茶樹(shù)CsTLRs基因密碼子偏好性與進(jìn)化分析

Abstract：The TLR gene has thefunction ofregulating the growthand development of planttrichomes.Leaftrichome is oneof theimportantmorphological characteristicsofCameliasinensis（L.），which playsanimportantroleinthephysiology and ecology of tea plant and tea quality.In this study，we conducted a comprehensive analysis of tea plant CsTLRs genes， including codonparameters，geneticrelationshipand heterologous expresion hosts.This wasachieved using multipleanalytical approaches including neutral plot analysis，parityrule2 plot（PR2-plot）analysis，implemented through softwares such as CodonW and EMBOSS.The results showedthatthe codon usage bias of CsTLRs genes was weak，and the bias was primarily dominated by natural selection. There were 2O optimal codons in CsTLRs genes，mostly ending with A/U . Both cluster analyses of the coding sequences （CDS） and relative synonymous codon usage （ RSO ）revealed that CsTLRs genes in tea plant

werephylogenetically closer to those in poplar（Populus） andcucumber（Cucumissativus）. Forheterologous expression of CsTLRs genes from tea plant，tobacco （Nicotianatabacum），Arabidopsis（Arabidopsisthaliana），and tomato （Solanum lycopersicum） could be selected as genetic transformationrecipients，while the expression inmicroorganisms was better in Saccharomyces cerevisiae.In summary，this study analyzed the codon usage biasof CsTLRs genesintea plants，elucidating theircharacteristic codon

usagepaterns during theregulationofleaftrichomedevelopment.Thesefindings would providereferencesforfuturefunctional studies of CsTLRs genes.

Key words： tea plant；leaf trichomes；CsTLRs genes；codon bias；evolutionary analysi：

密碼子由mRNA上編碼氨基酸的3個(gè)核苷酸序列組成。生物體中共有64種密碼子，其中有3種終止密碼子不編碼氨基酸，其余的61種密碼子分別編碼20種氨基酸，因此存在多個(gè)密碼子編碼同一種氨基酸的情況，即存在同義密碼子[1]。然而，同義密碼子在不同基因或基因組中的利用程度不同，這種現(xiàn)象被稱(chēng)為密碼子使用偏好性[2-3]。密碼子使用偏好性在動(dòng)植物、細(xì)菌中普遍存在，這種偏好性雖然不會(huì)改變氨基酸序列，但會(huì)影響RNA加工、蛋白質(zhì)翻譯和折疊等過(guò)程[45]。研究密碼子偏好性可以更加深人地了解生物體的遺傳特性，根據(jù)宿主密碼子偏好性優(yōu)化和改造外源基因的密碼子，提升目的基因的表達(dá)效率和穩(wěn)定性，為基因功能的研究提供重要支撐。

茶樹(shù)葉片茸毛是葉片上的毛狀體組織，由表皮細(xì)胞向外突出形成，屬于非分泌腺不分支的單細(xì)胞，形態(tài)呈細(xì)長(zhǎng)的銀色絲狀，常位于茶樹(shù)的幼嫩芽葉表面，并隨著葉片成熟而逐漸脫落[6。茶樹(shù)葉片茸毛的存在增強(qiáng)了茶樹(shù)抵御外界環(huán)境脅迫的能力，毛狀體作為植物的第一道物理屏障，在保護(hù)植物免受過(guò)度太陽(yáng)輻射、增加蒸騰作用、增強(qiáng)抗凍性和防御病蟲(chóng)害等方面有著重要作用[7-9]。此外，茶毫（成品茶中的茶樹(shù)葉片茸毛）是影響茶葉品質(zhì)的關(guān)鍵因素。研究結(jié)果表明，茶毫富含氨基酸、茶多酚等功能性成分，這些物質(zhì)不僅能賦予茶湯獨(dú)特的鮮爽滋味和香氣特征，還能提升茶葉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。在加工過(guò)程中，毫毛的數(shù)量及其顯隱程度已經(jīng)成為茶葉感官品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，如碧螺春、都勻毛尖等名優(yōu)茶均以“白毫顯露”為重要特征。消費(fèi)者通常更傾向于選擇外觀優(yōu)美、口感鮮爽的茶葉產(chǎn)品，茶毫的存在可以提高茶葉的商品價(jià)值[10-13] 。

