基于BSA-seq技術(shù)定位調(diào)控西瓜紅色果肉形成基因

中圖分類號：S642.9 文獻標識碼：A 文章編號： 1000-4440（2025）05-0952-08

Abstract：Flesh colorisanimportant trait thatdetermines thequalityof watermelon fruit.Inthisstudy，weused the pink-fleshed watermelon MW119 and the red-fleshed watermelon MW120 as parents to construct an F₂ segregating population. Fromthis population，weselected individuals withredflesh and pink flesh phenotypes tocreate progenybulks.Wethen performed whole-genome resequencing with a coverage depth of 30 1× on both the parental and progeny bulks using BSA-seq technology.By using the Δ （SNP-index）method，we identified 12 intervals significantlyassociated with the red flesh trait on chromosomes2，4，5，6，7，9，nd1，withatotallengthof56.66Mb.Furtherfunctionalaotationandexpresionaalyis wereconductedon116genes withinthesignificantlyassociated intervalsthatcariednon-synonymousSNPandInDelframeshift mutations，ultimatelyleading totheselectionoffivekeycandidategenes：the WRKY transcriptionfactorgene Cla97C02G028430，the o -methyltransferase gene Cla97C02G028680，the F-box protein genes Cla97C02G048400 and Cla97C06Gl22530，and the pentatricopeptide repeat protein gene Cla97Co6G122120.These genes playa significant role in regulating the formation ofred fleshinwatermelon.The resultsof thisstudy furtherrefine themolecular mechanisms underlyingtheformation ofredfleshinwatermelonand providea theoretical basis for marker-assisted breeding.

Key words： watermelon；flesh color； gene map-ping

西瓜（Citrulluslanatus）是重要的園藝作物，因其色澤鮮艷，果肉甘甜多汁而深受消費者喜愛。隨著經(jīng)濟發(fā)展，人們對西瓜品質(zhì)的要求不斷提高。果肉顏色是衡量西瓜果實品質(zhì)的重要指標，選育果肉顏色鮮艷的品種已成為育種工作者的重點研究方向。研究結(jié)果表明，西瓜果肉顏色與類胡蘿卜素類型和含量有關(guān)，紅色果肉是西瓜定向馴化選擇的結(jié)果[1]，也是目前市場上最為常見的果肉顏色。紅瓢和粉瓢西瓜富含番茄紅素[；黃瓢西瓜的主要類胡蘿卜素為紫黃質(zhì)和新黃質(zhì)3；橙瓢西瓜的主要成分為前番茄紅素或 β -胡蘿卜素[45]；白瓢西瓜則富含六氫番茄紅素和 ζ 胡蘿卜素[6-7]

