急性低氧脅迫下中華絨螯蟹表皮基因表達(dá)譜分析

Abstract：To investigatethegeneexpressionresponse inthecuticleofEriocheirsinensis duringthepost-moltstage underacutehypoxia stress，thisstudyutilizedIlluminasecond-generationsequencing technologytodetectthegneexpression profilesbetweenthecontrolandtheacutehypoxiastresstreatment，namely（1.O±O.1）mg/Lfor1h.Theresultsshowedthat comparedwiththecontrol，atotalof691diferentialexpressedgeneswereidentifiedintheacutehypoxiastresstreatment. These diferentiallyexpressd genes were mainlyenriched in physiological activities such as cuticle structural components，

收稿日期：2024-08-30

基金項(xiàng)目：省種業(yè)振興“揭榜掛帥\"項(xiàng)目［JBGS（2021）031、JBGS（2021）125]；“十四五”國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022YFD2400700）；省碳達(dá)峰碳中和科技創(chuàng)新專項(xiàng)資金項(xiàng)目（SBE2022350035）；海洋大學(xué)研究生科研與實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（KYCX2023-103）

作者簡介：張婷（1999-），女，山西大同人，碩士研究生，主要從事甲殼動(dòng)物養(yǎng)殖研究。（E-mail） bravetingO4@163.com

chitin binding，and metabolic pathways such as nitrogen metabolism，glyceride metabolism，and glycolysis pathway. Ninesignificantly differentiallyexpressed geneswere screenedand verifiedbyreal-timefluorescencequantitative PCR.The results of this study preliminarily clarify the molecular response mechanism of cuticle in E .sinensis at the post-molt stage to acute hypoxia stress，laying the foundationfor further investigation into the effects of hypoxia stress onthemoltingandgrowthof E .sinensis.

Key words：Eriocheir sinensis；acute hypoxia stress；post-molt stage；cuticle genes；transcriptome analysis

中華絨蟹（Eriocheirsinensis）又稱河蟹，隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、十足目，廣泛分布于中國東南部沿海的咸淡水與淡水水域，是中國重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖蟹類[1]。2023年全國中華絨螯蟹養(yǎng)殖面積約5.33×10⁵hm² ，產(chǎn)量達(dá) 8.886×10⁵t^[2] 。蛻殼貫穿中華絨螯蟹生活史，與其生長、發(fā)育密切相關(guān)[3]。蛻殼周期包括蛻殼前期、蛻殼期、蛻殼后期（包括I、Ⅱ兩個(gè)階段）和蛻殼間期，其中蛻殼后期第1階段中華絨螯蟹的新表皮柔軟，吸水后能夠迅速延展擴(kuò)張，從而實(shí)現(xiàn)跨越式增長，但與此同時(shí)，此期中華絨螯蟹易受到低氧等不良環(huán)境的脅迫，導(dǎo)致其蛻殼生長率下降，蛻殼死亡率升高，因此蛻殼后期第I階段是決定中華絨螯蟹“生死存亡”的關(guān)鍵時(shí)期。

溶解氧是甲殼類動(dòng)物蛻殼生長的關(guān)鍵限制因子[4]。低氧脅迫會(huì)激活非特異性免疫，引起氧化應(yīng)激損傷，改變能量代謝分配，抑制蛻殼生長，甚至導(dǎo)致死亡。低氧脅迫可導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦（Penae-us vannamei）[5]、斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）、小長臂蝦（Palaemonetesvulgaris）[6]生長速率顯著降低，蛻殼次數(shù)減少，造成太平洋藍(lán)蟹（Callinectessapidus）[7]、佛羅里達(dá)石蟹（Menippe mercenaria）[8]和中華絨螯蟹等甲殼類動(dòng)物死亡率升高。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展，多組學(xué)分析已被廣泛應(yīng)用于甲殼類動(dòng)物應(yīng)對(duì)低氧脅迫的分子生物學(xué)機(jī)制研究。曹梅等9報(bào)道了低氧脅迫誘導(dǎo)脊尾白蝦產(chǎn)生低氧誘導(dǎo)因子調(diào)控下游基因表達(dá)，促進(jìn)厭氧代謝，緩解蝦體對(duì)缺氧的不適，而低氧誘導(dǎo)因子可通過抑制線粒體生物合成和活化線粒體自噬系統(tǒng)來降低線粒體耗氧;Jiang等[o]發(fā)現(xiàn)低氧脅迫損害中華絨螯蟹腸組織結(jié)構(gòu)，減少了腸道上皮杯狀細(xì)胞的數(shù)量，降低了腸道微生物區(qū)系的多樣性和相對(duì)豐度。此外，低氧脅迫誘導(dǎo)中華絨螯蟹胸神經(jīng)節(jié)神經(jīng)組織中游離谷氨酸和 γ -氨基丁酸（GABA）含量升高[\"]，破壞血淋巴細(xì)胞的酚氧化酶免疫系統(tǒng)，引起血淋巴細(xì)胞壞死，加速病原菌的感染，導(dǎo)致中華絨螯蟹死亡速度加快[12]。然而，關(guān)于急性低氧對(duì)中華絨螯蟹蛻殼脅迫，尤其是蛻殼后期表皮組織的分子響應(yīng)機(jī)制的研究還很少。