TLRs（TrichomeLessregulators）是一類(lèi)調(diào)控植物毛狀體發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子，目前已在黃花蒿（Artemisiaannua）中鑒定了3個(gè)成員：TLR1、TLR2、TLR3，它們?cè)谡{(diào)控毛狀體密度方面扮演了重要角色[14-15]。TLR1和TLR2可通過(guò)降低赤霉素水平負(fù)向調(diào)節(jié)毛狀體密度，對(duì)毛狀體的形成和青蒿素的生物合成有抑制作用，當(dāng)這2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的功能被削弱時(shí)，毛狀體數(shù)量增加，青蒿素水平也隨之上升[14]。TLR3負(fù)調(diào)控毛狀體的密度和分支，同時(shí)，TLR3與TAR1、CycTL互作調(diào)節(jié)黃花蒿表皮角質(zhì)層發(fā)育和毛囊形態(tài)，對(duì)毛狀體起始階段和角質(zhì)層生物合成尤為關(guān)鍵[15]。目前關(guān)于茶樹(shù)葉片毛狀體的分子調(diào)控研究還較少，尚不足以揭示茶樹(shù)葉片茸毛發(fā)育的機(jī)制。Liu等[1]研究發(fā)現(xiàn)，CsWD40與2個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子（CsGL3和CsTT8）、2個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子（CsAN2和CsMYB5e）互作，并且CsWD40基因在擬南芥ttg1突變體中過(guò)表達(dá)能夠恢復(fù)毛狀體和種皮的發(fā)育，與Sun等[17]的研究結(jié)果相互印證。Li等[18研究發(fā)現(xiàn)，CsMYB1與CsGL3、CsWD40有相互作用，并形成MYB-bHLH-WD40三聚體復(fù)合物，進(jìn)而激活毛狀體調(diào)節(jié)基因CsGL2和CsCPC。劉任堅(jiān)等[19研究發(fā)現(xiàn)CsbHLH024/CsbHLH133和CsTTG1蛋白在植物中互作，它們的啟動(dòng)子能夠在葉片組織中驅(qū)動(dòng)下游基因表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮功能。茶樹(shù)毛狀體的形成機(jī)制復(fù)雜，對(duì)于CsTLRs調(diào)控茶樹(shù)葉片毛狀體發(fā)育的研究還有待補(bǔ)充。

本研究基于茶樹(shù)全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，利用CodoΩ_nW 、EMBOSS等軟件對(duì)茶樹(shù)CsTLRs基因的密碼子參數(shù)和密碼子使用偏好性進(jìn)行分析，以期為后續(xù)研究CsTZRs在茶樹(shù)葉片毛狀體發(fā)育中的具體功能以及確定合適的異源表達(dá)宿主提供重要參考。

1材料與方法

1.1 基因組序列獲取

從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取黃花蒿轉(zhuǎn)錄因子 TLR1、TLR2、TLR3 的編碼序列（Coding sequence，CDS）蛋白質(zhì)序列及注釋文件，并在茶樹(shù)基因組TPIA數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//tpia.teaplant.org）中利用本地BLAST在“舒茶早”基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取茶樹(shù)CsTLRs基因的CDS和蛋白質(zhì)序列，剔除長(zhǎng)度小于300bp 的序列與重復(fù)序列，最終獲得25條符合條件的編碼序列用于后續(xù)研究。

1.2 密碼子相關(guān)參數(shù)分析

利用CodonW、EMBOSS（https：//www.bioinformatics.nl/emboss-explorer/）和生信云網(wǎng)站（http：//112.86.217.82：9919）等對(duì)25條CDS序列進(jìn)行分析，獲取有效密碼子數(shù)（Effectivenumberofcodon，ENC）、各位點(diǎn) G+C 含量[ GC₁ （密碼子第1位堿基G+C 含量）； GC₂ （密碼子第2位堿基 G+C 含量）；GC₃ （密碼子第3位堿基 G+C 含量）； GC_all （總 G+C 含量）]、密碼子第3位堿基 A，T，C，G 含量 （A₃，T₃ 、 、相對(duì)同義密碼子使用度（Relative synony-mous codon usage， RSCU ）、密碼子適應(yīng)指數(shù)（Codonadaptationindex， CAI ）、最優(yōu)密碼子使用頻率（Frequencyofoptimalcodons，F(xiàn)OP）等數(shù)據(jù)。使用SPSS軟件對(duì)茶樹(shù)CsTLRs基因組密碼子偏好性參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.3 中性繪圖分析

計(jì)算各密碼子 GC₁ 和 GC₂ 的平均值，定義為 GC₁₂ ，然后以 GC₃ 為橫坐標(biāo)， GC₁₂ 為縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖并分析它們之間的相關(guān)性。如果 GC₃ 和 GC₁₂ 之間具有顯著的相關(guān)性，說(shuō)明密碼子在3個(gè)位置上的堿基組成差異較小，基因突變是主要的影響因素；若兩者之間沒(méi)有顯著相關(guān)性，則說(shuō)明堿基 G?C 組成高度保守，密碼子使用的偏好性更多地受到自然選擇的影響[20]

1.4 奇偶偏好性分析（PR2-plot）

奇偶偏好性分析用于揭示基因中4種堿基含量之間的相互關(guān)系，從而深入分析基因組中密碼子使用偏好的影響因素。以 G₃/（G₃+C₃） 為橫坐標(biāo)， A₃/ （A₃+T₃） 為縱坐標(biāo)繪制PR2-plot圖。中心點(diǎn)表示堿基數(shù)量 A=T，C=G ，證明在此條件下密碼子沒(méi)有明顯的使用偏好，僅受到突變的影響。偏離中心點(diǎn)的其他位置則反映了密碼子使用的偏倚程度與方向[21]。通過(guò)分析點(diǎn)的偏離情況，可以推斷基因中第3位密碼子嘌呤（A和G）與嘧啶（C和T）之間的相對(duì)含量及其可能存在的關(guān)系。

