木薯異淀粉酶MeISA2的互作蛋白篩選

摘""要：異淀粉酶（isoamylase，ISA）催化α-1，6連接鍵水解，影響淀粉的分支結構，促進結晶化和顆粒形成。為了挖掘協同MeISA2影響木薯淀粉積累的新蛋白，本研究利用酵母雙雜交篩選MeISA2的互作蛋白。本研究構建了pGBKT7-MeISA2誘餌蛋白載體，證明MeISA2不具有自激活活性，且對酵母細胞無毒害作用。通過酵母雙雜交篩選cDNA文庫，共獲得7個候選互作蛋白。通過點對點酵母雙雜交回轉驗證實驗，驗證了MeISA2與MePsbO1存在互作關系。MePsbO1屬于光系統(tǒng)II產氧增強蛋白（photosystem"II"oxygen-evolving"enhancer"protein，PsbO），該類蛋白可促進光合作用電子傳遞過程的高效運行。生物信息學分析發(fā)現，MePsbO1與同屬大戟科的橡膠樹HbPsbO1的親緣關系最近，相似性達到90.12%，而與擬南芥AtPsbO1的相似性僅為77.71%。預測MePsbO1定位于葉綠體，且MePsbO1基因主要在葉片中表達。植物ISA參與葉片臨時性淀粉的合成，因此推測MePsbO1和MeISA2可能通過互作協同調控光合作用速率以及葉片臨時性淀粉的積累。本研究結果為MeISA2基因參與木薯源器官的光合產物積累和分配機制研究提供新線索。

關鍵詞：木薯；MeISA2；酵母雙雜交；MePsbO1中圖分類號：S533"""""""文獻標志碼：A

Screening"of"Interacting"Proteins"of"Cassava"Isoamylase"MeISA2

GE"Yujian1，2，3，"FU"Dongqing1，2，3，"WANG"Xiangwen1，2，3，"SHEN"Chen2，3，4，"LI"Yuheng1，2，"YAO"Yuan2，3，"GENG"Mengting1，"LU"Xiaohua2，3*，"WANG"Yajie2，3*

1."School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Haikou，"Hainan"570228，"China;"2."Institute"of"Tropical"Bioscience"and"Biotechnology，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Biology"and"Genetic"Resources"of"Tropical"Crops，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs"/"Hainan"Institute"for"Tropical"Agricultural"Resources"/"Key"Laboratory"for"Biology"and"Genetic"Resources"of"Tropical"Crops"of"Hainan"Province，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"3."Sanya"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Sanya，"Hainan"572000，"China;"4."College"of"Plant"Science"and"Technology，"Huazhong"Agricultural"University，"Wuhan，"Hubei"430070，"China

Abstract："Isoamylase"（Isoamylase，"ISA）"catalyzes"the"hydrolysis"of"α-1，6"linkages，"thereby"affecting"the"branching"structure"of"starch"and"promoting"crystallization"and"granule"formation."The"study"utilized"yeast"two-hybrid"screening"to"identify"proteins"interacting"with"MeISA2"to"explore"new"proteins"that"may"interact"with"MeISA2"to"influence"cassava"starch"accumulation."A"bait"protein"vector"pGBKT7-MeISA2"was"constructed，"and"it"was"demonstrated"that"MeISA2"did"not"possess"autoactivation"activity"and"was"non-toxic"to"yeast"cells."Through"yeast"two-hybrid"screening"of"a"cDNA"library，"a"total"of"7"candidate"interacting"proteins"were"obtained."Point-to-point"yeast"two-hybrid"re-validation"experiments"confirmed"the"interaction"between"MeISA2"and"MePsbO1."MePsbO1"belongs"to"the"Photosystem"II"oxygen-evolving"enhancer"protein"（PsbO）"family，"which"facilitates"the"efficient"operation"of"the"photosynthetic"electron"transfer"process."Bioinformatics"analysis"revealed"that"MePsbO1"had"the"closest"phylogenetic"relationship"with"HbPsbO1"from"Hevea"brasiliensis，"a"member"of"the"Euphorbiaceae"family，"with"a"similarity"of"90.12%，"while"its"similarity"to"Arabidopsis"thaliana"AtPsbO1"was"only"77.71%."It"is"predicted"that"MePsbO1"is"localized"in"the"chloroplast，"and"the"MePsbO1"gene"is"predominantly"expressed"in"leaves."Plant"ISA"is"involved"in"the"synthesis"of"transient"leaf"starch，"thus"it"is"hypothesized"that"MePsbO1"and"MeISA2"may"interact"to"jointly"regulate"the"rate"of"photosynthesis"and"the"accumulation"of"transient"leaf"starch."The"results"study"would"provide"new"insights"into"the"mechanism"by"which"the"MeISA2"gene"participates"in"the"accumulation"and"distribution"of"photosynthetic"products"in"cassava"source"organs.

