人造肉發(fā)色劑微膠囊化亞鐵血紅素肽的制備及在3D打印中的應(yīng)用

Abstract：Plant-basedartificial meat，as anovel meat analogue，has been widelyadopted inindustrial food production.However，due tothe absenceofanimal-derived heme，itfailstoreplicate thecharacteristiccolorofreal meat，making colorsimulationasignificantchallngeinthedevelopmentofartificialmeattechnologies.Toachieveplant-basedartificial meat with colorand texturecomparable toanimal meat，this studyfocusedonthechromogenic mechanismof heme proteins. We optimized the enzymatic hydrolysis method for extracting ferrous heme peptides，prepared structurallstable and colorefective microencapsulated ferrous hemepeptides，nd incorporated themasacoloring agent intoplant protein-based materials.Byapplying3Dprinting technology，weimprovedthetextureand mouthfeloftheartficial meat，achievingsatisfacto

收稿日期：2024-04-10

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2022YFD2100505）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（克氏原螯蝦）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系質(zhì)量安全與加工創(chuàng)新團隊項目[（JATS（2023）402]；省自然科學基金面上項目（BK20211141）

作者簡介：夏春月（1997-），女，山東莘縣人，碩士，研究方向為生物與醫(yī)藥。（E-mail）1571829917@qq.com

通訊作者：吳本剛，（E-mail）wubg@ujs.edu.cn;孫沖，（E-mail）sun-chong0106@163.com

rymeat-like coloration.The findings of this study provide novel insights for developing safeand efficient colorants for artificial meat，whilesimultaneouslyachievinghigh-value utilizationofchickenblood.

Keywords： artificial meat colorant；ferrous heme peptide；microencapsulation；3D printing technology

肉類含有優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和各種微量營養(yǎng)素（如鐵、鋅、煙酸、維生素 B₆ 等），是人類飲食中不可或缺的一部分[1]。中國統(tǒng)計年鑒2023年的數(shù)據(jù)顯示，自“十四五”規(guī)劃實施以來，中國牛肉、羊肉和豬肉的產(chǎn)量呈上升趨勢，2022年肉類產(chǎn)量約為 9.3×10⁷1 ，同比增加約 3.76%^[2] 。近年來，中國肉類產(chǎn)品供需缺口逐漸增大[3-5]，以畜牧養(yǎng)殖業(yè)和傳統(tǒng)肉類生產(chǎn)方法為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)畜牧業(yè)將面臨巨大挑戰(zhàn)。開發(fā)綠色環(huán)?？沙掷m(xù)的肉類替代品，滿足日益增長的肉類需求已經(jīng)成為全社會關(guān)注的熱點之一。人造肉由于在安全、營養(yǎng)、健康、環(huán)保等方面較傳統(tǒng)養(yǎng)殖類動物肉具有顯著優(yōu)勢[6]，作為肉類替代品，有望緩解養(yǎng)殖業(yè)造成的環(huán)境污染、食品安全和公共衛(wèi)生問題[7-8]

目前，人造肉制品主要有兩種生產(chǎn)途徑：一是動物干細胞體外增殖分化生產(chǎn)的細胞培養(yǎng)肉，由動物體分離得到全能干細胞或成肌細胞[8]，通過細胞黏附可食用性支架（微纖維明膠、膠原蛋白、酵母蛋白支架等）培養(yǎng)增殖得到肌肉纖維束[9]，再經(jīng)過對肌肉纖維束定型、修飾和烹飪加工，得到細胞培養(yǎng)肉制品；二是以植物蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的人造肉制品，常以大豆蛋白質(zhì)、豌豆蛋白質(zhì)、花生蛋白質(zhì)或小麥蛋白質(zhì)等植物基蛋白質(zhì)為原料[1]，加入淀粉、纖維素、油脂等混合[]，調(diào)配成肉類口感和風味后壓制成型，并經(jīng)過熟制加工而成[9，12]。由于細胞培養(yǎng)肉成本較高，大規(guī)模生產(chǎn)存在諸多挑戰(zhàn)[9]。而植物基人造肉則具有成本低、工藝簡單等優(yōu)勢，同時植物基人造肉可以減少飽和脂肪酸和膽固醇的攝入，避免因脂肪攝入過多而導(dǎo)致健康問題[13]，是人造肉領(lǐng)域關(guān)注的重點，已逐步開始商業(yè)化生產(chǎn)。