1.5基于 GC₃ 的有效密碼子數(shù)分析（ENC-plot）

以 GC₃ 為橫坐標(biāo)，ENC為縱坐標(biāo)，繪制基因散點(diǎn)圖，同時(shí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制公式參照文獻(xiàn)[22]。分析基因點(diǎn)在圖中相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的位置，若基因點(diǎn)接近標(biāo)準(zhǔn)曲線，表明突變可能主導(dǎo)密碼子使用模式；若基因點(diǎn)遠(yuǎn)離標(biāo)準(zhǔn)曲線，則表明自然選擇對(duì)密碼子使用偏好產(chǎn)生更大影響。同時(shí)為糾正ENC-plot分析造成的誤差，需要結(jié)合 ENC_tti 頻數(shù)對(duì)誤差進(jìn)行量化分析。 ，其中 ENC_filife 為密碼子偏好性僅由堿基組成決定的預(yù)期有效密碼子數(shù)， ENC_☉B(tài)F 為密碼子實(shí)際使用頻率得出的有效密碼子數(shù)，當(dāng) ENC_tti 的絕對(duì)值大于0.05，表明偏好性受自然選擇影響更大。

1.6 相對(duì)同義密碼子使用度（RSCU）分析

RSCU的計(jì)算去除了氨基酸組成對(duì)密碼子使用偏好性的影響，可用于衡量基因組中密碼子使用的偏好。如果RSCU等于1.00，則密碼子使用沒(méi)有偏好性；RSCU大于1.00表明該密碼子的使用頻率較高，反之亦然[23]

1.7 最優(yōu)密碼子分析

按ENC升序排列基因，兩端各取3個(gè)基因，分別構(gòu)建高偏性庫(kù)和低偏性庫(kù)。計(jì)算偏性庫(kù)之間的RSCU差值（△RSCU），以 ΔRSCU 大于0.08的密碼子為具有高表達(dá)潛力的優(yōu)越密碼子，RSCU大于1.00的密碼子為高頻密碼子。當(dāng)同時(shí)滿足△RSCU大于0.08和RSCU大于1.00，該密碼子被定義為最優(yōu)密碼子，具有高偏好性和高表達(dá)的潛力[24]

1.8 系統(tǒng)聚類(lèi)分析

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取與植物毛狀體相關(guān)研究物種的CDS，包括番茄（Solanum lycopersicum）煙草（Nic-otiana tabacum）楊樹(shù)（Populus）黃瓜（Cucumissati-vus）擬南芥（Arabidopsis thaliana）棉花（Gossypium hir-sutum）大豆（Glycinemax）和水稻（Oryzasativa）。在ClustalW 網(wǎng)站（htps：//www.genome.jp/tools-bin/clust-alw）采用鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并通過(guò)EVOLVIEW（https：//evolgenius.info/evolview-v2/#login）對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行可視化分析。同時(shí)以各物種RSCU為變量，使用SPSS19.0離差平方和法，設(shè)定歐式平方距離并進(jìn)行偏好性聚類(lèi)分析。

1.9 外源受體分析

通過(guò)EMBOSS網(wǎng)站獲取茶樹(shù)CsTLRs基因的密碼子使用頻率，在CodonUsageDatabase網(wǎng)站（ht-tps：//www.kazusa.or.jp/codon/）獲取煙草（Nicotianatabacum）番茄（Solanumlycopersicum）擬南芥（Ara-bidopsisthaliana）大腸桿菌（Escherichiacoli）、釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）的基因組密碼子使用頻率。計(jì)算茶樹(shù)與各物種密碼子使用頻率的比值進(jìn)而選擇合適的外源受體。比值為0.50～2.00表示密碼子偏性差異較小，適合作為異源表達(dá)受體[25]

2 結(jié)果與分析

2.1茶樹(shù)CsTLRs基因密碼子相關(guān)參數(shù)分析

2.1.1 密碼子的堿基組成分析對(duì)密碼子的堿基組成分析發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)CsTLRs基因的總 G+C 含量（ GC_all ）為 39.20%～56.82% ，平均值為 44.94% ；密碼子第1位堿基 G+C 含量（ GC₁ 為 38.83%～53.18% ，平均值為46.82% ;密碼子第2位堿基 ΔG+ΔC 含量（ GC₂ ）為 32.73%～54.04% ，平均值為 42.20% ；密碼子第3位堿基 G+C 含量（ GC₃ ）為36. 68%～63.64% ，平均值為45.81% （表1）。以上分析結(jié)果表明，密碼子組成更偏向堿基 ΔA/U ，密碼子不同位置堿基 G+C 含量不同，其中 GC₁ 含量平均值最高， GC₂ 含量平均值最低，各位點(diǎn)堿基組成不存在明顯偏好性。

2.1.2有效密碼子數(shù)（ENC）、密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）及最優(yōu)密碼子使用頻率（FOP）分析ENC反映了一個(gè)基因整體上的密碼子使用偏好性，其范圍通常為20.00～61.00 ENC與密碼子使用偏好性之間呈負(fù)相關(guān)，ENC越接近20.00，表示密碼子偏好性越強(qiáng)；越接近61.00，則表明密碼子偏好性越弱[26]。茶樹(shù)CsTLRs基因ENC范圍為 41.69～61.00 ，平均值53.06，基因ENC都大于40.00，這表明茶樹(shù)CsTLRs基因的密碼子使用偏好性較弱（表1）。