研究發(fā)現(xiàn)，西瓜果肉顏色由多基因控制[8-9]，其遺傳規(guī)律為：紅瓢（Y）對橙襄 （y^o） 和淺黃瓢 （y） 為顯性;橙瓢 （y^o） 對淺黃 （y） 為顯性;亮黃瓢 （C） 對除白瓢（uf）外的其他果肉顏色均為顯性[10-14]。在果肉顏色基因定位研究方面，研究人員通過構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，分別在4號、3號和11號染色體上鑒定到調(diào)控番茄紅色合成的主效數(shù)量性狀位點（QTL）[15-17]。Branham等[4]在1號染色體上定位到調(diào)控 β -胡蘿卜素合成的主效數(shù)量性狀位點（QTL）。Nie等[18]通過重新組裝西瓜基因組，鑒定出15個與果實品質(zhì)相關(guān)的QTL，包含33個CDS區(qū)發(fā)生變異的候選基因，其中位于1號染色體9539129bp的八氫番茄紅素合酶基因Cla97C01G008760第一個外顯子處存在 單核苷酸變異，推測可能與果肉顏色形成有關(guān)。基于泛基因組分析，Sun等[]在400份西瓜種質(zhì)中鑒定到8個與果肉顏色關(guān)聯(lián)的缺失變異，其中4個與胡蘿卜素積累相關(guān)的無參考候選基因（Non-referencecandidategenes）在白色果肉中分布頻率較高。Yi等[14]通過群體遺傳分析將白色果肉基因定位于6號染色體 132.3kb 區(qū)間內(nèi)。Fang等[5]和Jin等[20]分別將調(diào)控橙色果肉形成基因Clorf定位于10號染色體 82.51kb 區(qū)間內(nèi)和1號染色體 39.08kb 區(qū)間內(nèi)。Liu等1將調(diào)控金黃色果肉形成基因精細定位于1號染色體 39.08kb 區(qū)間內(nèi)。Park等[13]將調(diào)控紅黃混合果肉（ICY）形成基因定位于2號染色體27.60＼～27.88Mb，并開發(fā)了與ICY 性狀共分離的標記 M7 。Wang等[21]將調(diào)控紅色果肉形成基因定位于4號染色體 41.233kb 區(qū)間內(nèi) ?8887652～8928885bp）， 。Li等[22]將調(diào)控紅色果肉形成基因定位于6號染色體 40.288kb 區(qū)間內(nèi)（21851079＼～21891367bp）。果肉顏色是一個復(fù)雜的數(shù)量性狀，涉及類胡蘿卜素、番茄紅素等色素的合成和積累，仍需進一步開展基因定位研究以挖掘其更多調(diào)控位點，為多種顏色西瓜新品種的選育提供分子標記。本研究擬以紅色果肉西瓜MW120和粉色果肉西瓜MW119為親本構(gòu)建 F₂ 分離群體，通過極端混池全基因組重測序篩選調(diào)控紅色果肉形成基因，旨在為西瓜種質(zhì)改良提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以紅色果肉西瓜MW120和粉色果肉西瓜MW119為親本，通過人工雜交構(gòu)建 F₁ 分離群體，包含130個單株。該群體于2022年在江蘇東臺種植，采用常規(guī)田間管理。果肉顏色由4名研究人員在相同光照條件下通過肉眼進行鑒定，篩選出果肉顏色分離的單株。

1.2 親本池和子代池的構(gòu)建

取5株紅色果肉西瓜MW120的基因組DNA，等量混合構(gòu)建MW120親本池；取5株粉色果肉西瓜MW119的基因組DNA，等量混合構(gòu)建MW119親本池。從 F₂ 群體中選取20株紅色果肉單株的基因組DNA，等量混合構(gòu)建紅色果肉西瓜子代池；選取20株粉色果肉單株的基因組DNA，等量混合構(gòu)建粉色果肉西瓜子代池。利用超微量紫外分光光度計（型號NanoDrop8000，ThermoScientific公司產(chǎn)品）測定DNA濃度。

1.3 DNA文庫的BSA-Seq測序

親本池和子代池的文庫構(gòu)建和重測序由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。DNA文庫在IlluminaHiSeq×10 平臺上進行雙末端測序（PE150），基因組測序深度為 30× 。對測序原始數(shù)據(jù)（Rawreads）進行質(zhì)量控制和過濾，得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)（Cleanreads）。使用BWA軟件將高質(zhì)量數(shù)據(jù)與97103西瓜參考基因組（http：//cucurbitgenomics.org/）進行比對。

1.4 SNP檢測與關(guān)聯(lián)分析

利用GATKUnifiedGenotyper（v3.5）進行SNP檢測，并使用ANNOVAR進行功能注釋。采用 Δ （SNP-index）法進行關(guān)聯(lián)分析，以 99% 置信水平篩選顯著區(qū)間。通過Gene Ontology（GO）和 KEGG Pathway顯著性富集分析對候選基因進行功能注釋。

1.5 熒光定量PCR分析

以不同發(fā)育階段（授粉后 10d，18d，28d，34d）

的西瓜果肉為材料，使用RNApurePlantKit（DNa-seI）試劑盒（康為世紀生物科技有限公司產(chǎn)品）提取總RNA，利用BU-SuperScriptRTKit試劑盒（Bi-ouniquer公司產(chǎn)品）合成cDNA。利用SuperRealPreMix[天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品]進行熒光定量PCR分析。以 I8SrRNA 為內(nèi)參基因，采用 2^-ΔΔCt 法計算相對表達量[23]。每個樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

