馬鈴薯無糖組織培養(yǎng)的條件優(yōu)化及其在馬鈴薯原原種生產(chǎn)中的應(yīng)用

Abstract：Tofurtheroptimizethemicroenvironmentparametersofsugar-free tisseculture，this studyused Qingshu No.9 as the tst material and designed different gradient experiments with diferentratiosof vermiculite to nutrient solution （ V_vermiculite ： 1 V_{nutrientsolution}=1.0：0.7，V_vemiculie：V_{nutrientsolution}=1.0：0.8 mtriensoution =1.0：0.9），COconcentrtions（500 μmol/mol， 800μmol/mol ， 1100μmol/mol ， 1 400μmol/mol ），and light intensities to investigate the effectsof each treatment

onthe growth and development of potato tissue-cultured seedlings.Thelight intensitywasset at 50μmol/（m²?s） 75μmol/（m²?s） ， 100μmol/（μ²?s）. The results showed that the optimal conditions for sugar-free tissue culture of potatoes were as follows ： ， CO₂ concentration of 800μmol/mol ，and light intensityof75 μmol/（m²?s）. Compared with traditional tissue culture，the yield，quantity，and survival rate of potato pre-basic seeds obtained through sugar-free tissue culture were significantly increased by 16.09% ， 22.37% ，and 3.27% ，respectively（ Plt;

0.O5）.Inconclusion，thisstudynotonlyclarifidthekeytechnicalparametersofsugar-freetissueculturebutalsoonfimedthe advantagesoftistechologyinimprovingteproductionefiencyofpotatoseedtubers，providingteoreticalbasisadtecal support for the standardized production and industrial propagationof potato tissue-cultured seedlings.

Key words：sugar-free tissue culture；potato；tissue-cultured seedlings

植物無糖組織培養(yǎng)技術(shù)由日本千葉大學(xué)古在豐樹教授發(fā)明[1]，其技術(shù)核心在于通過精確控制微環(huán)境因素（如 CO₂ 濃度、溫度、濕度等），以環(huán)境 CO₂ 替代培養(yǎng)基中添加的外源糖作為碳源，實現(xiàn)植物完全自養(yǎng)生長。這種自養(yǎng)生長方式不僅能顯著提高植物的生長速率和生物量，還能有效降低培養(yǎng)過程中的微生物污染風(fēng)險，適用于大規(guī)模植物組織培養(yǎng)[2-5]

近年來，無糖組織培養(yǎng)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于園藝作物及藥用植物的快速繁殖。已有研究人員對草莓[6]、楸樹[7]、甘薯[8]、地黃[9]、半夏[10]等植物在無糖培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)基配方、光照時長、通氣時間、CO₂ 濃度和光照度等關(guān)鍵因素進(jìn)行系統(tǒng)探究。Chen等[]利用轉(zhuǎn)基因測序技術(shù)揭示了無糖培養(yǎng)促進(jìn)馬鈴薯試管苗光合作用和生長發(fā)育的機(jī)理。盡管無糖組織培養(yǎng)技術(shù)已在馬鈴薯組培苗的生產(chǎn)與擴(kuò)繁中初步應(yīng)用，但其培養(yǎng)過程中的 CO₂ 濃度、光照度、最佳通氣量等核心參數(shù)仍需進(jìn)一步優(yōu)化[12-16]

本研究擬引入強(qiáng)制換氣裝置系統(tǒng)，精準(zhǔn)控制環(huán)境條件，并利用外源 CO₂ 替代糖分作為碳源，旨在縮短馬鈴薯種薯繁育周期，降低生產(chǎn)成本，同時提高組培苗的質(zhì)量與生產(chǎn)效率，最終實現(xiàn)馬鈴薯的高效生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為青薯9號脫毒組培苗，由市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。

無糖組織快繁裝置由上海離草科技有限公司生產(chǎn)。無糖組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)盒尺寸為 25cm× 20cm×8cm （長 × 寬 × 高），傳統(tǒng)組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)盒尺寸為 6.35cm×6.35cm×9.15cm （長 × 寬 × 高）。M519培養(yǎng)基和M524培養(yǎng)基為PhytoTechnologyLa-boratories公司產(chǎn)品，蔗糖、瓊脂均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

含糖培養(yǎng)基：所用營養(yǎng)液為M519培養(yǎng)基（不含維生素） +4.0% 蔗糖，基質(zhì)為瓊脂（ 7g/L ，培養(yǎng)基 pH 值為 15.8～6.0 ，培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓滅菌。無糖培養(yǎng)基：所用營養(yǎng)液為M524培養(yǎng)基（含維生素）， pH 值為5.8～6.0，基質(zhì)為蛭石，營養(yǎng)液、蛭石經(jīng)高溫高壓滅菌。