本試驗(yàn)基于Ilumina第二代測序技術(shù)，對(duì)處于蛻殼后期的中華絨螯蟹低氧脅迫下的表皮組織轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，篩選低氧脅迫下中華絨螯蟹蛻殼后期表皮組織的相關(guān)差異表達(dá)基因，鑒定抵抗低氧脅迫的相關(guān)候選基因，討論中華絨螯蟹蛻殼期間響應(yīng)低氧脅迫的機(jī)制，為后續(xù)深入開展低氧脅迫對(duì)中華絨螯蟹蛻殼生長的影響奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)對(duì)象

中華絨螯蟹樣本采集于省淡水水產(chǎn)研究所揚(yáng)中基地，450只中華絨螯蟹規(guī)格均為（ 30.5±2.5） g，分別置于12個(gè)容量為 200L 的水族箱中曝氣暫養(yǎng) 7d 。水溫維持在 26°C 左右，水中溶解氧含量為（6.8±0.1）mg/L，pH 為 7.5±0.4 ，采用自然光源。期間用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料定時(shí)投喂，每天進(jìn)行換水吸污。

1.2 低氧脅迫處理

根據(jù)中華絨螯蟹殼色與硬度形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合甲殼類動(dòng)物分期方法[13]，判別和收集處于蛻殼前期的中華絨螯蟹，在此基礎(chǔ)上通過換水誘導(dǎo)其蛻殼，選取10只處于蛻殼后期第I階段的中華絨螯蟹，將試驗(yàn)樣品隨機(jī)分成2組：低氧處理（ n=5 覆蓋保鮮膜、通入氮?dú)馐怪腥A絨螯蟹處于水體溶解氧含量為（ ?1.0±0.1? ）mg/L的低氧環(huán)境 ¹h ；對(duì)照（ 通過電動(dòng)增氧機(jī)增氧，保持水體溶解氧的含量為（6.8±0.1）mg/L_? 。處理期間使用HQ40D型便攜多參數(shù)水質(zhì)分析儀（美國哈希公司產(chǎn)品）檢測水體溶解氧含量，配備電動(dòng)增氧機(jī)，從而有效保證水體中溶解氧含量，避免由于中華絨螯蟹本身的呼吸而造成的水體溶解氧不足。處理1h后隨機(jī)收集每組3只中華絨螯蟹頭胸甲表皮組織用于項(xiàng)目測定，液氮速凍 -80^°C 儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 總RNA的提取

應(yīng)用Trizol法提取中華絨蟹表皮總RNA，凝膠電泳后用安捷倫2100生物分析儀（美國安捷倫科技公司產(chǎn)品）測量總RNA的純度、質(zhì)量濃度和完整性，以總量 、質(zhì)量濃度 ?35ng/μL 、 為標(biāo)準(zhǔn)鑒定總RNA質(zhì)量，合格后用于建庫。

1.4轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)預(yù)處理與拼接

從中華絨螯蟹總RNA中分離并通過OligodT富集獲得mRNA，用于分析轉(zhuǎn)錄組信息。然后通過

Fragmentationbuffer和磁珠得到 300bp 左右的小片段。接著，使用逆轉(zhuǎn)錄酶及六堿基隨機(jī)引物進(jìn)行處理，得到穩(wěn)定雙鏈結(jié)構(gòu)后用EndRepairMix補(bǔ)成平末端，堿基A被添加到3'末端成為接頭。最后IIlu-mina平臺(tái)對(duì)中華絨螯蟹低氧組織cDNA文庫完成上機(jī)測序，使用Trinity（http：//trinityrnaseq.source-forge.net）對(duì)所有樣本清潔數(shù)據(jù)（Cleandata）進(jìn)行從頭組裝，并對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化評(píng)估。

1.5轉(zhuǎn)錄組注釋

通過BLAST軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄本在NCBI中的NR數(shù)據(jù)庫、Swissprot數(shù)據(jù)庫、GO數(shù)據(jù)庫、 EggNOG 數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行全面注釋。測序獲得的Unigenes的開放閱讀框（ORF）采用Trinity方法進(jìn)行預(yù)測。

