兔出血癥病毒 RHDV1 和 RHDV2一步法雙重 Taq-Man探針熒光定量RT-PCR體系的建立和應(yīng)用

中圖分類(lèi)號(hào)：S855.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-4440（2025）05-0937-06

Abstract：Rabbit hemorrhagic disease（RHD）caused by rabbit hemorrhagic disease virus（RHDV）isan acute ndhighlylethal infectiousdiseasethat posesaseriousthreattotherabitbreding industry.Inthisstudy，primersand

TaqMan probeswere designed based on the capsid protein （VP6O）gene sequences of RHDVto establish a dual TaqMan quantitativeRT-PCRdetectionsystem capableof simultaneously detecting both RHDV1 and RHDV2 strains. Thereaction system included 10.0μL of 2× One Step RTPCR Buffer Il ， 0.6μL of forward primer（10 μmol/L），

0.6μL of reverse primer （ 10μmol/L ， 0.4μL of ROX Reference Dye （ 50× ）， 0.8μL of each fluorescent probe（10 μmol/L ）， 2.0μL of test sample，and 4.8μLddH₂O . The reaction program was as follows： 42ΩΩ for 5 min， 95‰ for 10s ， 959C for5s， 60YC for 30s ，and 4O cycles.Results showed that the system had strong specificity and no cross-reactions with rotavirus，Pasteurell multocida，Bordetella bronchiseptica，Pseudomonas aeruginosa，and Salmonella spp.，and high sensitivitywithaminimumdetectionlimitof1OOcopiesper microliter.Repeatabilityanalysis through intra-groupand inter-group repetitions showed that the coefficient of variation of Ct valueswas between 0.2% and 2.9% ，indicating good stabilityofthesystem.When testing112 clinicalsamples（6Olivertisuesand 52 nasal and anal swabs）usingthis system， the overall detection rate of RHDV reached 69 % ，while the detection rate of the conventional RT-PCR system was only 51% .The dual quantitative RT-PCR method established in this study has high sensitivity，strong specificity，and good repeatability，providing areliable technical support for therapid clinical diagnosisand quantitative analysis of RHDV.

Key words：rabbit hemorrhagic disease virus； fluorescence quantitative RT-PCR；TaqMan probe

兔病毒性出血癥（Rabbit hemorrhagicdisease，RHD），又稱(chēng)兔出血癥或兔瘟，是由兔出血癥病毒（Rabbithemorrhagicdiseasevirus，RHDV）引起的一種急性、高度接觸傳染性、致死性疾病，主要感染家兔和野兔[1]。RHDV 屬于杯狀病毒科兔病毒屬成員，目前有GI.1和GI.2兩種基因型。該病毒基因組為 7.4kb 的正鏈RNA，包含2個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF）。ORF1編碼1個(gè)多蛋白，該多蛋白可被切割成衣殼蛋白（VP60）和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2編碼次要結(jié)構(gòu)蛋白（VP10）[2-3]。RHDV于1984年在中國(guó)首次被報(bào)道[4]，隨后迅速傳播至全球。截至2010年，中國(guó)主要流行的RHDV1毒株為GI.1基因型，GI.1基因型可分為GI.1a亞型和GI.1c亞型。2010年，在歐洲首次發(fā)現(xiàn)RHDV2，該毒株屬于GI.2基因型，在系統(tǒng)發(fā)育和抗原性方面與GI.1基因型存在差異[5-7]。2020 年之前，中國(guó)僅流行RHDV1毒株，2020 年首次發(fā)現(xiàn)RHDV2毒株[8]。由于RHDV1疫苗對(duì)RHDV2的交叉保護(hù)作用有限，導(dǎo)致RHDV2在全國(guó)范圍內(nèi)迅速傳播。目前，RHDV1和RHDV2均在中國(guó)流行[9-14]