CAI是用來(lái)衡量某個(gè)基因所使用的密碼子與該物種高表達(dá)基因密碼子使用模式之間的相適度[27]，其取值范圍為0～1.00，隨著CAI的增大，基因的密碼子使用偏好性趨向于物種特有的高表達(dá)基因模式。茶樹(shù)CsTLRs基因組CAI范圍為0.13～0.22，平均值0.18（表1），表明該基因密碼子適應(yīng)性較弱。FOP指最優(yōu)密碼子在同義密碼子中的占比，其數(shù)值越大，密碼子使用偏好性越強(qiáng)[26]。茶樹(shù)CsTLRs基因FOP范圍為0.33～0.45，平均值0.39，偏好性較弱。

2.1.3密碼子偏好性參數(shù)相關(guān)性分析對(duì)茶樹(shù)CsTLRs基因密碼子偏好性參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析（表2）。 GC_all 分別與 GC₁，GC₂，GC₃ 呈極顯著正相關(guān)（ Plt; 0.01）。 GC₂ 和 GC₃ 呈顯著相關(guān)（ Plt;0.05） GC₁ 與

GC₂、GC₃ 無(wú)顯著相關(guān)性，表明基因密碼子第2位和第3位堿基組成有相似性，且與第1位堿基組成有較大差異。 GC₃ 與ENC沒(méi)有顯著相關(guān)性，表明第3位堿基對(duì)密碼子使用偏好性的影響較小。

2.2 中性繪圖分析

圖1顯示， GC₁₂ 含量為 38.67%～53.41%， （2號(hào) GC₃ 含量為 36.68%～ 63.64% ， GC₁₂ 和 GC₃ 回歸系數(shù)為 0.194 5，R² 為0.1813。表明 GC₁₂ 和 GC₃ 之間無(wú)明顯相關(guān)性，堿基 G+C 組成高度保守，基因突變貢獻(xiàn)率占 19.45% ，自然選擇貢獻(xiàn)率占 80.55% ，則茶樹(shù)CsTLRs基因的密碼子使用偏好性更易受自然選擇的影響。

GC₃ ：密碼子第3位堿基 σ_G+C 含量： GC₁₂ ：密碼子第1位堿基 G+ C含量（ （GC₁） 和第2位堿基 含量（ GC₂） 的平均值。

2.3 奇偶偏好性分析（PR2-plot）

圖2顯示，茶樹(shù)CsTLRs基因散點(diǎn)分布不均勻，表明茶樹(shù)基因密碼子偏好性受突變影響小，進(jìn)一步證實(shí)CsTLRs基因密碼子偏好性主要受自然選擇的影響。橫坐標(biāo) G₃/（G₃+C₃） 中比值大于0.5的散點(diǎn)占比 40% ，表示堿基C使用頻率略大;縱坐標(biāo) A₃/ （A₃+T₃） ）中比值大于0.5的散點(diǎn)占比 28% ，表示堿基T的使用頻率明顯高于堿基 A 。

橫坐標(biāo) G₃/（G₃+C₃） ：密碼子第3位堿基G的含量與第3位堿基 含量的比值;縱坐標(biāo) A₃/（A₃+T₃） ：密碼子第3位堿基A的含量與第3位堿基 A+T 含量的比值。

2.4基于 GC₃ 的有效密碼子數(shù)分析（ENC-plot）

如圖3所示，基因散點(diǎn)不同程度地偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線，表明茶樹(shù)CsTLRs基因密碼子偏好性主要受自然選擇影響。 96% 的基因散點(diǎn)偏離于標(biāo)準(zhǔn)曲線下方，則基因偏好使用的特定的密碼子表現(xiàn)出更低的 ENC 。為進(jìn)一步確定中性突變和自然選擇的影響程度，結(jié)合 ENC_ttifi 對(duì)差異進(jìn)行量化分析（表3），發(fā)現(xiàn)只有5個(gè)基因 ENC_tt/fi 的絕對(duì)值 ?0.05，80% 基因 ENC_ttit 的絕對(duì)值 gt;0.05 ，表明茶樹(shù)CsTLRs基因的密碼子偏好性受自然選擇影響更大，證實(shí)了中性繪圖和PR2-plot的分析結(jié)果。

2.5相對(duì)同義密碼子使用度（RSCU）分析

密碼子RSCU大于1.00稱(chēng)為高頻密碼子，圖4顯示，茶樹(shù)CsTLRs基因中有29個(gè)高頻密碼子，其中密碼子AGA的RSCU最大，為2.23。高頻密碼子中U結(jié)尾的密碼子占 44.83% ；A結(jié)尾的密碼子占27.59% ;G結(jié)尾的密碼子占 13.79% ;C結(jié)尾的密碼子占 13.79% ，證明茶樹(shù)CsTLRs基因偏好使用以 A U結(jié)尾的密碼子。

2.6 最優(yōu)密碼子分析

對(duì)茶樹(shù)CsTLRs基因進(jìn)行最優(yōu)密碼子分析，結(jié)果（表4）顯示，剔除終止密碼子，通過(guò)ENC構(gòu)建高偏性庫(kù)和低偏性庫(kù)，計(jì)算偏性庫(kù)之間的RSCU差值（△RSCU），篩選出同時(shí)滿足 ΔRSCUgt;0.08，RSCUgt; 1.00的密碼子作為最優(yōu)密碼子，最終篩選出20個(gè)最優(yōu)密碼子：GCA、GCC、UGU、GAU、GAA、GGA、CAU、CUC、CUU、AAU、CCA、CCU、CAA、AGA、AGG、UCA、UCU、ACA、GUU、UAU。其中U結(jié)尾的密碼子占45% ，A結(jié)尾的密碼子占 40% ，C結(jié)尾的密碼子占10% ，G結(jié)尾的密碼子占 5% ，進(jìn)一步證明了茶樹(shù)CsTLRs基因偏好使用以 A/U 結(jié)尾的密碼子。