1.2試驗設(shè)計

1.2.1無糖條件下蛭石與營養(yǎng)液配比對馬鈴薯組培苗的影響采用無糖培養(yǎng)基，設(shè)置V蛭石：V營養(yǎng)液=1.0：0.7 （M1）、 V_☉E ： （M2）、 個梯度的蛭石與營養(yǎng)液配比。溫度為（ 22±2 ） C ，光照時間為 16h/d ，光照度為 75μmol/（m²?s） ，培養(yǎng)第5d通人1200μmol/molCO₂ ，通氣時長為 8h/d 。培養(yǎng)21d后測定植株形態(tài)及生理指標(biāo)。

1.2.2無糖條件下 CO₂ 含量對馬鈴薯組培苗的影響根據(jù)前期預(yù)試驗結(jié)果， CO₂ 含量 lt;400μmol/mol 或者 gt;1 500μmol/mol 時，組培苗長勢較差。因此設(shè)置 500μmol/mol （C1） .800μmol/mol （C2）、1100μmol/mol（C3） 和 1 400μmol/mol（C4）4 個梯度的CO₂ 含量。溫度為（ 22±2 ） C ，采用無糖培養(yǎng)基0 ，光照時間為 16h/d ，光照度為 75μmol/（m²?s） 。培養(yǎng)第5d通入 CO₂ 氣體，通氣時長為 8h/d 。培養(yǎng)21d后測定植株形態(tài)及生理指標(biāo)。

1.2.3無糖條件下光照度對馬鈴薯組培苗的影響

根據(jù)預(yù)試驗的結(jié)果，光照度 lt;40μmol/（m²?s） 和 時，組培苗長勢不佳。因此設(shè)置 50μmol/（m²?s） （L1）、 75μmol/（m²?s） （L2）和 100μmol/（m²?s）（L3）3 個梯度的光照度。培養(yǎng)溫度為（ 22±2 ） C ，采用無糖培養(yǎng)基（ V_☉G ： ，光照時間為 16h/d 。培養(yǎng)第5d通入 CO₂ 氣體，通氣時長為 8h/d 。培養(yǎng)21d后測定植株形態(tài)及生理指標(biāo)。

1.2.4無糖組織培養(yǎng)與傳統(tǒng)組織培養(yǎng)對馬鈴薯組培苗和原原種的影響無糖組織培養(yǎng)（SF）采用無糖培養(yǎng)基 （ ，培養(yǎng)溫度為（ 22±2 ） C ，光照時間為 16h/d ，光照度為75μmol/（m²?s） 。第 5d 通入 CO₂ 氣體， CO₂ 含量為1 200μmol/mol ，通氣時長為 8h/d 。培養(yǎng)21d后，隨機(jī)選擇10株馬鈴薯組培苗，在自然光下煉苗 3d ，將其定植于蛭石中，用于生產(chǎn)馬鈴薯原原種。

傳統(tǒng)組織培養(yǎng)（S）采用含糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度為 （22±2 ） C ，光照時間為 16h/d ，光照度為75μmol/（m²?s） 。培養(yǎng)21d后，隨機(jī)選擇10株馬鈴薯組培苗，在自然光下煉苗3d，將其定植于蛭石中，用于生產(chǎn)馬鈴薯原原種。

定植密度為 1m² 200株，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，每種培養(yǎng)方式重復(fù)3次。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1植株形態(tài)指標(biāo)及生理指標(biāo)測定株高：用直尺測量莖基部至植株最高點的垂直高度。莖粗：用游標(biāo)卡尺測量植株基部最粗處橫縱2個方向的直徑，并計算平均值。鮮重：組培苗洗凈擦干后，用精度為 的電子天平測定。莖節(jié)間長度：用直尺測量組培苗底部自下而上前3節(jié)的節(jié)間長度。SPAD值：采用手持便攜式葉綠素測定儀（型號SPAD-502Plus，日本Minolta公司產(chǎn)品）測定植株頂端完全展開的第3、4片葉。成活率：成活率 Σ=Σ 成活組培苗數(shù)/扦插組培苗總數(shù) ×100% 。

1.3.2原原種產(chǎn)量及數(shù)量測定收獲后按單薯重量分級統(tǒng)計產(chǎn)量及數(shù)量，分級標(biāo)準(zhǔn)為單薯重量 lt;2.0 （20 g，2.0～4.9g，5.0～9.9g，10.0～19.9g，gtrsim20.0ge （20單薯重量 ?2.0g 的馬鈴薯原原種為有效薯。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