由于植物基人造肉與動物肉的顏色差距較大，發(fā)色劑的添加尤為重要[14]。相比人工合成著色劑（如胭脂紅、辣椒紅等），天然提取物尤其是富含血紅素的血紅素蛋白，在人造肉發(fā)色應(yīng)用中引起廣泛關(guān)注[15-16]。然而，血紅素蛋白穩(wěn)定性較差[17]，在加工、貯藏過程中易受溫度、 ??pH 、離子強度、酶等因素影響，導(dǎo)致血紅素蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，血紅素輔基暴露甚至脫落[18]。因此，肉色模擬是人造肉技術(shù)的一個難點。此外，由于植物蛋白質(zhì)與動物肌肉纖維蛋白質(zhì)形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不同[13，19]，使得其在口感和風味上與傳統(tǒng)肉類仍有較大差距[20]。如何模擬肉類纖維結(jié)構(gòu)是植物基人造肉另一個難點[5，21]。3D打印技術(shù)通過螺旋柱塞擠壓形成細絲纖維[22]，逐層堆積成完整的3D打印圖案和結(jié)構(gòu)，具有模擬肉類質(zhì)地結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢[7，23]。因此，本研究從血紅素蛋白發(fā)色機制出發(fā)，以雞血為原料制備了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、色澤良好的微膠囊化亞鐵血紅素肽，并作為人造肉發(fā)色劑添加進植物蛋白質(zhì)基礎(chǔ)材料中，利用3D打印技術(shù)開發(fā)出色澤穩(wěn)定、適口性好、滋味與雞胸肉糜相似的植物基人造肉，實現(xiàn)副產(chǎn)物雞血等的高價值利用，同時獲得滿意的肉色效果（圖1）。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設(shè)備

三黃雞由立華牧業(yè)股份有限公司提供；堿性蛋白酶（ 200 000U/g ）、中性蛋白酶（100000U/g^? ）、木瓜蛋白酶（ 800 000U/g ）購自上海源葉生物科技有限公司。食品級豌豆蛋白粉購自臨邑禹王植物蛋白有限公司；食品級谷朊粉購自山東谷碩生物科技有限公司。檸檬酸三鈉、檸檬酸、異抗壞血酸鈉購自國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖、氯化鈉購自西隴化工股份有限公司；阿拉伯膠 ??β -環(huán)糊精、Fe²⁺ 試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。

FE-28pH 計（瑞士METTLERTOLEDO公司產(chǎn)品），Ultra-turaxT-25數(shù)顯勻漿機（德國IKA公司產(chǎn)品），Stratos臺式高速離心機（德國Heraeus公司產(chǎn)品），DK-S22恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品），WSC-S色差儀（上海精密科學儀器有限公司產(chǎn)品），F(xiàn)OODBOT-D1食品3D打印機（杭州時印科技有限公司產(chǎn)品），TMS-TOUCH質(zhì)構(gòu)儀（美國FTC公司產(chǎn)品），一體式超聲波細胞破壁儀（上海微彌超聲波有限公司產(chǎn)品），ECLIPSEE2OO顯微鏡（日本Nikon公司產(chǎn)品），Gen5酶標儀（美國Bio-Tek有限公司產(chǎn)品），AA-7000原子吸收分光光度計（日本島津公司產(chǎn)品），EVO-LS10掃描電子顯微鏡（德國CarlZeiss有限公司產(chǎn)品），PEN3電子鼻（德國AIRSENSE公司產(chǎn)品），SA402B電子舌（日本IN-SENT公司產(chǎn)品），NicoletiS50傅里葉紅外光譜儀（美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品），TG/DTA7200熱重分析儀（日本HITACHI公司產(chǎn)品）。

1.2 試驗方法

1.2.1亞鐵血紅素肽酶解及純化工藝雞血細胞收集與破壁：選取成年三黃雞現(xiàn)場宰殺，收集新鮮抗凝雞血，經(jīng)紗布過濾除雜后離心，取沉淀并加入2倍體積生理鹽水洗滌，離心2＼～3次，收集沉淀血細胞，離心條件： 離心 10min 。離心后采用凍融法對血細胞破壁處理。

亞鐵血紅素肽酶解工藝：分別稱取 10g 凍融破壁血細胞，選取堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，按酶活力計算，添加相應(yīng)量的蛋白酶制劑，使得每 血細胞中酶活力為10000U，在各酶最適 pH 和溫度下進行酶解[20.24]：木瓜蛋白酶pH為7，溫度