2.7基于CDS與RSCU的聚類(lèi)分析

CDS聚類(lèi)是基于核苷酸序列的相似性（如突變、選擇壓力）構(gòu)建進(jìn)化關(guān)系，能夠反映物種或基因的系統(tǒng)發(fā)育歷史，而RSCU聚類(lèi)是基于同義密碼子使用頻率的差異，揭示翻譯選擇壓力、基因表達(dá)優(yōu)化等，主要反映功能適應(yīng)性[27-29]。CDS 聚類(lèi)分析結(jié)果表明茶樹(shù)與楊樹(shù)、黃瓜在遺傳距離近的分支上，說(shuō)明茶樹(shù)CsTLRs基因與楊樹(shù)和黃瓜的親緣關(guān)系較近（圖5A）?；赥LRs基因RSCU的聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，茶樹(shù)同樣與楊樹(shù)和黃瓜聚類(lèi)到一起，說(shuō)明在TZRs基因上茶樹(shù)與楊樹(shù)、黃瓜有較相似的密碼子使用偏好（圖5B），同時(shí)番茄、煙草、水稻在TLRs基因上的2種聚類(lèi)方式也高度相似，可見(jiàn)本研究大部分TLRs基因的CDS聚類(lèi)與RSCU聚類(lèi)結(jié)果相近，但在擬南芥、棉花和大豆上出現(xiàn)偏差，推測(cè)差異出現(xiàn)與基因的突變、轉(zhuǎn)移等相關(guān)，導(dǎo)致基因密碼子的使用偏好改變[30]，同時(shí)RSCU聚類(lèi)分析可能未能全面捕捉所有影響密碼子偏好性的要素，使結(jié)果無(wú)法準(zhǔn)確反映物種進(jìn)化關(guān)系[31]。以上結(jié)果表明，密碼子偏好性的聚類(lèi)與物種的進(jìn)化關(guān)系具有一定的相似性，但其分析結(jié)果還會(huì)受物種中基因的重組、倍增等突變的影響，RSCU聚類(lèi)可作為傳統(tǒng)進(jìn)化分析的良好補(bǔ)充。

2.8 外源表達(dá)受體選擇

將茶樹(shù)CsTLRs基因密碼子使用頻率與煙草、番茄、擬南芥、大腸桿菌、釀酒酵母、根癌農(nóng)桿菌基因組密碼子使用頻率相比較，比值在0.50＼～2.00的密碼子數(shù)量分別為57個(gè)、56個(gè)、60個(gè)、44個(gè)、52個(gè)、31個(gè)（表5），說(shuō)明3種模式植物（擬南芥、煙草和番茄）均可作為茶樹(shù)CsTLRs基因合適的遺傳轉(zhuǎn)化受體，若選擇微生物異源表達(dá)CsTLRs基因，釀酒酵母優(yōu)于大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌表達(dá)系統(tǒng)。

3討論

密碼子偏好性是基因表達(dá)調(diào)控和進(jìn)化的重要機(jī)制之一，它影響著轉(zhuǎn)錄和翻譯的效率，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的表達(dá)水平[32]。在生物信息學(xué)和基因組學(xué)研究中，密碼子偏好性研究有助于基因功能的預(yù)測(cè)和基因組注釋。目前，對(duì)茶樹(shù)基因密碼子偏好性的研究較少，但根據(jù)已有的研究結(jié)果可以得出茶樹(shù)基因組內(nèi)部密碼子使用偏好性是復(fù)雜和多樣的[33]?；虮磉_(dá)、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、基因長(zhǎng)度、tRNA豐度等多種因素都會(huì)影響密碼子偏好性，即使是緊密相關(guān)的基因也可能會(huì)根據(jù)自身的特性和環(huán)境適應(yīng)性而采用不同的密碼子使用模式[28.34-36]。茶樹(shù)CsTLRs 基因GC₃ 平均值為 45.81% ，篩選的20個(gè)最優(yōu)密碼子中，U結(jié)尾的密碼子占 45% ，A結(jié)尾的密碼子占 40% ，C結(jié)尾的密碼子占 10% ，G結(jié)尾的密碼子占 5% ，

