烤煙K326的NtALS基因單堿基編輯與抗除草劑材料創(chuàng)制

關(guān)鍵詞：乙酰乳酸合成酶；烤煙K326；除草劑；基因編輯

中圖分類號：S572 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）05-0102-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.05.015 開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：口

Tobacco's NtALS gene editing to develop herbicide-resistant new elite of K326

SUN Xiao-qiong1，2，ZHANG Xiao-lian3，GUO Yu-shuang3，HUJian-lin1，HUPeng1，ZHENG Xing-fei1，，WANG Hongbo1，XUE Lian1，XU De-ze1， ZHONG YU-ping2，YIN De-suo1，WANG Feng2 （1.InstituteofFoodCrops，HubeiAcademyofAgriculturalSciences，Wuhan43064，China;2.Hubei HuichuzhiBiotechCompany，Wuhan 430064，China;3.Guizhou Academy of Tobacco Science，Guiyang 55oo81，China）

Abstract： In order to breed new varieties of flue-cured tobacco resistant to herbicide，the NtALS gene of flue-cured tobacco K326 was edited by the single base，the 194th proline triad code CCA of tobacco NtALS gene was replaced with leucine encoding CTA and TTA. Sequencing results showed that the editing rate was up to 20.69% ，the identification results of the herbicide spraying resistance of positiveedited plantsshowedthatheresistancewasobvious，andanewflue-curedtobacco materialwithherbicideresistance was developed.

Key words：acetolactate synthase（ALS）；tobacco K326；herbicide；genome editing

乙酰乳酸合成酶（AcetolactateSynthase，ALS）是存在于幾乎所有植物生長中的質(zhì)體酶，也存在于一些細菌和酵母中。它能催化丙酮酸為乙酰乳酸，為植物支鏈氨基酸的生物合成提供初始底物，因此ALS是亮氨酸、纈氨酸以及異亮氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶[1。該基因為植物生長的必需基因，也是組成型表達的核心基因，基因失活或者受抑制將導致植物生理功能缺失而死亡。由于基因在植物生理代謝中的重要作用，該基因成為了雜草控制的靶點基因，作物或者雜草一旦被施用了ALS抑制劑，即除草劑，會導致葉片、莖稈等器官部位氨基酸合成受阻，細胞的生理代謝紊亂，繼而死亡。自20世紀80年代開始，科學家陸續(xù)發(fā)明了磺酰脲（sulfonyluresas，SU）、咪唑啉酮（imidazolinines，IMI）、嘧啶硫代苯甲酸酯（pyrimidinylthio-benzoates，PTB）、三唑嘧啶（triazol-opytimidines，TP）、磺酰氨基基三唑啉酮（sulfonamidycarbonyltriazalinone，SCT）等5類ALS抑制劑2，這些除草劑因抑制ALS活性，對雜草抑制作物效率高，且對人和畜牧低毒而被大規(guī)模使用[3]。

由于ALS抑制劑對作物也存在毒性作用，植株吸收后也會產(chǎn)生藥害，因此，尋找抗性基因，創(chuàng)制抗性作物將更能發(fā)揮除草劑的作用，有較好的應(yīng)用前景。多刺萵苣是第一個被發(fā)現(xiàn)含有ALS類除草劑抗性的突變雜草，目前共發(fā)現(xiàn)156種雜草對ALS抑制類劑除草劑產(chǎn)生了抗性4，這些抗性基因的發(fā)掘和利用為培育抗除草劑作物品種提供了線索。煙草作為一種大規(guī)模種植的經(jīng)濟作物，在大田生產(chǎn)階段面臨雜草的為害，培育抗除草劑的煙草品種能減輕大田除草的工作量，提高煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)。有研究報道，將煙草ALS同源基因NtALS的194位脯氨酸（ Pro 替換為絲氨酸（Ser）或亮氨酸（Leu），會使煙草產(chǎn)生對ALS類除草劑磺酰脲（SU）的除草劑抗性[5]。

近年來，基因編輯作為前沿技術(shù)備受關(guān)注并得到迅速發(fā)展，從2013年的基因敲除技術(shù)6發(fā)展到2016年的單堿基編輯，再升級至2020年的先導編輯，以及2024年的PE7先導編輯系統(tǒng)8，技術(shù)越發(fā)精準和高效[6]。本研究采用堿基編輯方法，對烤煙品種K326進行除草劑抗性改良，希望通過單堿基替換獲得抗磺酰脲（SU）等ALS類除草劑的植株，培育抗除草劑的烤煙新品種。

1 材料與方法

1.1材料

烤煙K326種子由貴州省煙草科學研究院提供；大腸桿菌 DH5α 與EHA105感受態(tài)細胞由上海唯地生物技術(shù)有限公司提供；APOBEC1-nCas9和nCas9-PmCDA1 堿基編輯工具由馬里蘭大學戚益平博士實驗室提供；試驗所需引物合成與測序由武漢天一華煜基因科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1烤煙K326靶標基因的擴增、測序和分析根據(jù)ALS的參考基因組，設(shè)計PCR擴增引物，進行烤煙K326基因編碼區(qū)的PCR序列擴增，并對PCR產(chǎn)物進行測序?qū)Ρ?，核對烤煙品種K326的NtALS編碼序列。1.2.2編輯載體的設(shè)計和組裝采用單堿基編輯策略，應(yīng)用A3A/Y130F-CBE_V04系統(tǒng)元件，組裝載體系統(tǒng)。在涵蓋目標替換氨基酸密碼子的靶點區(qū)域搜索NGG的PAM序列，在該序列上游設(shè)計gRNA序列，再根據(jù)啟動子類別在gRNA正反引物上加上接頭堿基，合成gRNA序列。合成設(shè)計好的crRNA序列，先將引物干粉溶解成 100μmol/L 的溶液，然后使用T4磷酸化酶，進行末端磷酸化和雙鏈退火，操作參考表1。