1.6轉(zhuǎn)錄組中差異表達(dá)基因的篩選

為了篩選低氧脅迫下中華絨螯蟹蛻殼后期表皮中差異表達(dá)的基因，將兩組間發(fā)生差異表達(dá)的基因應(yīng)用DESeq2軟件（閾值為： |log₂FC∣?1 Padjustlt;0.05）進(jìn)行篩選（ FC ：差異倍數(shù)，Padjust：校正后的 P 值）。

1.7 qRT-PCR驗(yàn)證

從表1可知，對(duì)富集通路中9個(gè)顯著差異表達(dá)的基因（DEG）進(jìn)行定量分析以進(jìn)一步驗(yàn)證測序的準(zhǔn)確性，其中包括前3通路中6個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因：鈣相關(guān)表皮蛋白（CAP47、CAP8、CAP19、CAP21）基因和彈性蛋白多肽（RLP1、RLP2）基因；3個(gè)下調(diào)表達(dá)的基因：碳酸酐酶 基因和淀粉酶（amyA）基因。以 β -Actin為內(nèi)參基因所篩選的引物序列用于鑒定相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量，每組進(jìn)行3個(gè)重復(fù)（ Plt;0.05 ）。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組的測序和組裝

使用Illumina平臺(tái)對(duì)對(duì)照、低氧脅迫處理中華絨螯蟹蛻殼后期的表皮組織進(jìn)行高通量測序。篩選獲得96.78GbClean data，Q30 堿基百分比在91.92% 以上， G+C 含量為 50.74%～55.80% 。測序組裝后得到平均長度為！ 1828bp 的中華絨螯蟹相關(guān)基因95015個(gè)?；诮y(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，對(duì)基因進(jìn)行EggNOG功能分類統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖1所示。對(duì)這些經(jīng)過拼接的基因序列進(jìn)行GO、KEGG、EggNOG、NR、Swiss-Prot以及Pfam注釋，對(duì)應(yīng)得到15387個(gè)（ 25.06% ）、

11883個(gè)（ 19.35% ）、16833個(gè) （27.41% ）、19 973（ 32.53% ）、14903個(gè)（ 24.27% ）和16361個(gè)（ 26.64% ）注釋結(jié)果（圖2A）。根據(jù)NR數(shù)據(jù)庫的匹配結(jié)果可知，有 58.37% 的基因表現(xiàn)出與凡納濱對(duì)蝦基因類似，而中華絨螯蟹的基因表現(xiàn)出了 1.84% 的類似基因（圖2B）。

在本試驗(yàn)中，按照G0分類，共有57338個(gè)Uni-genes歸類到3個(gè)功能類別，共計(jì)49個(gè)功能集合（圖3A）。其中，細(xì)胞成分類別有15個(gè)、生物過程類別有21個(gè)、分子功能類別有13個(gè)。此外，共有18994個(gè)Unigenes與KEGG注釋相匹配，并且富集到新陳代謝、組織系統(tǒng)、細(xì)胞過程、人類疾病、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理這6大類生物學(xué)功能中，其中富集基因最多的通路分別是碳水化合物代謝（580個(gè)）、內(nèi)分泌系統(tǒng)（856個(gè)）運(yùn)輸和代謝（938個(gè)）、癌癥概述（1008個(gè)）、翻譯（1210個(gè)）以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（1480個(gè)）（圖3B）。

A：RNA 加工和修飾;B：染色體結(jié)構(gòu)和動(dòng)力;C：能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換;D：細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂和染色體分裂;E：氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝;F：核酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝;G：碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝;H：輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝;I：脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝;J：翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)與合成;K：轉(zhuǎn)錄;L：復(fù)制、合成、修復(fù)； M 細(xì)胞壁與細(xì)胞膜合成;N：細(xì)胞運(yùn)動(dòng);O：翻譯后修飾，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn);P：無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；Q：次要代謝物合成、代謝以及轉(zhuǎn)運(yùn);T：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；U：胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，分泌及小泡運(yùn)輸;V：防御機(jī)制；Y：核酸結(jié)構(gòu);Z：細(xì)胞骨架。

A：注釋到各數(shù)據(jù)庫的功能基因數(shù)目柱狀圖；B：與NR數(shù)據(jù)庫的物種類別的基因注釋匹配餅狀圖。數(shù)字與比例分別代表在NR數(shù)據(jù)庫中Uni-genes與不同物種之間相似基因的數(shù)量與占比。