55^°C ；中性蛋白酶 pH 為7.5，溫度 45^°C ；堿性蛋白酶 ΔpH 為8.5，溫度 。酶解后于冰浴下靜置20min后離心，初步去除相對分子量較大的蛋白質(zhì)（避免超濾膜堵塞、破裂）。取上清液用相對分子量10000蛋白質(zhì)能通過的超濾管在 下離心提純，收集濾液經(jīng)冷凍干燥后備用。

1.2.2微膠囊化亞鐵血紅素肽制備工藝取一定量 β -環(huán)糊精溶于 30mL 水中，再加入 300mg 亞鐵血紅素肽粉末，作為微膠囊芯材料，于 40% 下水浴吸附 ^1h 后，取一定濃度的阿拉伯膠溶液，按不同芯壁比加入芯材料溶液中，240W超聲乳化 15min ，冷凍干燥后備用。

1.2.3微膠囊化亞鐵血紅素肽發(fā)色劑在3D打印中的應(yīng)用將豌豆蛋白粉（ 10g?Σ 和不同質(zhì)量（ _0g，0.5 的谷粉攪拌 5min ，少量多次加入微膠囊化亞鐵血紅素肽溶液混勻， 600r/min 均質(zhì) 下反應(yīng)過夜后，進行3D打印。打印參數(shù)：噴嘴內(nèi)徑 0.84mm 、移動速率 30mm/s ，打印模板為直徑 20mm 、高 10mm 的圓柱體。另外，以雞胸肉糜作為3D打印樣品對照處理，將 5g 雞胸肉攪碎制作成直徑約 20mm. 高約 10mm 的樣品，測定其質(zhì)構(gòu)、色差和微觀結(jié)構(gòu)。

1.3 工藝優(yōu)化試驗

1.3.1亞鐵血紅素肽酶解提取工藝

1.3.1.1單因素試驗凍融法：分別取 10g 血細胞置于 -20^°C 環(huán)境下冷凍 ，自然解凍后于顯微鏡下對血細胞計數(shù)，計算破壁率。血細胞計數(shù)參考林曉楠[24]的方法，在顯微鏡下觀察破壁的血細胞數(shù)量并計算破壁率，破壁率計算公式如下：

酶的選擇：選用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶3種蛋白酶在最適 pH 、溫度，每 血細胞中酶活力為 10000U 條件下，水浴酶解 6h ，冰浴后5000r/min 離心 10min ，測定水解度和 Fe²⁺ 含量。

料液比優(yōu)化：選用堿性蛋白酶，取料液比（血細胞：水，質(zhì)量比）為 1：2，1：4，1：6，1：8，1：10 1：12 ，在最適 ΔpH 和溫度下水浴酶解 ⁶h ，冰浴后5000r/min 離心 10min ，測定水解度和 Fe²⁺ 含量。

酶解時間優(yōu)化：選用堿性蛋白酶，料液比（血細胞：水，質(zhì)量比） 1：10 ，在最適 ΔpH 和溫度下分別酶解 2h.4h.6h.8h.10h 冰浴后于 5000r/min 離心

10min ，測定水解度和 Fe²⁺ 含量。

離心速率優(yōu)化：采用堿性蛋白酶，料液比（血細胞：水，質(zhì)量比） 1：10 ，酶解 6h ，冰浴后分別以4000r/min.5000r/min.6000r/min.7000r/min 、8000r/min.9000r/min 離心 10min ，測定水解度和Fe²⁺ 含量。 Fe²⁺ 含量采用 Fe²⁺ 試劑盒測定，水解度的測定根據(jù)秦春青[25]所用方法，水解度計算公式如下：

式中， DH 為水解度， T_v 表示血紅蛋白溶液中總氮含量，按照國標 GB5009.5-2016 測定 _，AN 表示酶解液中氨基態(tài)氮含量，采用甲醛電位滴定法測定。

1.3.1.2正交試驗在酶解制備亞鐵血紅素肽單因素試驗的基礎(chǔ)上，以酶種類、料液比和酶解時間為考察因素， Fe²⁺ 含量為指標，設(shè)計正交試驗，確定亞鐵血紅素肽最優(yōu)提取參數(shù)。正交試驗設(shè)計因素和水平見表1。