使用MicrosoftExcel2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制，使用Graphpadprism軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1無糖條件下蛭石與營養(yǎng)液配比對馬鈴薯組培苗的影響

如圖1所示，M2處理馬鈴薯組培苗株高最高，為 97.64mm 。M1處理和M3處理馬鈴薯組培苗株高顯著低于M2處理（ Plt;0.05 ）。M2處理馬鈴薯組培苗莖最粗，為 1.53mm，M1 處理和M3處理馬鈴薯組培苗莖粗顯著低于M2處理（ Plt; 0.05）。各處理馬鈴薯組培苗葉片數(shù)、鮮重?zé)o顯著差異（ ?Pgt;0.05） 。M3處理馬鈴薯組培苗SPAD值最高，為36.19，M1和M2處理馬鈴薯組培苗SPAD值顯著低于M3處理（ Plt;0.05， 。M2處理馬鈴薯組培苗第1莖節(jié)間顯著高于M3處理（ Plt; 0.05），第2莖節(jié)間長度均顯著高于M1處理和M3處理（ Plt;0.05 ）。表明無糖條件下，

1.0：0.8 的配比可顯著提高馬鈴薯組培苗株高、莖粗、莖節(jié)間長度和SPAD值。

2.2無糖條件下 CO₂ 含量對馬鈴薯組培苗的影響

如圖2所示，無糖條件下，隨著 CO₂ 含量的增加，馬鈴薯組培苗的株高、莖粗、葉片數(shù)、SPAD值、鮮重、莖節(jié)間長度呈先升高后降低的趨勢。C2處理馬鈴薯組培苗株高、莖粗、SPAD值均顯著高于C1處理、C3處理和C4處理（ Plt;0.05 ），C2處理馬鈴薯組培苗鮮重顯著高于C3處理和C4處理（ Plt; 0.05）。各處理馬鈴薯組培苗葉片數(shù)無顯著差異二 （Pgt;0.05） 。C2處理馬鈴薯組培苗第2莖節(jié)間長度顯著高于C1處理（ Plt;0.05 ）。C2處理馬鈴薯組培苗第3莖節(jié)間長度顯著高于C1處理、C3處理和C4處理（ Plt;0.05 ）。表明無糖條件下， 800μmol/mol CO₂ 可顯著提高馬鈴薯組培苗的株高、莖粗、SPAD值、鮮重和莖節(jié)間長度。

2.3無糖條件下光照度對馬鈴薯組培苗的影響

如圖3所示，L2處理和L3處理馬鈴薯組培苗株高分別為 85.25mm 和 84.39mm ，均顯著高于L1處理（ Plt;0.05） 。L3處理馬鈴薯組培苗莖粗、葉片數(shù)分別為 1.67mm 和9.40，均顯著高于L1處理（ Plt; 0.05）。L3處理馬鈴薯組培苗SPAD值最高，為53.83，L1和L2處理馬鈴薯組培苗SPAD值顯著低于L3處理（ Plt;0.05） 。L2處理和L3處理馬鈴薯組培苗鮮重分別為 0.47g 和 0.52g，L1 處理馬鈴薯組培苗鮮重顯著低于L2處理和L3處理（ Plt;0.05） 。各處理馬鈴薯組培苗第1、第3莖節(jié)間長度無顯著差異（ ；L3處理馬鈴薯組培苗第2莖節(jié)間長度顯著低于L1和L2處理（ Plt;0.05） 。由于L2處理和L3處理馬鈴薯組培苗株高、莖粗、葉片數(shù)、鮮重、第1莖節(jié)間長度、第3莖節(jié)間長度均無顯著差異（ Pgt;0.05） ，考慮到降本增效，選用L2處理下的光照度 作為最佳參數(shù)。

2.4無糖組織培養(yǎng)與傳統(tǒng)組織培養(yǎng)對馬鈴薯組培苗和原原種的影響

2.4.1不同培養(yǎng)方式對馬鈴薯組培苗形態(tài)指標(biāo)和生理指標(biāo)的影響如圖4所示，SF處理馬鈴薯組培苗的株高、莖粗、鮮重和SPAD值均顯著高于S處理。SF處理馬鈴薯組培苗第1莖節(jié)間長度顯著低于S處理（ Plt;0.05） ，第3莖節(jié)間長度顯著高于S處理（ Plt;0.05 。表明無糖組織培養(yǎng)可顯著提高馬鈴薯組培苗的株高、莖粗、鮮重和SPAD值。