RHD潛伏期為1＼～3d，臨床主要表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀、呼吸道癥狀、精神沉郁和食欲減退，病兔常在體溫升高后 12～36h 死亡。RHDV1僅感染家兔，4＼～6周齡仔兔多呈亞臨床癥狀，2月齡以上的家兔易出現(xiàn)明顯的臨床癥狀。RHDV2不僅可感染家兔，還能跨物種感染野兔以及地中海田鼠等嚙齒類(lèi)動(dòng)物。感染RHDV2的10＼～15日齡幼齡家兔也會(huì)出現(xiàn)明顯的臨床癥狀。2種基因型RHDV引起的特征性病理變化均為壞死性肝炎[15]。值得注意的是，研究發(fā)現(xiàn)RHDV2在野外環(huán)境中已逐漸取代RHDV1[16]，這為RHDV防治帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。

目前針對(duì)RHDV1已建立多種診斷方法，如抗原捕獲夾心ELISA、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）、實(shí)時(shí)定量RT-PCR（RT-qPCR）和免疫電鏡等[17-18]。隨著RHD2暴發(fā)流行，亟需建立能區(qū)分2種基因型的診斷方法。雖然RT-qPCR具有高敏感性和特異性，但現(xiàn)有方法步驟較多且無(wú)法同時(shí)檢測(cè)2種基因型毒株。為此，本研究擬通過(guò)分析RHDV1和RHDV2的VP6O基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立一步法雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系，旨在為兔出血癥病毒的防治和流行病學(xué)研究提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1病毒樣本

輪狀病毒、兔多殺性巴氏桿菌、兔支氣管敗血波氏菌、綠膿桿菌、沙門(mén)氏菌、兔出血癥病毒1型、兔出血癥病毒2型cDNA均由本實(shí)驗(yàn)室 -80°C 保存?zhèn)溆?。臨床樣本為2022年采集自山東、河南、四川、安徽和等地兔場(chǎng)的疑似感染RHDV的家兔肝臟組織，以及本實(shí)驗(yàn)室保存的鼻肛拭子樣本。重組質(zhì)粒pMD18-T-VP60-1、pMD18-T-VP60-2由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，分別含有RHDV1VP6O基因和RHDV2VP60基因。

1.2 試劑與儀器

RNA提取試劑RNAisoPlus、一步法RT-PCR試劑盒One Step PrimeScriptTM RT-PCRKit（PerfectRealTime）購(gòu)自TaKaRa公司。PCR儀為杭州博日科技有限公司產(chǎn)品。紫外凝膠成像系統(tǒng)為伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司產(chǎn)品。QuantStudio1熒光定量PCR 儀為美國(guó) Applied Bio-systems 公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)

采用NanoDrop測(cè)定重組質(zhì)粒濃度并計(jì)算拷貝數(shù)，用 ddH₂O 將重組質(zhì)粒pMD18-T-VP60-1（61.8ng/μL ）和pMD18-T-VP60-2（ 75.5ng/μL 分別稀釋至 1μL 1×10¹⁰ 拷貝。通過(guò)BLAST比對(duì)分析，選取保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，所有引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物和探針序列如表1所示。

1.4 反應(yīng)體系優(yōu)化

按照One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit說(shuō)明書(shū)，采用 20μL 體系以及表1中的引物和探針擴(kuò)增質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。通過(guò)優(yōu)化引物濃度（ 0.1μmol/L，0.2 μmol/L，0.3μmol/L，0.4μmol/L，0.6μmol/L，0.8 μmol/L 和 1.0μmol/L ）、探針濃度（ 0.1μmol/L?0.2 μmol/L，0.3μmol/L，0.4μmol/L，0.6μmol/L，0.8 μmol/L 和 1.0μmol/L ）、退火溫度 和65^°C ）等參數(shù)，建立最佳雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR 體系。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

將pMD18-T-VP60-1質(zhì)粒（ 1μL1×10¹⁰ 拷貝）和pMD18-T-VP60-2質(zhì)粒 1μL1×10¹⁰ 拷貝）等體積混合。將混合質(zhì)粒10倍梯度稀釋為 10⁴ 拷貝，分別使用雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，使用QuantStudioTMDesignamp;AnalysisSoftware生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.6特異性試驗(yàn)

分別使用雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系擴(kuò)增兔支氣管敗血波氏菌、沙門(mén)氏菌、綠膿桿菌、兔多殺性巴氏桿菌、輪狀病毒的cDNA以及pMD18-T-VP60-1（ 1μL1×10⁸ ）和pMD18-T-VP60-2（ 1μL1×10⁸ ）等體積混合質(zhì)粒，以 ddH₂0 為對(duì)照，進(jìn)行特異性檢測(cè)。