1.3.2微膠囊化亞鐵血紅素肽制備工藝

1.3.2.1單因素試驗 β -環(huán)糊精添加量：分別取0.5g_s1.0g_s1.5g_s2.0g_s2.5gβ -環(huán)糊精于 40% 水浴吸附亞鐵血紅素肽，在阿拉伯膠含量 6% ，芯壁比 1：1 條件下，2 4 0 ～ ＼mathrm { ＼textW }$ 超聲乳化 10min ，測定包埋率。

阿拉伯膠含量：分別取 2%4%6%8%10% 阿拉伯膠溶液，按芯壁比 1：1 （體積比）加入芯材料（ -環(huán)糊精， 亞鐵血紅素肽）溶液中，240W超聲乳化 10min ，測定包埋率。

芯壁比：取 1.0：0.4，1.0：0.6，1.0：0.8，1.0： 1.0，1.0：1.2 （體積比）芯壁比，將 6% 阿拉伯膠溶液加入芯材料（ -環(huán)糊精， 300mg 亞鐵血紅素肽）溶液中，240W超聲乳化 10min ，測定包埋率。

其中，包埋率測定參考林曉楠[24]的方法，并稍作修改，其計算公式如下：

未包埋亞鐵血紅素含量包埋率= ?×100% 包埋亞鐵血紅素含量

式中，未包埋亞鐵血紅素含量的測定：稱取50.0mg 的亞鐵血紅素肽微膠囊，加入 5mL 酸性甲基異丁基酮（ pH 為2.0），渦旋 1min ，棄去上層有機試劑，下層溶液定容至 10mL ，于 50^cC 條件下水浴8min ，測定未包埋亞鐵血紅素含量。包埋亞鐵血紅素含量的測定：稱取 50.0mg 的亞鐵血紅素肽微膠囊，加入適量蒸餾水充分溶解，渦旋 1min ，定容至10 水浴 8min 。參照測定包埋亞鐵血紅素含量。

1.3.2.2正交試驗根據(jù)微膠囊化亞鐵血紅素肽制備單因素試驗結(jié)果，以 β -環(huán)糊精添加量、阿拉伯膠含量和芯壁比為考察因素，以包埋率為指標設(shè)計正交試驗（表2）。

1.3.33D 打印人造肉工藝谷胱粉添加量：取 0g 、0.5g.1. 0g.1.5g.2. 0g 谷粉與 10g 豌豆蛋白混勻，加人 65% 超純水 （ 22mL ）， 600r/min 轉(zhuǎn)速下均質(zhì)， 4^°C 冰箱中反應(yīng)過夜后打印，打印溫度 25^°C ，以變形率為指標，確定谷骯粉最優(yōu)添加量。

變形率根據(jù) Kim 等[26]的方法，測定計算公式如下：

變形率

式中 H₀ 表示設(shè)計對象高度（ cm ） H₁ 表示實際打印高度 （cm） 。

微膠囊化亞鐵血紅素肽添加量：取 10g 豌豆蛋白和 谷骯粉，分別添加 8.8mL，13.2mL，17.6 mL，22.0mL 微膠囊化亞鐵血紅素肽溶液，再分別加入 13.2mL，8.8mL，4.4mL，0mL 超純水，使水分含量不低于 65% 600r/min 下均質(zhì)， 冰箱中反應(yīng)過夜后打印，3D打印溫度 25^°C 。以雞胸肉肉糜為對照，以色差為考察指標，確定微膠囊化亞鐵血紅素肽的最優(yōu)添加量。

3D打印溫度：取 10g 豌豆蛋白和 _lg 谷骯粉，加入 22mL 微膠囊化亞鐵血紅素肽溶液混勻，600r/min 轉(zhuǎn)速下均質(zhì)，于 4^°C 冰箱中反應(yīng)過夜。分別采取 25^°C，35^°C，45^°C，55^°C 打印溫度，以變形率為指標，肉糜色差為參照，確定最佳打印溫度。