2.4.2不同培養(yǎng)方式對不同生育期馬鈴薯植株的影響如表1所示，在苗期，SF處理馬鈴薯株高、莖粗、SPAD值和地上部鮮重均顯著高于S處理。在塊莖形成期，SF處理馬鈴薯株高、莖粗、SPAD值、地上部鮮重、地下部鮮重和根冠比均顯著高于S處理0 （Plt;0.05） 。在塊莖膨大期，SF處理馬鈴薯株高、地上部鮮重、地下部鮮重均顯著高于S處理（ Plt; 0.05）。在淀粉積累期，SF處理馬鈴薯株高、地上部鮮重、地下部鮮重均顯著高于S處理（ Plt;0.05） 。綜上，無糖組織培養(yǎng)（SF）得到的馬鈴薯植株整體長勢優(yōu)于傳統(tǒng)組織培養(yǎng)，特別是在植株生長的早期階段。

2.4.3不同培養(yǎng)方式對原原種產(chǎn)量和數(shù)量的影響如表2所示，SF處理青薯9號原原種總產(chǎn)量、結(jié)薯總數(shù)、有效薯數(shù)量、單株結(jié)薯數(shù)、單薯重量和成活率均顯著高S處理（ Plt;0.05） 。如表3所示，SF處理馬鈴薯 ?20.0g 的原原種產(chǎn)量和數(shù)量顯著高于S處理（Plt;0.05） 。SF處理馬鈴薯 5.0～9.9g 的原原種產(chǎn)量和數(shù)量顯著低于S處理 （Plt;0.05） 。SF處理馬鈴薯總數(shù)和總產(chǎn)量顯著高于S處理（ Plt;0.05. ）。表明無糖培養(yǎng)可以顯著提高大薯數(shù)量和大薯產(chǎn)量。

2.5馬鈴薯組培苗農(nóng)藝性狀與馬鈴薯原原種產(chǎn)量構(gòu)成因素的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果如表4所示，馬鈴薯原原種總產(chǎn)量與單薯重量呈極顯著相關(guān)（ r=1.00，Plt;0.001） ！與結(jié)薯總數(shù)（ ）、單株結(jié)薯數(shù)（ ）、成活率 r=0.93 ）、株高（ _r=0.97 ）、地上部鮮重（ r= 0.97）地下部鮮重（ r=0.96 呈極顯著正相關(guān)（ Plt; 0.01）。表明提高單株結(jié)薯數(shù)、單薯重量、成活率和株高，同時協(xié)調(diào)地上部與地下部的生長發(fā)育，是獲得馬鈴薯原原種高產(chǎn)的關(guān)鍵。

3討論

3.1無糖培養(yǎng)條件下培養(yǎng)基含水量的影響

在植物無糖培養(yǎng)體系中，蛭石因其多孔結(jié)構(gòu)而被廣泛用作支撐基質(zhì)[17-18]。這種多孔結(jié)構(gòu)可儲存充足的氧氣，能夠有效避免因水分過多導(dǎo)致的植物根系缺氧問題，還能緩釋營養(yǎng)液滿足植株對營養(yǎng)的需求[19]與傳統(tǒng)瓊脂培養(yǎng)基相比，蛭石成本更低，且蛭石具有重量輕、來源廣且便于機(jī)械化操作的特點，更適用于工業(yè)化生產(chǎn)[20]。研究結(jié)果表明，固體基質(zhì)與營養(yǎng)液的比例直接影響植株的生長，較高的固液比雖能給植株提供穩(wěn)定支撐，但可能會限制根系對養(yǎng)分的吸收，而較低的固液比雖有利于植物對水分和養(yǎng)分的吸收，卻可能影響植物根系對氧氣的吸收[2I]。本研究發(fā)現(xiàn)，無糖條件下， 的配比可以顯著促進(jìn)馬鈴薯組培苗的生長。王中月等[22發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蛭石基質(zhì)含水量為 80% ，弼猴桃組培苗的生根率最大，與本研究結(jié)論一致。