如表1所示，原始序列（RawReads）過濾后得到高質(zhì)量有效序列71.44G，測序序列中質(zhì)量值 ? 20的堿基占比（ Q₂₀） 為 95.35%～96.06% ，測序序列中質(zhì)量值 ?30 的堿基占比（ Q₃₀ ）為 88.11%～ 89.84% ， G+C 含量為 35.20%～35.61% ，比對率為99.01%～99.16% 。測序深度為 30× 時，參考基因組中至少被1個測序短序列（reads）覆蓋的位點占比為 98.21%～98.26% ，至少被4個測序短序列（reads）覆蓋的位點占比為 98.13%～98.20% ，至少被10個測序短序列（reads）覆蓋的位點占比為 97.94% 298.07% ，至少被20個測序短序列（reads）覆蓋的位點占比為 94.58%～97.63% 。綜上所述，所有樣本的測序數(shù)據(jù)量充足，測序序列質(zhì)量較高。

2.2 SNP位點分析

結(jié)果表明，4個樣本池共檢測到193187個SNP位點，其中粉色果肉子代池中SNP位點數(shù)量最多，MW119親本池（粉色果肉）中SNP位點數(shù)量最少。親本間共有2958個非同義突變SNP位點，紅色果肉西瓜子代池和粉色果肉西瓜子代池之間共有4055個非同義突變SNP位點。SNP位點如表2所示，親本池之間和子代混池之間同一類型的SNP位點數(shù)量相當(dāng)，變異位點主要集中于基因間區(qū)、內(nèi)含子、基因上游和基因下游。

2.3 基于 Δ （SNP-index）法的關(guān)聯(lián)分析

Δ （SNP-index）法是一種通過計算混池間基因型頻率的差異進行標記關(guān)聯(lián)分析的方法。如圖1所示，基于 Δ （SNP-index）方法（ 99% 置信水平）鑒定到12個顯著關(guān)聯(lián)區(qū)間，總長度 56.66Mb ，分布于7條染色體。西瓜2號染色體包含5個區(qū)間（ 1.04～4.34 Mb.8.24～10.36Mb.10.97～13.07Mb.14.51～16.98 Mb、27.41～37.92Mb）；4號染色體包含1個區(qū)間（3.68～16.84Mb） ；5號染色體包含1個區(qū)間（20.77～23.57Mb）；6號染色體包含2個區(qū)間（0.96～6.33Mb ，22.69～24.86Mb ）；7號染色體包含1個區(qū)間（ 7.60～9.60Mb 0；9號染色體包含1個區(qū)間（ 19.74～26.50Mb ）；10號染色體包含1個區(qū)間（ 14.14～18.04Mb） 。候選區(qū)間內(nèi)共包含2822個基因，其中116個基因存在非同義突變/移碼突變。

黑色曲線為對 Δ （SNP-index）進行擬合后得到的曲線。

2.4候選基因的GO和KEGG富集分析

為了進一步解析候選基因功能，對其進行GO富集分析，對候選基因及其編碼產(chǎn)物的屬性按照細胞組成、分子功能和生物過程進行分類注釋。如圖2所示，候選基因主要富集在細胞組成（346個基因）和生物過程（342個基因）中，參與分子功能的候選基因（28個基因）最少。其中，脂質(zhì)生物合成過程（GO：0008610）、細胞間連接（G0：0005911）、細胞連接（G0：0030054）是候選基因富集程度最高的功能分類。進一步對候選基因進行KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、亞油酸代謝為候選基因主要富集通路。