1.4 指標測定及性能分析

1.4.1 亞鐵血紅素肽性能

1.4.1.1短肽含量測定參考唐開永等[27]雙縮脲法稍作修改。取 0mL.0.2mL.0.4mL.0.6mL 、0.8mL 、 1.0mL 牛血清白蛋白溶液（BSA，10mg/mL ）置于6支試管中，分別加入 1.0mL，0.8 mL，0.6mL，0.4mL，0.2mL，0mL 超純水，再滴加4mL 雙縮脲試劑，搖勻后 37^°C 水浴 30min ，以1號管為調(diào)零管，測定 540nm 的吸光值并獲得標準曲線 。樣品測定：取5mL 超濾后的樣品溶液，加 5mL 15% 三氯乙酸（W/V），混勻后靜置 20min ，于 3000r/min 離心10min ，并將濾液定容至 25mL ，取 1mL 上述溶液，加人 4mL 雙縮脲試劑，搖勻后 37^°C 水浴 30min ，以5mL 超純水加 5mL15% 三氯乙酸（W/V）為空白，測定 540nm 處吸光值，按公式（5）計算短肽質(zhì)量濃度。

式中 X 表示短肽質(zhì)量濃度（ mg/mL ）； C 表示標準曲線測得蛋白質(zhì)含量（ mg/mL ）；25表示樣品溶液稀釋體積（mL）;1.0表示樣品稀釋液用量 （mL ）；5.0表示樣品稀釋的體積倍數(shù)。

1.4.1.2亞鐵血紅素含量測定參照林曉楠[24]氫氧化鈉-吡啶顯色法略有修改。通過 5% （體積分數(shù)）氨水配制不同質(zhì)量濃度 μg/mL.8μg/mL.10μg/mL. 氯化血紅素標準液。取1mL 標準液，加人2mL吡啶-NaOH（V33%吡啶：V_0.1molLNaOH=1：1 ） 3mg 亞硫酸鈉，靜置 30min 后測定 A₅₅₇ 吸光度值，獲得標準曲線： Y=17.540 0x- 。樣品的測定： 1mL 樣品溶液加入 2mL 吡啶-氫氧化鈉溶液后，再加入 3mg 亞硫酸鈉，靜置 30min 后測定 A₅₅₇ 吸光度值，計算亞鐵血紅素含量。

1.4.1.3總鐵、 Fe²⁺ 含量測定 Fe²⁺ 含量測定同方法1.3.1.1，標準曲線為： Y=0.008 2x-0.009 4 ， R²= 0.9990，總鐵含量的測定采用原子吸收光譜法，并測得標準曲線為 樣品溶液參照GB5009.90-2016《食品中鐵的測定》對過濾膜后的酶解液進行消解，原子吸收光譜參數(shù)為：燈電流 12mA ，空氣-乙炔 2.2L/min ，氬氣流量15L/min ，波長 248.3nm ，狹縫 0.2nm 。

1.4.2微膠囊化亞鐵血紅素肽性能研究

1.4.2.1微觀結(jié)構(gòu)分析微膠囊化亞鐵血紅素肽冷凍干燥后，使用導(dǎo)電膠粘取少量樣品粉末并固定于載物臺，于真空室中噴金，電壓 10kV ，放大倍數(shù)10 000倍。

1.4.2.2傅里葉變換紅外光譜分析通過傅里葉變換紅外光譜儀分析亞鐵血紅素肽和微膠囊化亞鐵血紅素肽的結(jié)構(gòu)組成，掃描范圍為 500～4000cm^-1 。

1.4.2.3穩(wěn)定性分析首先，采用熱重分析儀對微膠囊化亞鐵血紅素肽的熱穩(wěn)定性進行分析。稱?。?10±0.1? ？ mg 的微膠囊化亞鐵血紅素肽放入坩堝中， N₂ 流速為 50mL/min ，熱重分析儀的測試溫度為35-800^°C ，加熱速率 。其次，將微膠囊化亞鐵血紅素肽溶液于室溫下暴露于自然光下貯藏15d，通過紫外-可見光光譜監(jiān)測微膠囊化亞鐵血紅素肽，紫外-可見光譜掃描范圍為 200～800nm 。另外，對比研究牛血紅蛋白、甜菜紅、亞鐵血紅素肽和微膠囊化亞鐵血紅素肽在紫外光照射下的穩(wěn)定性。配置上述溶液（質(zhì)量濃度為 0.5mg/mL ）置于紫外光下照射 0～5h ，記錄紫外-可見光譜。