Keywords："cassava;"MeISA2;"yeast"two-hybrid;"MePsbO1

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.06.005

木薯（Manihot"esculenta"Crantz）是大戟科雙子葉植物，廣泛種植于非洲、美洲、亞洲等熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。木薯的主要營養(yǎng)器官是塊根，淀粉是塊根的主要成分，同時也是木薯生長發(fā)育主要的營養(yǎng)來源[2]。木薯有耐貧瘠、抗旱和高產等種植特性，其塊根中的淀粉是理想的工業(yè)原料，且是全球10億人口的主要糧食作物[3]。木薯淀粉常用作增稠劑、穩(wěn)定劑和凝膠劑，適用于糕點、面包和無麩質食品。紡織與造紙工業(yè)中，木薯淀粉用于提高纖維的強度和抗磨損能力，改進紙張的表面光滑度和強度。

淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，木薯塊根中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量比例對木薯淀粉的品質和食用口感具有重要影響[4]。淀粉脫支酶（debranching"enzyme，DBE）、可溶性淀粉合成酶（starch"synthases，SS）和淀粉分支酶（starch-"branching"enzymes，SBE）對支鏈淀粉的合成具有催化作用[5]?？扇苄缘矸酆铣擅钢饕煽扇苄缘矸酆铣擅涪瘢⊿SⅠ）、可溶性淀粉合成酶Ⅱ（SSⅡ-1、SSⅡ-2）、可溶性淀粉合成酶Ⅲ（SSⅢ-1、SSⅢ-2）、可溶性淀粉合成酶Ⅳ（SSⅣ）和可溶性淀粉合成酶Ⅴ（SSⅤ）組成，在生物淀粉合成中的支鏈淀粉合成中發(fā)揮關鍵作用，SS活性影響淀粉顆粒形態(tài)、結構和理化特性；淀粉分支酶具有SBEⅠ、SBEⅡ和SBEⅢ三種類型，在淀粉生物合成中催化外部和內部的α-1，6鍵轉化成α-1，4-線性葡聚糖，也是唯一作用于葡聚糖并通過α-1，6-糖苷鍵連接產生分支的酶[6]。淀粉脫支酶包括異淀粉酶（isoamylase，ISA）和普魯蘭酶（pullulanase），ISA在植物淀粉結構的合成和數量上具有重要的作用，影響木薯支鏈淀粉和直鏈淀粉的比例[7]。

ISA專門催化支鏈淀粉、β-極限糊精和糖原中α-1，6連接鍵的水解，但無法水解普魯蘭[8]。植物有3種異淀粉酶亞型（ISA1、ISA2和ISA3），其中ISA1和ISA2在植物淀粉合成中具有重要影響。目前，在水稻、大麥、馬鈴薯、玉米作物中均被證明當ISA基因缺失時，均會影響其淀粉顆粒的形成[9-11]。ISA1和ISA2負責去除支鏈淀粉合成中產生的支鏈，而ISA3則專門降解支鏈淀粉中的支鏈α-葡聚糖[12]。ISA1既能與自身形成同源復合物，又能與ISA2結合形成異源復合物，在異源復合物中ISA1起催化作用，ISA2由于其活性位點失去了所有3個催化殘基而成為非催化蛋白，發(fā)揮調節(jié)作用[13]。異淀粉酶處理木薯淀粉，可水解淀粉中的1，6-α-D-糖苷鍵，降解支鏈淀粉并釋放線性短鏈糖，這導致直鏈淀粉比率提高，同時生成更多的還原糖[14]。PANPETCH等[15]克隆了KU50木薯品種的MeISA1和MeISA2基因，原核表達其重組蛋白，證明MeISA1和MeISA2蛋白同時存在時才能具有出脫分支酶活性，并分析了其酶學特性。本研究克隆了我國木薯主栽品種SC8的MeISA2基因，通過酵母雙雜交實驗篩選MeISA2的互作蛋白，以期為深入探討MeISA2在淀粉合成過程中的功能提供新的信息。