1.7 敏感性試驗(yàn)

將pMD18-T-VP60-1質(zhì)粒 1μL1×10¹⁰ 拷貝）和pMD18-T-VP60-2質(zhì)粒（ 1μL1×10¹⁰ 拷貝）等體積混合。將混合質(zhì)粒10倍梯度稀釋為 1μL1×10⁸～1× 10¹ 拷貝，分別使用雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，以 ddH₂0 為對(duì)照，進(jìn)行敏感性檢測(cè)。同時(shí)按照《兔出血癥診斷技術(shù)》（NY/T572-2023）中常規(guī)RT-PCR體系擴(kuò)增質(zhì)粒。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

將pMD18-T-VP60-1質(zhì)粒（ 1μL （204號(hào) 1×10¹⁰ 拷貝）和pMD18-T-VP60-2質(zhì)粒（ 1μL1×10¹⁰ 拷貝）等體積混合。將混合質(zhì)粒10倍梯度稀釋為 1μL1×10⁶ 拷貝、1×10⁵ 拷貝和 1×10⁴ 拷貝，分別使用雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，并進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)檢測(cè)和組間重復(fù)檢測(cè)（各3次重復(fù)）。以 Ct 值的變異系數(shù)評(píng)估該方法的重復(fù)性。

1.9 臨床樣本的檢測(cè)

使用雙重 TaqMan 熒光定量RT-PCR體系和常規(guī)RT-PCR體系分別對(duì)112份臨床樣本（60份肝臟組織和52份鼻肛拭子）進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系

本研究對(duì)引物濃度、探針濃度、退火溫度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，最終建立 20μL 雙重 TaqMan 熒光定量RT-PCR體系： 2×One Step RT-PCR Buffer I 10.0 μL ，上下游引物（ 10μmol/L ）各 0.6μL ，ROXRefer-ence Dye I（ 50× ） 0.4μL ，兩種熒光探針（10μmol/L 各 0.8μL ，待測(cè)樣本 2.0μL ddH₂O 4.8μL 。反應(yīng)程序設(shè)定為： 42°C5min 95^°C 10s， 95^°C 4 個(gè)循環(huán)。

2.2雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

如圖1所示，RHDV1熒光強(qiáng)度與質(zhì)?？截悢?shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為 Y=-3.323 1lgx+14. 168 ，相關(guān)系數(shù)（r）=0.999 ，擴(kuò)增效率為 99.94% ;RHDV2熒光強(qiáng)度與質(zhì)?？截悢?shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為 Y=-3.301 1lgx+ 13.536，相關(guān)系數(shù) ξ（r）=0.999 ，擴(kuò)增效率為 100.88% 。熒光強(qiáng)度與質(zhì)粒拷貝數(shù)之間呈現(xiàn)出良好的線(xiàn)性關(guān)系，表明本研究建立的雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系可靠，能夠滿(mǎn)足定量分析的要求。

2.3雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系的 特異性檢驗(yàn)

利用本研究建立的雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系分別對(duì)兔支氣管敗血波氏菌、兔多殺性巴氏桿菌、沙門(mén)氏菌、綠膿桿菌、輪狀病毒的cD-NA以及pMD18-T-VP60-1和pMD18-T-VP60-2混合質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)。如圖2所示，僅pMD18-T-VP60-1和pMD18-T-VP60-2擴(kuò)增產(chǎn)生特異性擴(kuò)增曲線(xiàn)，表明本研究構(gòu)建的方法特異性較好。

圖2雙重 TaqMan 探針熒光定量RT-PCR體系的擴(kuò)增曲線(xiàn) Fig.2Amplificationcurves ofthedual TaqManprobe quantitativeRT-PCRsystem

2.4雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系的 敏感性檢驗(yàn)