1.4.2.4生物相容性分析通過人MCF-7細胞的細胞成像試驗結(jié)果來評估微膠囊化亞鐵血紅素肽的生物相容性[28]。在含 15% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，將MCF-7細胞接種在 35mm 共聚焦培養(yǎng)皿中，置于 CO₂ 恒溫培養(yǎng)箱 ）培養(yǎng)24h。棄去培養(yǎng)基并用PBS洗滌細胞后，將 1mL 微膠囊化亞鐵血紅素肽溶液（ 50mg/mL ）與新鮮培養(yǎng)基按體積比 1：1 混合，并與MCF-7細胞孵育 10min 和 30min 。隨后，用PBS洗滌3次去除過量的微膠囊化亞鐵血紅素肽，采用LiveDye/NucleiDye熒光染料染色，并用倒置熒光顯微鏡觀察MCF-1細胞熒光圖像。

1.4.33D打印人造肉性能

1.4.3.1表觀性質(zhì)分析通過質(zhì)構(gòu)儀進行質(zhì)地剖面分析（TPA），比較3D打印人造肉樣本和雞胸肉肉糜的硬度、黏附性、彈性、內(nèi)聚性和咀嚼性[11]。采用兩次壓縮循環(huán)測試打印對象，測試參數(shù)設(shè)置如下：探頭直徑 30mm ，測試速度為 1mm/s ，觸發(fā)力為 5N 壓縮量為原始高度的 50% ，2次按壓時間間隔為1so

1.4.3.2色差分析采用色差儀記錄人造肉和雞胸肉肉糜樣品的亮度 ）、紅綠值（ ?a^? ）、黃藍值（ b^* ）和色差值 （ΔE） 。

1.4.3.3氣味測定將 物料置于小燒杯中封口，室溫下平衡 30min ，采用德國AIRSENSEPEN3電子鼻，將頂空中的氣味成分傳入傳感器陣列室中解析 60s ，空氣流速為 0.6L/min ，對比分析添加亞鐵血紅素肽前后人造肉樣本和雞胸肉肉糜的氣味，每個樣品重復(fù)3次。

1.4.3.4滋味測定取 25g 樣品與 100mL 超純水混勻后， 3000g 離心 10min ，取上清液過濾，采用日本INSENT電子舌對比檢測添加亞鐵血紅素肽前后人造肉樣本和雞胸肉肉糜的滋味。參比溶液為30mmol/LKCl和 0.3mmol/L 酒石酸溶液，選用ETS程序進行檢測。

1.4.3.5微觀結(jié)構(gòu)表征將3D打印人造肉樣品、雞胸肉和雞胸肉肉糜置于冰箱（ -40^°C ）預(yù)凍 ^12h 后，再放入真空冷凍干燥機中干燥 24h ，將其固定在樣品臺真空室中噴金，電壓 10kV ，采用SEM放大100倍觀察樣品微觀結(jié)構(gòu)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

單因素試驗采用OriginPro進行分析作圖，顯著性分析采用SPSS軟件處理，正交試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 工藝優(yōu)化

2.1.1亞鐵血紅素肽酶解工藝

2.1.1.1單因素試驗結(jié)果凍凍時長的確定：如圖2A所示，雞血細胞于 -20^°C 冷凍 后自然解凍，其血細胞破壁率均達到 90.00% 以上。其中，冷凍 ^4h 破壁率為 90.73%±3. 11% ，冷凍 ^10h 破壁率 94.32%±2.33% 與冷凍 6h 破壁率（ 93.25%± 2.65% ）無顯著性差異（ Pgt;0.05） ，考慮到冷凍效率，故選擇 6h 為最佳冷凍時長。

酶的確定：不同蛋白酶單因素試驗結(jié)果如圖2B所示，水解度從高到低分別是：木瓜蛋白酶處理（ 27.74%±0.74% 、堿性蛋白酶處理（ 23.57%± 1.21% ）、中性蛋白酶處理 （20.12%±1.10% 。 Fe²⁺ 含量與水解度趨勢相反，中性蛋白酶處理 Fe²⁺ 含量最高，為（ 30.46±1.20 ） μmol/L ，堿性蛋白酶處理Fe²⁺ 含量次之，為 （24.83±0.90） ） μmol/L ，木瓜蛋白酶處理 Fe²⁺ 含量最低。這是由于中性蛋白酶水解度較低，難以水解血紅蛋白復(fù)雜的球形封閉結(jié)構(gòu)[24，29]；雖然木瓜蛋白酶水解度較高，但其 Fe²⁺ 含量較低，因此，選擇堿性蛋白酶進行料液比和酶解時間的單因素試驗。