2.5 候選基因的功能注釋

如表3所示，對關(guān)聯(lián)區(qū)間內(nèi)116個具有SNP非同義突變和InDel移碼突變的基因進行進一步的功能注釋和相關(guān)文獻查閱，從中篩選出17個可能與西瓜紅色果肉相關(guān)的候選基因，分別位于2號、4號和6號染色體上。其中Cla97C02G027340編碼紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶，該酶可以催化類胡蘿卜素途徑中紫黃質(zhì)、單環(huán)氧花藥黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)之間的相互轉(zhuǎn)化，從而調(diào)控果實成熟過程中 β 胡蘿素的積累。Cla97C02G027870、Cla97C02G028430 和 Cla97C04G070570分別編碼MYB轉(zhuǎn)錄因子、WRKY轉(zhuǎn)錄因子和MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子參與果實顏色的調(diào)控。Cla97C02G028400編碼引導(dǎo)蛋白（DIR）。Cla97C02G028680編碼鄰甲基轉(zhuǎn)移酶（OMT），該酶與花青素的生物合成相關(guān)。Cla97C02G028640和Cla97C02G029020編碼尿苷二磷酸-糖基轉(zhuǎn)移酶。Cla97C02G048400、Cla97C06G122510、Cla97C06G122520 和Cla97C06G122530編碼F-box 蛋白。Cla97C02G049320、Cla97C04G070020、Cla97C04G070590 和 Cla97C06G122120編碼三角狀五肽重復(fù)蛋白。這些基因編碼區(qū)均發(fā)生了SNP非同義突變，可能是調(diào)控紅色果肉形成的關(guān)鍵基因。

2.6候選基因在西瓜果實發(fā)育過程中的表達

如圖3所示，17個候選基因在西瓜果實發(fā)育過程中呈現(xiàn)不同的表達模式。在整個果實發(fā)育期間，Cla97C02G028430、 Cla97C06G122520、 Cla97C02G048400、Cla97C06G122530和Cla97C06G122120的相對表達量均保持較高水平。在授粉后18d，Cla97C04G070590的相對表達量降低，隨后又逐漸升高。在授粉后18d，Cla97C02G028680的相對表達量達到最大值。隨著果實發(fā)育，Cla97C04G070570的相對表達量呈降低趨勢。在整個果實發(fā)育期間，Cla97C02G027870、Cla97C02G028400、Cla97C02G028640、Cla97C02G028650、 Cla97C06G122510、Cla97C02G049320的相對表達量均保持在較低水平。表明Cla97C02G028430、Cla97C06G122520、Cla97C02G048400、Cla97C06G122530和Cla97C06G122120為調(diào)控西瓜紅色果肉形成的關(guān)鍵基因。

3 討論與結(jié)論

紅色果肉因其廣受消費者青睞而成為市場主流。目前關(guān)于紅色果肉形成的遺傳機制研究已取得重要進展，但不同研究人員基于不同遺傳群體獲得的結(jié)果存在差異。Wang等[2i]將紅色果肉基因精細定位到4號染色體 區(qū)間內(nèi)（8886138～8926873bp ），番茄紅素 β -環(huán)化酶（LCYB）基因ClaO05011為關(guān)鍵候選基因。Li等[22]在6號染色體40kb 的區(qū)間內(nèi)，發(fā)現(xiàn)番茄紅素生物合成相關(guān)基因GO：0045165：細胞命運決定；GO：0006511：泛素依賴性蛋白質(zhì)分解代謝過程；"_GO;0035966"：對拓撲錯誤蛋白質(zhì)的響應(yīng)；"_GO;0006633"：脂肪酸生物合成過程;GO：0072330：單羧酸生物合成過程;GO：008610;脂質(zhì)生物合成過程;GO：0016701：氧化還原酶活性（作用于單供體并摻入分子氧）；"_G0：0005942"：磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合體;GO：0031010：ISWI型復(fù)合體;GO：0035032：II類磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合體;GO：0070603：SWI/SNF超家族型復(fù)合體；GO：0019898：膜的外在成分;GO：0015629：肌動蛋白細胞骨架； G0：0098687 ：染色體區(qū)域;GO：0030119：AP型膜被適配體復(fù)合體;GO：0031225：膜錨定成分；GO：0009527：質(zhì)體外膜;GO：005694;染色體;GO：005911;細胞間連接;GO：0030054;細胞連接。Q值：多重假設(shè)檢驗校正后的 P 值。