混勻離心后 37^°C 反應(yīng) 30min 。然后進行雙鏈變性和退火，將裝有磷酸化產(chǎn)物的EP管置于沸水中，待其自然冷卻，完成退火。將此雙鏈溶液稀釋200倍，留作下一步crRNA克隆試驗。

將gRNA入門載體 pYPQ141C （含U6啟動子）或pYPQ141D（含U3啟動子）用 Esp3I 酶切， 37^°C 反應(yīng)1～16h （表2），瓊脂糖電泳純化回收片段。

用磷酸化及退火處理的引物稀釋液和酶切回收的gRNA入門載體進行連接反應(yīng)，室溫（ 25^°C 反應(yīng)2h （表3）。

取 10μL 連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α 細胞，在加有抗生素Spectinomycin的平板上 37^°C 過夜培養(yǎng)。挑取單菌落在 5mL 的液體LB（ + Spectinomycin）培養(yǎng)基中 200r/min 振蕩過夜培養(yǎng)。抽提質(zhì)粒，Sanger測序核對插入gRNA序列，插入序列應(yīng)該為crRNA全序列，包括接頭，可以參考： 5^′ -GTGTN，-N₂₂-3^′ 。選擇正確的克隆，進行下一步反應(yīng)。

根據(jù)Gibson反應(yīng)原理，利用Gateway試劑將gRNA人門克隆（gRNAentryclone）、 Cas9 蛋白入門克?。–as9entryclone）、目標表達載體（Destinationvector）三個成分進行重組連接反應(yīng)，完成T-DNA載體構(gòu)建（表4）。

將反應(yīng)產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，再通過菌落PCR篩選陽性克隆，并測序驗證。

1.2.3煙草無菌苗的培養(yǎng)和葉盤準備將烤煙K326的種子干燥后，用 5.2% 的次氯酸鈉溶液殺菌20min ，然后用無菌水清洗3次，播種于MS瓊脂糖培養(yǎng)基，待植株長至 10cm ，4＼～5葉期，在超凈工作臺進行葉盤切片準備。

1.2.4煙草葉盤的預(yù)培育和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化將切好的葉盤在預(yù)培養(yǎng)基上培育 24h ，以增強其對農(nóng)桿菌的感染力。同時，將含有編輯載體的農(nóng)桿菌在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后離心收集菌體，用侵染液重懸至適當濃度。將預(yù)培育的葉盤浸泡在農(nóng)桿菌懸液中，輕輕搖動幾分鐘，確保葉盤充分接觸農(nóng)桿菌。然后將葉盤取出，用無菌濾紙吸去多余菌液，置于共培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng) 24～48h 。

1.2.5葉盤的篩選和再生植株的獲得將共培養(yǎng)后的葉盤轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基含有除草劑以篩選抗性植株。每兩周繼代一次，直至長出抗性芽。待抗性芽長至適當大小，將其切下轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中誘導生根。生根后的植株即為編輯成功的抗性植株。

1.2.6抗性植株的驗證對再生植株進行PCR和測序驗證，確保目標基因發(fā)生了預(yù)期的編輯。同時，對植株進行除草劑抗性測試，測試藥劑為 10nmol/L 的磺酰脲（SU）原藥，以確認其抗性表型。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)過農(nóng)桿菌的葉盤侵染和分化，成功獲得了編輯后的抗性植株（圖1）。通過PCR和測序驗證，發(fā)現(xiàn)目標基因在預(yù)期位置發(fā)生了單堿基替換（圖2），導致氨基酸序列的改變，從而產(chǎn)生了對ALS類除草劑的抗性。

抗性測試結(jié)果顯示，編輯后的植株在施用ALS類抑制劑的除草劑磺酰脲（SU）后仍能正常生長，而未編輯的單株或者野生型植株則表現(xiàn)出明顯的藥害癥狀（圖3）。這表明編輯策略是有效的，為培育抗除草劑的烤煙新品種提供了可能。

3 小結(jié)

本研究通過基因編輯技術(shù)成功創(chuàng)制了對ALS類除草劑具有抗性的烤煙新品種，這一成果不僅為烤煙大田生產(chǎn)中的雜草控制提供了新的解決方案，也為其他作物的抗除草劑育種提供了有益的參考。本研究從29株陽性編輯單株中檢測到6株發(fā)生了靶點編輯，有1株是雙堿基編輯，編輯效率為 20.69% ，此結(jié)果顯著高于該系統(tǒng)在其他單子葉和雙子葉作物中的編輯效率[7.8]。進一步優(yōu)化編輯策略，還可提高編輯效率和準確性，使煙草的堿基編輯改良成本更低，創(chuàng)制更多具有優(yōu)良性狀的抗性品種。同時也將關(guān)注抗性雜草的出現(xiàn)和管理問題，確?？钩輨┳魑锏目沙掷m(xù)利用。

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（責任編輯 王曉芳）