2.2 差異基因的富集分析

通過以2.0倍（ Plt;0.05， 為閥值篩選低氧脅迫處理中華絨螯蟹蛻殼后期表皮中差異表達(dá)的基因，結(jié)果顯示，有691個(gè)差異表達(dá)基因，其中381個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，310個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（圖4）。在G0富集分析中可以發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的基因主要集中于角質(zhì)層結(jié)構(gòu)成分、細(xì)胞外區(qū)域、幾丁質(zhì)結(jié)合等生理活動(dòng)（圖5A）。在KEGG數(shù)據(jù)庫中富集主要體現(xiàn)在氮代謝、甘油酯代謝等代謝相關(guān)通路，以及胰腺分泌等組織系統(tǒng)通路（圖5B）。

紅藍(lán)點(diǎn)分別代表上調(diào)及下調(diào)表達(dá)基因，灰色點(diǎn)代表表達(dá)沒有變化的基因；橫坐標(biāo)代表對(duì)照差異表達(dá)基因的可視化程度，縱坐標(biāo)代表低氧處理差異表達(dá)基因的可視化程度（以 表示）。TPM：每百萬轉(zhuǎn)錄本。

2.3qRT-PCR驗(yàn)證分析

經(jīng)過qRT-PCR分析，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的9個(gè)基因表達(dá)存在顯著差異，并且這些基因的表達(dá)水平（包括上調(diào)和下調(diào)的趨勢）與RNA-Seq分析結(jié)果相吻合，如圖6所示。

3討論

甲殼類動(dòng)物具有堅(jiān)硬的外骨骼，能夠防御病原物侵襲和不利環(huán)境的危害，為機(jī)體提供保護(hù)和支撐，但硬化的外骨骼也限制了其生長，所以甲殼類動(dòng)物在生長發(fā)育期間普遍需要進(jìn)行周期性蛻殼并合成新表皮。蛻殼后期的新表皮吸水后能夠迅速延展擴(kuò)張，從而實(shí)現(xiàn)跨越式增長，但與此同時(shí)，失去外骨骼防護(hù)的機(jī)體也最容易受到環(huán)境脅迫。在中華絨螯蟹養(yǎng)殖過程中，水體溶解氧晝夜波動(dòng)大，空間分布不均，直接影響著中華絨蟹的規(guī)格與產(chǎn)量，但目前缺乏蛻殼后期中華絨螯蟹表皮組織應(yīng)對(duì)低氧脅迫分子機(jī)制的研究。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序分析中華絨蟹蛻殼后期表皮基因應(yīng)對(duì)低氧脅迫的表達(dá)響應(yīng)，共篩選出691個(gè)差異表達(dá)基因，涉及角質(zhì)層結(jié)構(gòu)成分、幾丁質(zhì)結(jié)合、氮代謝、甘油酯代謝、糖酵解途徑等。

蛻殼伴隨著新表皮的合成與硬化。表皮蛋白作為甲殼動(dòng)物表皮中重要的結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)，與幾丁質(zhì)螺旋堆疊相互作用，形成穩(wěn)定表皮的復(fù)雜結(jié)構(gòu)[14]在本研究中，低氧脅迫下中華絨螯蟹表皮蛋白彈性蛋白多肽（RLP）和鈣化相關(guān)肽（CAP）基因的表達(dá)顯著上調(diào)，這與Graham等[15]和Tang等[16]在虎斑猛水蚤（Tigriopuscalifornicus）及松墨天牛（Monocha-musalternatus）上的研究結(jié)果相一致。彈性蛋白多肽通過氨基酸雙酪氨酸和三酪氨酸的間隔共價(jià)交聯(lián)在一起，與幾丁質(zhì)形成具有高度靈活性和流動(dòng)性的復(fù)合物。在水生甲殼類動(dòng)物中，RLP主要分布于表皮軟組織和關(guān)節(jié)部位，通過與幾丁質(zhì)結(jié)合影響表皮形態(tài)，進(jìn)而影響滲透壓及溶解氧[17]；在陸生昆蟲中，RLP主要分布于氣管頂端細(xì)胞外基質(zhì)層，低氧脅迫引起彈性蛋白多肽表達(dá)顯著上調(diào)，氣管導(dǎo)管頂端細(xì)胞外基質(zhì)增厚，維持氣管形態(tài)結(jié)構(gòu)與氧氣供應(yīng)，敲除彈性蛋白肽基因，降低彈性蛋白多肽含量導(dǎo)致頂端細(xì)胞外基質(zhì)變薄，氣管彈性下降，造成供氧不足。CAP通過Ramp;R結(jié)構(gòu)域與幾丁質(zhì)相結(jié)合，多肽N端和C端區(qū)域延伸至纖維間隙，形成水填充的非共價(jià)鍵網(wǎng)絡(luò)，對(duì)保持表皮的柔韌性不可或缺[18]。高茜[9]研究發(fā)現(xiàn)，中華鋸齒米蝦CAP主要在蛻殼前期和蛻殼后期表達(dá)，敲除鈣相關(guān)表皮蛋白基因Nd-CAP-1后，會(huì)導(dǎo)致中華鋸齒米蝦蛻殼前期步足剛毛伸展不流暢，出現(xiàn)卷曲；敲除鈣相關(guān)表皮蛋白基因NdCAP-2后，蛻殼后期中華鋸齒米蝦步足表面凹凸不平，出現(xiàn)大面積的褶皺。本研究中急性低氧脅迫下中華絨螯蟹表皮蛋白R(shí)LP和CAP顯著上調(diào)，暗示低氧脅迫通過干預(yù)表皮蛋白R(shí)LP和CAP的合成進(jìn)而影響外骨骼的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