料液比與酶解時間的確定：堿性蛋白酶的料液比（質(zhì)量比）試驗結(jié)果如圖2C所示，在堿性蛋白酶總添加量100000U，酶解時間6h，料液比從1：2到 1：10 ，隨著水量增加其水解度逐漸上升， Fe²⁺ 含量逐漸下降，在料液比為 1：10 時水解度達到最高值（ 28.11% ）， Fe²⁺ 濃度降到 22.37μmol/L 。這是由于堿性蛋白酶的活性中心三維結(jié)構(gòu)隨著料液比的下降逐漸舒展，可以與底物更好地結(jié)合，從而快速酶解血紅蛋白[18]。但是在料液比為 1：12 時水解度出現(xiàn)下降，這是因為加水量過多時，蛋白酶活性中心無法完全被血紅蛋白占據(jù)，所以水解速度變慢，水解度降低。水解度的增加意味著更多的血紅蛋白被酶解，亞鐵血紅素肽暴露于水溶液中導(dǎo)致其部分被氧化， Fe²⁺ 含量下降[30]。從圖2D可見，隨著酶解時間的增加水解度不斷提高， Fe²⁺ 含量逐漸降低。酶解 ^10h 時水解度達到最高值（ 25.10% ），此時 Fe²⁺ 濃度為 21.28μmol/L 。同時，隨著酶解時間增加， Fe²⁺ 與空氣接觸時間增加，導(dǎo)致其被氧化，含量下降。

離心速率的確定：離心速率優(yōu)化結(jié)果如圖2E所示，隨著離心速率的提高， Fe²⁺ 濃度逐漸降低，這與林曉楠24的研究結(jié)果一致。其中， 4000～7000 r/min 時 Fe²⁺ 濃度無顯著性差異（ Pgt;0.05 ），8 000r/min 時 Fe²⁺ 濃度顯著低于 ，9000r/min 時 Fe²⁺ 濃度顯著低于其他速率。在4 000～9 000r/min 離心速率下，水解度在22. 30% ＼～24.45% 之間；離心速率達 9000r/min 時，水解度最高，同時 Fe²⁺ 濃度達到最低（ 20.34μmol/L ）?？紤]到 4000r/min 時水解度（ 22.30% 與 5000r/min （ 23.56% ）有顯著性差異，故采用5 為亞鐵血紅素肽制備的離心速率。

ΔA ：不同冷凍時間對血細胞破壁率的影響;B：不同蛋白酶對血紅蛋白水解度和 Fe²⁺ 濃度的影響;C：不同料液比處理血紅蛋白水解度和 Fe²⁺ 濃度；D：不同酶解時間血紅蛋白水解度和 Fe²⁺ 濃度;E：不同離心速率下血紅蛋白水解度和 Fe²⁺ 濃度。圖柱上不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（ （Plt;0.05） 。

2.1.1.2正交試驗結(jié)果正交試驗結(jié)果如表3所示，各因素影響大小順序為水解時間 （Z）gt; 酶種類（X）gt; 料液比（Y），通過極差分析得到酶解條件的最優(yōu)組合為 Z₃Y₃X₂ 。為進一步驗證酶解方案，對最佳方案 Z₃Y₃X₂ 和次優(yōu)方案 Z₂Y₃X₂ 進行同法提取驗證，重復(fù)3次（表4）。從表4可見，次優(yōu)方案 Z₂Y₃X₂ 中Fe²⁺ 含量略低于最佳方案 Z₃Y₃X₂ ，因此，選擇 Z₃Υ₃ X₂ 作為最優(yōu)酶解方案。

2.1.2微膠囊化亞鐵血紅素肽制作工藝如圖3所示，隨著 β -環(huán)糊精添加量和芯壁比的增加，亞鐵血紅素肽微膠囊的包埋率逐漸增大，隨著阿拉伯膠含量增加，亞鐵血紅素肽微膠囊的包埋率呈先增加后趨于平穩(wěn)的態(tài)勢。 β -環(huán)糊精添加量為 1.0g 時，包埋率顯著高于 0.5g 添加量（ Plt;0.05 ；添加量在 1.5g 以上時， β -環(huán)糊精溶解度達到飽和，包埋率趨于平穩(wěn)，故選取 1.5gβ -環(huán)糊精添加量為最佳試驗條件。阿拉伯膠含量從 2% 增加到 6% 時，包埋率顯著升高（ Plt;0.05. ），在含量為 6% 時包埋率 （91.24%±1.35% 達到最高值；阿拉伯膠含量從 6% 增加到 10% 時，包埋率沒有顯著變化，這是因為含量增大，阿拉伯膠分子間相互纏繞，芯材料難以包埋至壁材料分子內(nèi)，故選取 6% 阿拉伯膠為最佳試驗條件。芯壁比（體積比） 1.0：0.4～1.0： 1.0時，包埋率顯著升高（ Plt;0.05 ），從 54.82%± 1.53% 提升至 88.62%±1.64% ；而芯壁比（體積比）在 1.0：1.0 至 1.0：1.2 范圍時，包埋率無顯著性差異，故選取芯壁比（體積比） 1.0：1.0 為最佳試驗條件。

