞上清中也存在約 120ku 的EPF蛋白，MCF-7細(xì)胞中有 160ku 的EPF蛋白出現(xiàn)，說明腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中都存在EPF蛋白。間接ELISA結(jié)果表明，EPF-B6單抗效價(jià)比達(dá)到1：512000（圖3）。

2.2 EPF-B6單抗抑制HeLa細(xì)胞增殖

CCK8結(jié)果（圖4）表明，隨著EPF-B6單抗?jié)舛鹊纳撸琀eLa細(xì)胞生長抑制率逐漸增加，呈現(xiàn)劑量依賴性。在不同的試驗(yàn)濃度下，HeLa細(xì)胞生長抑制率分別為 （11.41±1.74）% 、 （21.85±3.58）% 、（ 42.61±2.36）% 、 （56.47±3.13）% 、 （77.88±3.64）% ，表明EPF-B6單抗抑制HeLa細(xì)胞生長。

2.3 EPF-B6單抗抑制HeLa細(xì)胞遷移能力

細(xì)胞劃痕結(jié)果（圖5）表明，當(dāng)EPF-B6單抗與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng) 24h 時(shí)，對照組、低濃度、中濃度、高濃度組細(xì)胞遷移率分別為 （28.12±0.28）% 、（13.72±0.13）%（6.70±0.81）%（4.10±0.31）%（Plt;0.01） 。當(dāng)培養(yǎng) 48h 時(shí)，各試驗(yàn)組細(xì)胞遷移率分別為（ 41.92± 0.58% 、 （19.42±0.63）% 、 （11.78±0.29）% 、（ 6.88± 0.67）% ，極顯著抑制HeLa細(xì)胞的遷移 （Plt;0.01 ），表明EPF-B6單抗能抑制HeLa細(xì)胞的遷移能力，呈現(xiàn)劑量與時(shí)間依賴性。

2.4 EPF-B6單抗抑制HeLa細(xì)胞克隆形成能力

細(xì)胞平板克隆結(jié)果（圖6）表明，當(dāng)EPF-B6單抗在對照組、低濃度、中濃度、高濃度處理組作用于HeLa細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞克隆形成率分別為（ 78.76±0.73）% 、 （68.81±0.78）% 、 37.33±0.81）% 、（ 15.66± 0.50） % （ Plt;0.01 ），表明EPF-B6單抗極顯著抑制HeLa細(xì)胞平板克隆形成。

2.5 EPF-B6單抗促進(jìn)HeLa細(xì)胞的凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果（圖7）表明，HeLa細(xì)胞對照組、低濃度、中濃度、高濃度處理組細(xì)胞凋亡率分別為

（ 13.51±0.36）% 、（ 15.48±0.33）% 、 （46.9±1.33）% 、（57.76±0.97）%（Plt;0.05，Plt;0.01） ，表明EPF-B6單抗能顯著或極顯著促進(jìn)HeLa細(xì)胞的凋亡。

2.6 EPF-B6單抗影響HeLa細(xì)胞凋亡周期

細(xì)胞周期結(jié)果（圖8）顯示，HeLa細(xì)胞對照組與EPF-B6單抗組相比G2/M期占比增高，說明EPF-B6單抗作用于HeLa細(xì)胞時(shí)細(xì)胞周期被阻滯在DNA合成的G2/M期，提示早孕因子單克隆抗體可能是通過影響HeLa細(xì)胞DNA合成后期促進(jìn)其凋亡的。

3 討論

宮頸癌作為世界公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重威脅著人類和動物生命安全及畜牧業(yè)的發(fā)展。現(xiàn)有治療方式容易損害宮頸周圍正常組織及存在較高的復(fù)發(fā)率[20]，動物治療方面存在經(jīng)濟(jì)成本較高的問題。因此，尋找一種新的藥物與靶點(diǎn)對宮頸癌的治療意義重大。

早孕因子是熱休克蛋白家族的一員，與熱休克蛋白10高度同源[21]，發(fā)揮免疫抑制和生長調(diào)節(jié)作用[21，22]。利用早孕因子單克隆抗體與癌細(xì)胞中EPF蛋白結(jié)合，抑制腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為是可以被預(yù)見的。已有關(guān)于EPF單抗與宮頸癌HeLa細(xì)胞的報(bào)道較少，本試驗(yàn)旨在探討EPF單抗對HeLa細(xì)胞的影響，以期為利用EPF單抗治療宮頸癌提供一定的基礎(chǔ)。

本研究探討了6種常見癌細(xì)胞中EPF基因和EPF蛋白質(zhì)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)6種癌細(xì)胞的總RNA均能擴(kuò)增出 126bp 的特異性片段，但在細(xì)胞培養(yǎng)上清中，只有人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞和人卵巢癌A2780細(xì)胞中檢測到EPF蛋白的表達(dá)。這可能是因?yàn)樵谙嗤囵B(yǎng)條件下HeLa細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞和A2780細(xì)胞比其他癌細(xì)胞生長分裂的速度快，分泌的EPF蛋白較多[23]

本研究著重探討EPF-B6單抗對HeLa細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)其能顯著抑制其惡性生物學(xué)行為，并且制備的早孕因子單抗對腫瘤細(xì)胞的抑制作用優(yōu)于前期學(xué)者的試驗(yàn)效果[24]。在凋亡周期結(jié)果中得知，EPF-

B6單抗阻滯HeLa細(xì)胞DNA合成的G2/M期，有學(xué)者曾發(fā)現(xiàn)EPF-B6單抗可通過影響癌細(xì)胞DNA合成中嘧啶含量干擾DNA的復(fù)制過程，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的生長作用25，但其具體的調(diào)控機(jī)制與通路尚不明確。

綜上，EPF-B6單抗能顯著抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長、遷移、克隆形成，顯著促進(jìn)HeLa細(xì)胞的凋亡，為開發(fā)新型高效、具有應(yīng)用前景的抗腫瘤藥物提供了一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)，也為宮頸癌的治療提供了新藥靶，但其具體的作用機(jī)制與通路仍需要進(jìn)一步研究。

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