1""材料與方法

1.1""材料

植物材料為華南8號木薯（SC8）。酵母感受態(tài)AH109和大腸感受態(tài)DH5α均購自上海唯地生物技術有限公司；RNA反轉錄試劑盒"（MonSCRIPTTM"RTⅢ"All-in-One-Mix"With"dsDNase）和qRT-PCR試劑盒（ChemoHS"qPCR"Mix）購自武漢莫納公司；酵母雙雜交載體pGADT7、pGADT7-T、pGBKT7、pGBKT7-p53均由本實驗室保存。；Prime STAR"HS（Premix）DNA"PolyMeras酶購自TaKaRa公司；質粒提取試劑盒和純化試劑盒購自OMEGA生物試劑公司；RNA提取試劑盒購自北京聚合美生物科技有限公司；X-α-gal酵母顯色底物購自北京索萊寶科技有限公司；酵母缺陷培養(yǎng)基和2×Rapid"Tap"MasterMix酶分別購自clontech公司和南京諾唯贊生物科技股份有限公司；限制性核酸內切酶EcoRⅠ、BamHⅠ購自賽默飛世爾科技公司。

1.2""方法

1.2.1""誘餌載體pGBKT7-MeISA2構建及檢測""根據木薯基因組數據庫信息，設計MeISA2基因克隆引物（表1），以SC8木薯cDNA模板進行PCR擴增，通過1%凝膠電泳檢測PCR擴增產物，純化備用。將純化的MeISA2片段與酶切純化pGBKT7空載體（酶切位點EcoR"Ⅰ和BamH"Ⅰ）進行同源重組。將同源重組產物轉化到DH5α大腸桿菌中，利用pGBKT7通用檢測引物（表1）進行菌液PCR鑒定，篩選陽性菌液進行Sanger測序，提取測序結果比對正確的菌液中的重組質粒，于–20"℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2""pGBKT7-MeISA2誘餌蛋白的毒性檢測""將pGBKT7空載和pGBKT7-MeISA2重組質粒分別轉化到AH109酵母感受態(tài)，涂布于SD/-Trp固體培養(yǎng)基上，30"℃倒置培養(yǎng)2～3"d。挑取菌斑至含有2×Rapid"Master"Mix的PCR管中，使用BD檢測引物進行菌斑PCR鑒定，篩選酵母陽性菌株。將篩選出的陽性pGBKT7空載酵母菌株和pGBKT7-MeISA2酵母菌株分別接種到SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30"℃培養(yǎng)至OD600=0.6。將酵母菌液按照1∶1、1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10"000稀釋后，分別吸取5"μL點板于SD/-Trp固體培養(yǎng)基上，30"℃倒置培養(yǎng)2～"3"d，觀察菌落生長情況。

1.2.3""pGBKT7-MeISA2誘餌蛋白的自激活檢驗""將pGADT7空載和pGBKT7-MeISA2重組質粒共轉到AH109酵母感受中，均勻涂布于SD/-Trp-Leu固體培養(yǎng)基上，30"℃培養(yǎng)2～3"d，挑取單菌落分別使用AD檢測-F/R、BD檢測-F/R進行PCR檢測，篩選陽性菌株。將篩選的陽性菌株接種到SD/-Trp-Leu液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，分別吸取菌液5"μL點到SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-Ade、SD/-Trp-Leu-His-Ade+X-α-gal固體培養(yǎng)基上，將本實驗室保存的pGBKT7-p53+pGADT7-T（陽性對照）和pGBKT7-lam+pGADT7-T（陰性對照）點板在上述固體培養(yǎng)基上，30"℃培養(yǎng)2～3"d，觀察酵母菌落生長情況。

1.2.4""MeISA2互作蛋白篩選""將30"μg"SC8木薯cDNA文庫質粒與pGBKT7-MeISA2重組質粒共轉到AH109酵母感受態(tài)，并涂布于SD/-Trp-Leu-"His固體培養(yǎng)基，30"℃倒置培養(yǎng)2～3"d。挑取酵母菌斑在20"μL"0.9%"NaCl溶液中吸打混勻，吸取5"μL點板于SD/-Trp-Leu-His-Ade+X-α-gal培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)2～3"d，觀察酵母菌斑生長情況。挑取培養(yǎng)基上變藍的菌斑，使用AD檢測-F/R進行PCR檢測，Sanger測序，獲得候選互作蛋白信息。

1.2.5""候選互作蛋白的酵母雙雜交回轉驗證""根據候選互作蛋白信息搜索木薯基因庫數據，獲得候選蛋白的CDS序列。設計帶有同源重組接頭的特異性引物（表1），以SC8木薯cDNA為模板擴增候選蛋白基因編碼區(qū)。通過同源重組技術將候選互作蛋白克隆到pGADT7空載載體上。將pGBKT7-MeISA2誘餌蛋白載體與含有候選蛋白基因的pGADT7載體分別共轉到AH109酵母感受態(tài)，并點板到SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-"Ade、SD/-Trp-Leu-His-Ade+X-α-gal固體培養(yǎng)基上，30"℃倒置培養(yǎng)2～3"d，觀察酵母生長情況。