如圖3所示，本研究建立的雙重 TaqMan 探針 熒光定量RT-PCR體系最低檢測(cè)限為 1μL 1×10² 拷 貝。常規(guī)RT-PCR體系對(duì)質(zhì)粒pMD18-T-VP60-1的 最低檢測(cè)限為 1μL 1×10⁴ 拷貝，對(duì)質(zhì)粒pMD18-TVP60-2的最低檢測(cè)限為 1μL 1×10³ 拷貝。雙重 TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系的靈敏度為常 規(guī)RT-PCR體系的 10～100 倍。

2.5雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系的 重復(fù)性分析

根據(jù)雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系得到的 Ct 值，計(jì)算其變異系數(shù)。如表2所示，組內(nèi)重復(fù)和組間重復(fù)的變異系數(shù)均小于 3% ，表明建立的雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系穩(wěn)定性較好。

2.6 臨床樣本檢測(cè)

利用已建立的雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系和常規(guī)RT-PCR體系分別對(duì)60份肝臟組織和52份鼻肛拭子進(jìn)行檢測(cè)。如表3所示，利用本研究建立的雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系檢出16份感染RHDV1的肝臟組織、27份感染RHDV2的肝臟組織、2份RHDV1、RHDV2混合感染的肝臟組織、3份攜帶RHDV1的鼻肛拭子、29份攜帶RHDV2的鼻肛拭子，檢出率為 69% ；用常規(guī)RT-PCR體系檢出14份感染RHDV1的肝臟組織、23份感染RHDV2的肝臟組織、20份攜帶RHDV2的鼻肛拭子，檢出率為 51% 。表明本研究建立的雙重Taq-Man探針熒光定量RT-PCR體系優(yōu)于常規(guī)RT-PCR體系。

3 討論與結(jié)論

兔出血癥病毒（RHDV）引起的兔出血癥是家兔的重要傳染病。RHDV2在法國(guó)被首次發(fā)現(xiàn)，并迅速在歐洲蔓延，目前已傳播至澳大利亞、非洲、北美和亞洲[19-21]。RHDV2具有與RHDV1相似的高致病性，其快速傳播能力和高致死率引起了廣泛關(guān)注[22] 。

目前，傳統(tǒng)組織滅活疫苗對(duì)RHDV2感染的保護(hù)效果有限，缺乏有效的交叉保護(hù)。RHDV2在中國(guó)兔場(chǎng)廣泛流行，給養(yǎng)兔業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。目前已經(jīng)建立了多種診斷RHD1和RHD2的方法，如病毒分離 RT-PCR^[23] 、實(shí)時(shí) RT-PCR^[24-26] 、ELISA等方法。SYBRGreen或 TaqMan 能夠產(chǎn)生特異性熒光信號(hào)，且其靈敏度較高，已被廣泛用于病毒檢測(cè)[22.27]。本研究基于RHDVVP6O設(shè)計(jì)引物和探針，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件和體系，建立雙重 TaqMan 探針熒光定量RT-PCR檢測(cè)體系： 2×One Step RT-PCR Buffer III10.0μL ，上下游引物（ 10μmol/L 各 0.6μL ，ROXReferenceDye II（ 50× ） 0.4μL ，兩種熒光探針（10μmol/L 各 0.8μL ，待測(cè)樣本 2.0μL，ddH₂O 4.8 μL 。反應(yīng)程序設(shè)定為； ：42%5min，95%10s，95% 5s，60%30s，40 個(gè)循環(huán)。該體系對(duì)RHDV1和RHDV2具有高度特異性，檢測(cè)靈敏度達(dá)到 1μL 100拷貝，是常規(guī)RT-PCR體系靈敏度的10＼～100倍。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明， Ct 值變異系數(shù)為 0.2%～2.9% ，表明該方法穩(wěn)定性較好。

與現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)相比，本研究采用一步法直接檢測(cè)樣本RNA，并通過(guò)兩種探針實(shí)現(xiàn)RHDV1和RHDV2的同步檢測(cè)，顯著縮短檢測(cè)時(shí)間，簡(jiǎn)化操作流程，更適用于臨床樣本的高通量篩查。該方法兼具高特異性和高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，可大幅提升臨床檢測(cè)效率，為RHD的快速診斷與防治提供技術(shù)支持，并為后續(xù)開(kāi)發(fā)商業(yè)化診斷試劑盒研制奠定基礎(chǔ)

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（責(zé)任編輯：成紓寒）