CsTLRs基因表現(xiàn)偏好使用以 ΔA/U 堿基結(jié)尾的密碼子。有研究發(fā)現(xiàn)，單子葉植物更偏好 G/C 結(jié)尾的密碼子，雙子葉植物更偏好 A/U 結(jié)尾的密碼子[28]]在茶樹(shù)密碼子末尾堿基使用偏好性研究中，前人發(fā)現(xiàn)茶樹(shù) CsICEI^[25] 、 CsOMT^[37] 、 CsSAD^[38] 、CsG-PAT^[39] 、 CsLOX^[40] 、 CsWOX^[41] 、 CsSPDS^[42] 、CsNRT1. I^[43] 也偏好使用以 ΔA/U 結(jié)尾的密碼子， Cs ActinI^[44] 中以 A/U 或 G/C 結(jié)尾的密碼子數(shù)量相近，無(wú)明顯堿基偏好，而 CsCBFI^[45] 偏好 G/C 結(jié)尾的密碼子。上述研究結(jié)果表明，大部分茶樹(shù)基因偏好使用以 A/U 結(jié)尾的密碼子，這與雙子葉植物更偏好A/U結(jié)尾密碼子的觀點(diǎn)一致，并與趙洋等[33]的研究結(jié)果相符。茶樹(shù)CsTLRs基因ENC、CAI和FOP分別為53.06、0.18和0.39，說(shuō)明茶樹(shù)CsTLRs基因密碼子使用偏好性較弱，表達(dá)水平較低。對(duì)茶樹(shù)CsTLRs基因RSCU的分析確定了29個(gè)高頻密碼子，其中AGA的RSCU最高，為2.23。在茶樹(shù)基因CsLOX1、Cs-LOX6、CsLOX10、CsLOX12中使用頻率最高的密碼子也為 AGA^[40] ，由此推測(cè)茶樹(shù)基因?qū)?AGA 密碼子的使用表現(xiàn)出高度保守性。

目前對(duì)密碼子偏好性形成受自然選擇還是突變壓力影響的研究較多，例如自然選擇是鐵核桃葉綠體基因組密碼子偏好性形成的主要原因[46]，而莧的AtrNiR 基因密碼子偏好性受突變壓力影響更大[47]。通過(guò)中性繪圖、PR2-plot、ENC-plot一系列分析發(fā)現(xiàn)，自然選擇在塑造茶樹(shù)CsTLRs基因的密碼子偏好性方面發(fā)揮主導(dǎo)作用，與在 CsOMT^[37] CsLOX^[40] 、CsWOX^[41] 、大理茶葉綠體基因組[48]、黃藥大頭茶葉綠體基因組[49]中的研究結(jié)果一致，證明自然選擇在密碼子使用模式中的重要作用，同時(shí)基因突變、堿基組成等其他因素也會(huì)產(chǎn)生一定影響。通過(guò)對(duì)茶樹(shù)CsTLRs進(jìn)行CDS和RSCU聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，親緣關(guān)系更為緊密的物種之間，可能在密碼子使用偏好上呈現(xiàn)出更高的相似度。但受不同進(jìn)化因素的影響，如基因重組、倍增等突變，2種聚類(lèi)方式也存在不同程度的差異，對(duì)于一些基因（如 CsICEI^[25] 、CsCBFI^[45] RuTTI2-I^[50] ）的密碼子RSCU聚類(lèi)無(wú)法有效反映物種間的親緣關(guān)系。并且RSCU聚類(lèi)是通過(guò)分析不同物種間密碼子偏好性的差異來(lái)構(gòu)建關(guān)系結(jié)構(gòu)，可能在參數(shù)計(jì)算過(guò)程中丟失關(guān)鍵信息而導(dǎo)致偏差[31]，一般認(rèn)為基于CDS 構(gòu)建的聚類(lèi)能更準(zhǔn)確地反映物種間的關(guān)系。有研究結(jié)果表明，在較小的分類(lèi)單元，RSCU聚類(lèi)提供的信息更加精確，可能是因?yàn)樵诖藢哟紊衔锓N間的遺傳距離較短，密碼子使用偏好受共同祖先的影響更大，因此更能反映出真實(shí)的親緣關(guān)系[51-52]。因此，綜合使用CDS聚類(lèi)和RSCU聚類(lèi)更能顯著地提高分類(lèi)結(jié)果的精確度。對(duì)茶樹(shù)CsTLRs基因外源表達(dá)受體進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，3種模式植物（擬南芥、煙草和番茄）均可作為CsTLRs基因的遺傳轉(zhuǎn)化受體；在微生物異源表達(dá)中，與大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌相比，釀酒酵母是更好的外源表達(dá)載體。若要實(shí)現(xiàn)基因在外源物種中的高效表達(dá)，還需對(duì)部分偏好性差異較大的密碼子進(jìn)行改造，茶樹(shù)CsTLRs基因的高效遺傳轉(zhuǎn)化仍有待進(jìn)一步探索。綜上所述，本研究結(jié)果將有助于理解茶樹(shù)CsTLRs基因密碼子的使用特征，為后續(xù)研究該基因調(diào)控茶樹(shù)葉片毛狀體的發(fā)育提供參考。

4結(jié)論

本研究對(duì)茶樹(shù)CsTLRs基因的密碼子偏好性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，其密碼子偏好性較弱，且偏好以A/U結(jié)尾。在茶樹(shù)CsTLRs基因中，共鑒定出20個(gè)最優(yōu)密碼子，自然選擇是CsTLRs基因密碼子偏好性形成的主要原因。茶樹(shù)CsTLRs基因與楊樹(shù)、黃瓜有較近的親緣關(guān)系，且密碼子使用偏好性相似?？蛇x擇擬南芥、煙草和番茄作為茶樹(shù)CsTLRs基因異源表達(dá)的遺傳轉(zhuǎn)化的植物受體，在微生物中外源表達(dá)載體選擇釀酒酵母更佳。

參考文獻(xiàn)：

[1] 梁菲菲.密碼子偏性的影響因素及研究意義［J].畜牧與飼料 科學(xué)，2010，31（1）：118-119.