1.2.6""MePsbO1基因在木薯各組織的表達分析""利用本實驗室已經完成的SC8木薯的體胚、愈傷、韌皮部、木質部、須根、莖、嫩葉、成熟葉的轉錄組信息分析互作蛋白基因在木薯各組織或器官的表達情況。

2""結果與分析

2.1""pGBKT7-MeISA2誘餌蛋白載體的構建

以SC8木薯的cDNA為模板，PCR擴增MeISA2基因的CDS區(qū)，凝膠電泳檢測顯示獲得約2600"bp的條帶，且條帶明亮單一（圖1），符合預期的MeISA2基因長度（2652"bp）。純化PCR產物，通過同源重組技術將MeISA2基因克隆到pGBKT7載體上。PCR篩選陽性菌落，測序，提取序列比對正確的pGBKT7-MeISA2誘餌載體質粒備用。

2.2""MeISA2誘餌蛋白的毒性檢測

將構建成功的pGBKT7-MeISA2誘餌載體與pGBKT7空載分別轉到AH109酵母感受態(tài)中，PCR鑒定陽性菌株。梯度稀釋后點板于SD/-Trp固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。結果顯示，含有pGBKT7-"MeISA2和pGBKT7的酵母菌株生長情況類似（圖2），表明pGBKT7-MeISA2表達蛋白不具有毒性，酵母菌株能正常生長。

2.3""MeISA2誘餌蛋白的自激活檢測

為了驗證誘餌蛋白MeISA2是否具有自激活能力，將pGBKT7-MeISA2誘餌載體與pGADT7空載共轉AH109酵母菌株進行自激活檢測。結果如圖3所示，pGBKT7-p53+pGADT7-T（陽性對照）和pGBKT7-lam+pGADT7-T（陰性對照）酵母菌株和陽性菌株均能在SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上正常生長；而在SD/-Trp-Leu-His-Ade、SD/-Trp-"Leu-His-Ade+X-α-gal培養(yǎng)基上只有陽性對照酵母菌株能正常生長，且在SD/-Trp-Leu-His-Ade+"X-α-gal培養(yǎng)基上變藍；含有pGBKT7-MeISA2質粒的菌株和陰性對照菌株均不能生長（圖3）。此結果表明MeISA2誘餌蛋白無自激活能力。

2.4""MeISA2互作蛋白篩選

使用實驗室保存的SC8"cDNA文庫質粒篩選MeISA2的互作蛋白，在SD/-Trp-Leu-His-Ade+"X-α-gal培養(yǎng)基上共獲得7個變藍的酵母菌斑，表明7個變藍的酵母菌斑所表達的蛋白可能與MeISA2蛋白存在互作關系。對變藍菌斑進行PCR檢測并進行Sanger測序，通過NCBI網站序列比對共獲得7個候選蛋白信息（表2）。

2.5""MeISA2與候選蛋白點對點驗證

為進一步驗證候選蛋白是否與MeISA2蛋白存在互作關系，將上述7個含有候選蛋白基因的pGADT7載體分別與pGBKT7-MeISA2誘餌載體共轉到AH109酵母菌株。將酵母菌株點到SD/-"Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-Ade、SD/-Trp-Leu-His-"Ade+X-α-gal固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。結果顯示，所有酵母菌株均能在SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上正常生長，而含pGBKT7-MeISA2誘餌載體、pGADT7-MePsbO1載體的酵母菌和pGBKT7-p53+pGADT7-T（陽性對照）在SD/-Trp-Leu-His-Ade、SD/-Trp-Leu-His-"Ade+X-α-gal固體培養(yǎng)基上均能正常生長，且在SD/-Trp-Leu-His-Ade+X-α-gal固體培養(yǎng)基上變藍（圖4）。此結果表明MePsbO1與MeISA2存在互作關系。