3.2 CO₂ 濃度和光照度對馬鈴薯組培苗的影響

作為光合作用的關(guān)鍵底物， CO₂ 濃度直接影響植物生長。截至2024年9月，大氣 CO₂ 濃度低于多數(shù)植物的 CO₂ 飽和點[23]， CO₂ 濃度成為限制植物光合速率和生物積累量的主要因素。 CO₂ 濃度過低會限制光合作用，濃度過高則可能引起氣孔關(guān)閉和氧化脅迫[24-25]。在無糖條件下，外界 CO₂ 濃度直接影響植物的光合作用效率。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著 CO₂ 含量的升高，馬鈴薯組培苗的株高、莖粗、葉片數(shù)、SPAD值、鮮重、莖第3節(jié)間長度呈先升高后降低的趨勢。當(dāng) CO₂ 含量為 時，馬鈴薯組培苗的株高、莖粗、SPAD值、鮮重達(dá)到最大值。表明適當(dāng)提升 CO₂ 濃度能夠有效促進(jìn)植物碳同化作用，提高其生長速率。不同作物對 CO₂ 含量的響應(yīng)存在差異，隨 CO₂ 含量的升高，菊花組培苗株高呈降低的趨勢，但其莖粗呈先增高后降低的趨勢[26]。半夏組培苗株高隨著 CO₂ 濃度的升高呈先升高后降低的趨勢，且在 CO₂ 含量為1 500μmol/mol 時，半夏組培苗株高達(dá)到最大值[27]。何長征等[28]對田間栽培的馬鈴薯大西洋進(jìn)行光合特性研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng) CO₂ 含量低于 ≥000μmol/mol 時，葉片光合速率隨著 CO₂ 含量的增加而提高，另外，不同品種、植株形態(tài)的馬鈴薯CO₂ 飽和點存在差異。

光照是影響組培苗生長的另一關(guān)鍵因素。傳統(tǒng)植物組織培養(yǎng)過程中，馬鈴薯組培苗生長所需的光照度為 25.0～37.5μmol/（m²?s）^[29.31] 。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，在無糖培養(yǎng)條件下，隨著光照度的增加，馬鈴薯組培苗的株高、莖粗、葉片數(shù)量、SPAD值以及鮮重均顯著提高。這一結(jié)果表明，適當(dāng)提高光照度能夠顯著促進(jìn)馬鈴薯組培苗的生長發(fā)育，75μmol/（m²?s） 的光照度能夠滿足馬鈴薯組培苗的光合需求，又可避免因光照度過高導(dǎo)致的能量浪費。占艷等[32]發(fā)現(xiàn)，適宜的光照度能夠顯著提升半夏組培苗的光能利用效率及生長發(fā)育。本研究進(jìn)一步證實，合理調(diào)控光照度不僅能顯著提升組培苗的生物量，還能避免資源浪費和光損傷，為植物組織培養(yǎng)的光環(huán)境優(yōu)化提供了科學(xué)依據(jù)。

3.3有糖與無糖組織培養(yǎng)方式的比較

傳統(tǒng)有糖組織培養(yǎng)方式雖然能直接為組培苗提供碳源，但這種培養(yǎng)方式可能導(dǎo)致植株光合能力和代謝能力下降。相比之下，無糖組織培養(yǎng)則迫使組培苗完全依賴光合作用獲取能量，從而激發(fā)其光合潛力和自主代謝能力，形成更加健壯的植株[11，33]本研究發(fā)現(xiàn)，無糖組織培養(yǎng)顯著提高了馬鈴薯組培苗株高、莖粗、葉片數(shù)、鮮重和SPAD值。已有研究結(jié)果表明，在無糖條件下，通過優(yōu)化光照度、 CO₂ 濃度等環(huán)境因素，能夠顯著提升植物的光合效率[34-35]。這可能是因為無糖環(huán)境改變了植株的碳代謝途徑，促使其更高效地利用外界的 CO₂ 進(jìn)行光合作用。無糖組織培養(yǎng)的原原種產(chǎn)量、數(shù)量和成活率均顯著高于傳統(tǒng)組織培養(yǎng)，該結(jié)果與馮潔等[5]的研究結(jié)果一致。本研究首次系統(tǒng)分析了無糖組織培養(yǎng)技術(shù)在馬鈴薯組培苗生產(chǎn)中的優(yōu)勢，為其他經(jīng)濟(jì)作物的無糖組織培養(yǎng)提供了理論依據(jù)和技術(shù)參考。

4結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，無糖條件下，馬鈴薯無糖組織培養(yǎng)的最適條件為 ， CO₂ 含量 ，光照度 75μmol/（m²?s） 。與傳統(tǒng)組織培養(yǎng)相比，無糖組織培養(yǎng)得到的馬鈴薯原原種的產(chǎn)量、數(shù)量和成活率分別顯著提高 16.09%.22.37% 和 3.27%（Plt;0.05） 。本研究為馬鈴薯組培苗的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和工廠化繁育提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

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（責(zé)任編輯：成紓寒）