碳酸酐酶（ （CA） 催化二氧化碳（ CO₂ ）水合為碳酸氫鹽（ HCO₃^- ）和質(zhì)子（ H⁺ ）的反應(yīng)，在機(jī)體內(nèi)的生物礦化過程中起著關(guān)鍵作用。在缺氧環(huán)境下，細(xì)胞通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子HIF- 1α 增加碳酸酐酶產(chǎn)生，形成細(xì)胞微環(huán)境的酸性缺氧特征。Calhoun等[20]報(bào)道了蛻殼周期中藍(lán)蟹（Callinectessapidus）碳酸酐酶活性與表皮組織中的鈣、鎂含量呈顯著正相關(guān)，表明碳酸酐酶參與甲殼類動(dòng)物外骨骼的礦化。Ostrowski等[21]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，注射外源蛻殼激素能提高碳酸酐酶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響青蟹外骨骼礦化速度。本研究中低氧脅迫下中華絨螯蟹表皮碳酸酐酶CA2和CA13表達(dá)顯著下調(diào)，可能會(huì)抑制外骨骼礦化，導(dǎo)致蛻殼周期時(shí)間延長，這與戴恬美[22的研究結(jié)果一致。

低氧脅迫不僅會(huì)影響甲殼類動(dòng)物表皮角質(zhì)層形成與礦化，還會(huì)改變能量代謝途徑。在低氧脅迫下

A：差異表達(dá)基因的GO富集分析；B：差異表達(dá)基因的KEGG通路富集圖。

FC ：基因表達(dá)差異倍數(shù)。

甲殼類動(dòng)物的消化分解類活性受到抑制，有氧糖代謝趨于減弱，糖酵解和無氧糖代謝的相關(guān)通路代謝增強(qiáng)。無氧代謝能迅速提供能量，減少氧氣消耗，是對(duì)低氧脅迫下能量代謝的適應(yīng)。淀粉酶是水生動(dòng)物生長發(fā)育中不可缺少的水解酶[23]。石華洪等[24]研究發(fā)現(xiàn)，淀粉酶等消化酶類活性隨著溶解氧濃度降低而降低；Patkaew等[25]研究發(fā)現(xiàn)，過飽和溶解氧會(huì)增強(qiáng)凡納濱對(duì)蝦 α -淀粉酶的活性。本研究中的淀粉酶（amyA）基因表達(dá)下調(diào)，說明中華絨螯蟹從有氧糖代謝轉(zhuǎn)向糖酵解厭氧途徑以產(chǎn)生能量來臨時(shí)補(bǔ)充蛻殼所需的能量，表明中華絨螯蟹在低氧應(yīng)激反應(yīng)中調(diào)整了能量代謝。

4結(jié)論

本研究報(bào)道了急性低氧脅迫下蛻殼后期中華絨螯蟹表皮基因表達(dá)譜，并對(duì)基因富集重點(diǎn)通路和差異表達(dá)基因的功能進(jìn)行了分析，初步闡明在急性低氧脅迫下，中華絨螯蟹處于蛻殼后期的表皮應(yīng)對(duì)低氧脅迫的分子水平響應(yīng)機(jī)制。但由于缺乏長周期低氧脅迫與中華絨螯蟹蛻殼關(guān)系的認(rèn)識(shí)，后續(xù)將進(jìn)一步驗(yàn)證長期低氧脅迫對(duì)中華絨螯蟹蛻殼的影響，為中華絨螯蟹大規(guī)格養(yǎng)殖提供參考依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：黃克玲）