[2] HERSHBERGR，PETROVDA.Selection oncodonbias[J].An nualReview of Genetics，2008，42：287-299.

[3] PLOTKINJB，KUDLAG.Synonymousbut not the same：the causes and consequences ofcodon bias[J].Nature Reviews Genetics， 2011，12（1） ：32-42.

[4] LIUXY，LIY，JIKK，etal.Genome-wide codon usage pattern analysisrevealsthecorrelationbetweencodonusagebiasand gene expression in Cuscuta australis[J].Genomics，202O，112（4）： 2695-2702.

[5] PARVATHYST，UDAYASURIYANV，BHADANAV.Codon usagebias[J].MolecularBiologyReports，2022，49（1）：539-565.

[6] 孫彬妹，劉少群，劉任堅(jiān)，等.茶樹(shù)茸毛的研究進(jìn)展[J].茶葉通 訊，2018，45（4） ：3-6.

[7] STRATMANN JW，BEQUETTE C J. Hairlessbut no longer clueless：understanding glandular trichome development[J」. Journal of Experimental Botany，2016，67（18） ：5285-5287.

[8]HAUSER M T.Molecular basis of natural variation and environmental control of trichome paterning[J].Frontiers in Plant Science，2014，5：320.

[9]BANDYOPADHYAY T，GOHAIN B，BHARALEE R，et al. Molecularlandscape of Helopeltis theivora induced transcriptome and defense gene expression in tea[J].Plant Molecular Biology Reporter，2015，33（4） ：1042-1057.

[10]宋亞康，張群峰，張潔，等.茶毫氨基酸組成及礦質(zhì)元素分析 [J].茶葉科學(xué)，2017，37（4）：39-346.

[11］郭桂義，孫慕芳，陳義，等.茶葉茸毛的化學(xué)成分測(cè)定[J].食 品科學(xué)，2011，32（8）：244-247.

[12]LIUXY，ZHOUF，WEN MC，et al.LC-MS and GC-MS based metabolomics analysis revealed the impact of tea trichomes on the chemicalandflavor characteristics of white tea[J].Food Research International，2024，191：114740.

[13]LONG P P，SU SX，WEN MC，et al.An insight into trichomesdeficiencyandtrichomes-richblack teasbycomparativemetabolomics：the impact of oxidized trichomes on metabolic profiles and infusion color[J].FoodResearch International，2024，190：114638.

[14]LYU ZY，LIJX，QIU S，et al.The transcription factors TLR1 and TLR2 negatively regulate trichome density and artemisinin levels inArtemisia annua[J].Journal of Integrative Plant Biology， 2022，64（6） ：1212-1228.

[15]DONG B R， XU Z H， WANG X X， et al. TrichomeLess regulator 3 isrequired for trichome initial and cuticle biosynthesis in Artemisia annua[J].Molecular Horticulture， 2024，4（1）：10

[16]LIU Y J，HOUH， JIANG X L，et al.A WD40 repeat protein from Camellia sinensis regulates anthocyanin and proanthocyanidin accumulation through the formation of MYB-bHLH-WD4O ternary complexes[J].International Journal of Molecular Sciences，2018，19 （6） ：1686.

[17]SUN B M，ZHU Z S，LIU R J，et al. TRANSPARENT TESTA GLABRA1（TTG1）regulates leaf trichome density in tea Camellia sinensis[J].Nordic Journal of Botany，2020，38（1） 38.

[18]LIPH，F(xiàn)UJM，XUYJ，etal.CsMYB1 integrates the regulation of trichome development and catechins biosynthesis in tea plant domestication[J].New Phytologist，2022，234（3）：902-917.

[19］劉任堅(jiān)，王玉源，劉少群，等.茶樹(shù)CsbHLH024和CsbHLH133 轉(zhuǎn)錄因子功能鑒定[J].茶葉科學(xué)，2022，42（3）：347-357.

[20]LIU XE.A more accurate relationship between‘effective number of condons’and GC3s under assumptions of no selection[J]. Computational Biology and Chemistry，2013，42：35-39.

[21]SUEOKA N.Near homogeneityof PR2-bias fingerprints in the human genome and their implications in phylogenetic analyses[J]. Journal of Molecular Evolution，2001，53（4/5）：469-476.

[22] WRIGHT F. The‘effective number of condons’used in a gene [J].Gene，1990，87（1） ：23-29.

[23］楊國(guó)鋒，蘇昆龍，趙怡然，等.蒺藜苜蓿葉綠體密碼子偏好性分 析［J」.早業(yè)字報(bào)，2015，24（12）：1/1-1/9.

[24］胡莎莎，羅洪，吳琦，等.苦蕎葉綠體基因組密碼子偏愛(ài)性 分析[J].分子植物育種，2016，14（2）：309-317.

[25］時(shí)慧，王玉，楊路成，等.茶樹(shù)抗寒調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子ICE1密 碼子偏性分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2012，39（7）：1341-1352.