Cla018767、Cla018768、Cla018769、Cla018770和ClaOI877I 。Zhang等[24發(fā)現(xiàn)，三角狀五肽重復(fù)蛋白基因 Cla97CO6GI22I20 可能通過調(diào)控類胡蘿卜素代謝影響果肉顏色，并將調(diào)控西瓜粉色果肉形成的基因定位于6號染色體 55.26kb 區(qū)間內(nèi)，最終確定Cla97C06G122120為關(guān)鍵候選基因。本研究以粉色果肉西瓜MW119和紅色果肉西瓜MW120為親本，構(gòu)建 F₂ 分離群體，利用BSA-seq方法將調(diào)控紅色果肉形成的基因定位于2號、4號、5號、6號、7號、9號、10號染色體上。進一步對關(guān)聯(lián)區(qū)間內(nèi)116個攜帶非同義突變SNP和InDel移碼突變的基因進行功能注釋和表達分析，最終篩選出6個關(guān)鍵候選基因：WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因Cla97C02G028430、鄰甲基轉(zhuǎn)移酶基因Cla97C02G028680、F-box蛋白基因

Cla97C02G048400和Cla97C06G122530，以及三角狀五肽重復(fù)蛋白基因 Cla97CO6GI22I20

目前已報道參與西瓜果肉顏色調(diào)控的基因主要包括：八氫番茄紅素合酶基因 （PSY）^[25] 、番茄紅素β -環(huán)化酶基因（LCYB）[1]、9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因（NCED）[5，14，21]、類胡蘿 h 素異構(gòu)酶基因（ZISO）[26]等類胡蘿卜素通路相關(guān)基因以及MYB、WRKY和MADS-box 等轉(zhuǎn)錄因子基因[11，27-28]和質(zhì)體發(fā)育相關(guān)基因[29]。本研究首先篩選了編碼區(qū)存在非同義突變SNP的基因，進而通過熒光定量PCR分析其在果實發(fā)育過程中的表達模式，最終鑒定出5個可能參與紅色果肉形成的候選基因。WRKY轉(zhuǎn)錄因子可通過協(xié)同調(diào)控葉綠素降解和類胡蘿卜素的合成促進柑橘果實著色[30]，或通過乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控番茄果實顏色的形成[31」。本研究中，在果實發(fā)育中期，Cla97C02G028430的相對表達量保持較高水平。Liu等[27]發(fā)現(xiàn)，WRYK轉(zhuǎn)錄因子參與果實成熟的調(diào)控。而其與果肉顏色轉(zhuǎn)變的相關(guān)性仍需進行進一步探究。Cla97C02G028680編碼鄰甲基轉(zhuǎn)移酶（OMT），在果實發(fā)育中期， Cla97CO2GO28680 的相對表達量保持較高水平。已有研究結(jié)果表明，鄰甲基轉(zhuǎn)移酶基因表達量與花色苷的積累量呈正相關(guān)，而花色苷是決定葡萄[32]和辣椒[33果皮的呈色物質(zhì)。Cla97C02G048400和Cla97C06G122530編碼F-box家族蛋白。F-box在真核生物中普遍存在，參與多種生理過程的調(diào)控。研究結(jié)果表明，F(xiàn)-box參與調(diào)控有色小麥中的花青素積累[34]、辣椒果實轉(zhuǎn)色[35]以及甜瓜白色果皮的形成[36]。Cla97C06G122120 編碼三角狀五肽重復(fù)蛋白PPR，在最新發(fā)表的研究結(jié)果中，該基因被鑒定為調(diào)控顏色果肉的候選基因[12.24]。這些候選基因的發(fā)現(xiàn)為深入解析西瓜紅色果肉形成的分子機制提供了重要線索。后續(xù)研究將通過基因編輯等技術(shù)對這些基因進行功能驗證，以期完善西瓜果肉顏色形成的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

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