2.6""MePsbO1基因的生物信息學分析

生物信息學分析結果顯示，MePsbO1基因開放閱讀框長度為1005"bp，由2個外顯子和1個內含子組成（圖5），編碼334個氨基酸殘基，分子質量為35"397.84"Da。其中，亮氨酸丙氨酸（Ala）和蘇氨酸（Thr）的數量最多，均為33個氨基酸，"占總量的9.3%；色氨酸（Trp）的含量最低，只有1個，僅占0.3%。有38個帶負電荷的Asp和Glu殘基，以及36個帶正電荷的Arg和Lys殘基，理論等電點（pI）為5.57，表明MePsbO1是一種酸性蛋白。亞細胞定位預測MePsbO1定位于葉綠體。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現，MePsbO1與橡膠樹的HbPsbO1親緣關系最近，與擬南芥AtPsbO1的親緣關系最遠（圖6）。蛋白的多序列結果比對顯示，MePsbO1和HbPsbO1的相似性為90.12%，與AtPsbO1的相似性僅為77.71%（圖7）。

2.7""MePsbO1基因在木薯組織器官的表達分析

分析SC8木薯品種各組織器官轉錄組數據，探究MePsbO1基因表達的模式，結果發(fā)現MePsbO1基因在木薯嫩葉中的表達量最高，其次是成熟葉，在莖中也具有較高的表達量，但是在體胚、愈傷、塊根韌皮部、塊根木質部、須根中的表達量極低（圖8）。此表達模式符合植物PsbO1基因參與葉片光合作用的功能特征。

3""討論

異淀粉酶參與淀粉顆粒的形成和降解[16]。在馬鈴薯的研究中發(fā)現，ISA1和ISA2結合形成異二聚酶參與淀粉的合成[17]。ISA1和ISA2除了能結合形成異多聚體，ISA1還能形成有活性的同源多聚酶復合物[13]，ISA2則是非催化亞基，多種植物證明ISA2蛋白活性位點有氨基酸的替換[11]。研究發(fā)現ISA3與ISA1、ISA2形成的多聚體未存在密切關聯，認為ISA3是以單體或與其他蛋白結合發(fā)揮作用[17]。與野生型相比，擬南芥AtISA1、AtISA2和雙突變體淀粉含量的積累減少，但可溶性葡萄糖增加[18]。單子葉植物玉米中發(fā)現在ISA1和ISA2突變體中，ISA1突變導致支鏈淀粉的合成產生了顯著變化，而在ISA2突變體對支鏈淀粉的合成影響不大[19]。由此推測ISA1和ISA2是雙子葉植物中ISA活性所需要的，但在單子植物中，ISA2不是ISA活性所必需的。

植物光系統(tǒng)II（PSII）的外周蛋白是與PSII膜內核心復合體相連的蛋白質，主要位于類囊體腔的一側，在氧氣進化復合物（oxygen"evolving"complex，"OEC）的功能和PSII的穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用，主要的外周蛋白包括PsbO、PsbP、PsbQ，其中PsbO是33"kDa錳穩(wěn)定蛋白（manganese-"stabilizing"protein，"MSP），是PSII中最主要的外周蛋白[20]。PsbO在光系統(tǒng)Ⅱ捕捉并利用光能將水分子分解成氧氣、質子和電子的過程中起輔助和強化作用，促進光合作用電子傳遞過程的高效運行[21]。PsbO還具有多種輔助功能，包括鈣結合、錳穩(wěn)定結合，以及與GTP結合相關的PSII反應中心D1亞基的GTP依賴性降解，PsbO可結合GTP，并催化GTP水解[22]。擬南芥存在2種PsbO蛋白：AtPsbO1和AtPsbO2[23]。AtPsbO1缺失突變體（psbo1）的光系統(tǒng)Ⅱ功能受損，表現為生長遲緩、葉片淺綠、對光失活更敏感以及D1蛋白周轉速率加快[24]。

本研究通過酵母雙雜交篩選獲得MeISA2的互作蛋白MePsbO1，該蛋白與同屬大戟科的橡膠樹HbPsbO1的親緣關系最近，相似性達到90.12%，而與擬南芥AtPsbO1的相似性僅為77.71%。預測MePsbO1定位于葉綠體，且MePsbO1基因主要在葉片中表達，推測該基因在木薯光合作用中具有重要作用。葉綠體是臨時性淀粉合成的主要場所，光合作用固定的碳水化合物可以淀粉的形式貯存在葉綠體中[25]。ISA在植物葉片臨時性淀粉的合成中起到關鍵作用，通過調節(jié)淀粉的分支結構，促進結晶化和顆粒形成[26]。因此推測，MePsbO和MeISA2可能通過互作協同調控光合作用速率以及葉片臨時性淀粉的積累，影響木薯源器官的光合產物積累和分配。本課題組在后續(xù)研究中將通過雙分子熒光互補實驗、熒光素酶互補實驗進一步研究MePsbO1和MeISA2的互作機理，采用過表達和基因編輯明確它們在木薯臨時性淀粉合成過程的關系及作用。

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