[26］趙洋，劉振，楊培迪，等.密碼子偏性分析方法及茶樹(shù)中密 碼子偏性研究進(jìn)展[J].茶葉通訊，2016，43（2）：3-7.

[27] SHARP P M， LI W H. The condon adaptation index：a measure of directional synonymous condon usage bias，and its potential applications[J]. Nucleic Acids Research，1987，15（3）：1281-1295.

[28]DURET L. tRNA gene number and condon usage in the c . elegans genome are co-adapted for optimal translation of highly expressed genes[J]. Trends in Genetics，2000，16（7）：287-289.

［29］張文娟.基于密碼子水平的生物信息學(xué)分析及進(jìn)化研究［D]. 上海：復(fù)旦大學(xué)，2006.

[30］嚴(yán)子成，蔣瑞平，梁浩偉，等.川芎咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因 密碼子偏好性與進(jìn)化分析[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2020，26 （4） ：894-901.

[31］巫偉峰，陳明杰，陳發(fā)興.‘皇冠李'蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ALMT4、 ALMT9 和tDT密碼子偏好性分析［J]．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2020，28（1） ：42-57.

[32]BULMER M. The selection-mutation-drift theory of synonymous codon usage[J].Genetics，1991，129（3）：897-907.

[33］趙洋，楊陽(yáng)，劉振，等.茶樹(shù)密碼子用法分析[J].茶葉科 學(xué)，2011，31（4） ：319-325.

[34]MUKHOPADHYAY P， BASAK S， GHOSH T C. Differential selective constraints shaping codon usage pattern of housekeeping and tissue-specific homologous genes of rice and Arabidopsis[J]. DNAResearch，2008，15（6） ：347-356.

[35]ROMERO H， ZAVALAA，MUSTO H. Codon usage in Chlamydia trachomatis is the result of strand-specific mutational biases anda complex pattern of selective forces[J]. Nucleic Acids Research， 2000，28（10）：2084-2090.

[36]GU WJ，ZHOU T，MAJM，et al. The relationship between synonymous codon usage and protein structure in Escherichia coli and Homo sapiens[J]. Biosystems，2004，73（2）：89-97.

[37］譚淳月，劉勇，賴章鳳，等.茶樹(shù)氧甲基轉(zhuǎn)移酶基因密碼子偏 好性分析[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2023，45（3）：652-662.

[38]PANLL，WANGY，HUJH，etal. Analysis of codon use features of stearoyl-acyl carrier protein desaturase gene in Camelia sinensis[J]. Journal of Theoretical Biology，2013，334：80-86.

[39]LI C，PANLL，WANGY，et al. Codon bias of the gene for chloroplast glycerol-3-phosphateacyltransferase in Camellia sinensis （L.）O.Kuntze[J].Biochemical Systematics and Ecology，2014， 55：212-218.

[40］周子維，常笑君，游芳寧，等.茶樹(shù)脂肪氧合酶（LOX）基因家族 成員的分子進(jìn)化及密碼子偏好性分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo) 報(bào)，2017，19（12）：43-51.

[41］王占軍，吳子琦，王朝霞，等.3個(gè)茶樹(shù)品種WOX基因家族的進(jìn) 化及密碼子偏好性比較［J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué) 版），2022，46（2）：71-80.

[42]YOUE，WANGY，DINGZT，etal.Codonusagebiasanalysis forthe spermidine synthase gene from Camellia sinensis（L.）O. Kuntze[J].GeneticsandMolecularResearch，2O15，14（3）：7368- 7376.

[43]胡振民，萬(wàn)青，李歡，等.茶樹(shù)CsNRT1.1基因密碼子使用 特性分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，35（4）：896-903.

[44]趙洋，劉振，楊培迪，等.茶樹(shù)CsActin1基因密碼子偏性分 析[J].茶葉通訊，2014，41（4）：13-17.

[45]郭秀麗，王玉，楊路成，等.茶樹(shù)CBF1基因密碼子使用特性 分析[J].遺傳，2012，34（12）：1614-1623.

[46］原曉龍，郝佳波，王毅，等.鐵核桃葉綠體基因組密碼子偏好 性分析[J].分子植物育種，2020，18（20）：6671-6677.

[47］陳何，王曉，王樂(lè)，等.莧菜AtrNiR基因密碼子偏好性與 進(jìn)化分析[J].亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2021，17（1）：48-56.

[48］佟巖，黃薈，王雨華.森林茶園古茶樹(shù)大理茶葉綠體基因 組密碼子偏好性及系統(tǒng)發(fā)育研究[J].茶葉科學(xué)，2023，43（3）： 297-309.

[49］高燦，樊智豐，馬長(zhǎng)樂(lè).黃藥大頭茶葉綠體基因組密碼子偏 好性分析[J].西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），2023，43（5）： 66-76.

[50］馮琛，張?jiān)奇茫ゆ?，?黑莓RuTT12-1基因密碼子偏好 性分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2016，35（8）：2133-2144.

[51]CHRISTIANSON M L. Codon usage paterns distort phylogenies fromor ofDNA sequences[J].AmericanJournal of Botany，2005， 92（8）：1221-1233.

[52]ZHOUH，WANGH，HUANGLF，et al.Heterogeneity incodon usages of sobemovirusgenes[J].Archives ofVirology，2O05，150 （8）：1591-1605.

（責(zé)任編輯：陳海霞）