對微膠囊化亞鐵血紅素肽包埋率進行正交試驗，結(jié)果如表5所示。通過正交試驗結(jié)果得到因素主次為阿拉伯膠含量 （Y）gt; 芯壁比 （Z）gt;β. -環(huán)糊精添加量（X），對最佳方案 Y₂Z₃X₂ 和次優(yōu)方案 Y₂Z₁X₂ 進行驗證，結(jié)果如表6所示，最佳方案 Y₂Z₃X₂ 的平均包埋率（ 94.88% ）高于次優(yōu)方案 Y₂Z₁X₂（92.33%） ，因此，選擇 Y₂Z₃X₂ 為微膠囊化亞鐵血紅素肽的最優(yōu)條件，即 β -環(huán)糊精添加量為 1.5g 、阿拉伯膠含量6% 、芯壁比 1.0：1.0 （體積比）。

2.2 亞鐵血紅素肽性能指標

對超濾后的亞鐵血紅素肽理化性質(zhì)進行測定，亞鐵血紅素肽的亞鐵血紅素含量、總鐵含量、 Fe²⁺ 含量、短肽含量結(jié)果如表7所示。

2.3微膠囊化亞鐵血紅素肽性能

2.3.1結(jié)構(gòu)由圖4A可見，微膠囊化亞鐵血紅素肽的外觀結(jié)構(gòu)為球形，表面光滑，囊壁結(jié)構(gòu)完整，無裂縫，表明能夠?qū)π静牧掀鸬奖Ｗo作用。部分小顆粒微膠囊黏附在大顆粒膠囊上，存在附聚現(xiàn)象[25]2.3.2傅里葉變換紅外光譜傅里葉變換紅外光譜儀可鑒定未知物的官能團，測定化學結(jié)構(gòu)。如圖4B所示， 3300cm^-1 處及1 500～1650cm^-1 處的信號峰為亞鐵血紅素肽的 ΔN-H 鍵的拉伸和振動。3070cm^-1 處為不飽和烷基中C-H鍵的拉伸信號峰，1500cm^-1 和 1000～1200cm^-1 對應(yīng)于亞鐵血紅素肽C-O和 C=0 鍵[31]。相比于亞鐵血紅素肽，微膠囊化亞鐵血紅素肽的3 000cm^-1 處的信號峰消失，這是不飽和烷基C-H鍵斷裂所致[32]；此外， C=0 信號峰紅移，這可能是亞鐵血紅素肽和芯壁材料形成氫鍵造成其 C=0 信號峰向低波數(shù)移動[25]。這些結(jié)果表明微膠囊化亞鐵血紅素肽的成功制備。

2.3.3發(fā)色劑穩(wěn)定性發(fā)色劑穩(wěn)定性的評價在實際應(yīng)用中尤為重要，熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性是衡量其能否實際應(yīng)用的重要因素[3-34]。如圖4C所示，微膠囊化亞鐵血紅素肽存在兩個熱分解階段。第一階段，微膠囊化亞鐵血紅素肽在 30.0～101.9^°C 的范圍內(nèi)出現(xiàn) 5.72% 左右的重量損失，這是由于其水分揮發(fā)引起的；第二階段，在 約有71.17% 的重量損失，這主要是由于微膠囊化亞鐵血紅素肽發(fā)生了脫水、斷裂和分解反應(yīng)，導(dǎo)致其重量損失。由圖4D可以看出，微膠囊化亞鐵血紅素肽最大熱失重溫度為 318.2^qC ，這表明其具有較高的熱力學穩(wěn)定性[28]。此外，微膠囊化亞鐵血紅素肽在室溫條件下、自然光照射下貯存 15d 的穩(wěn)定性通過紫外-可見光譜進行了評估，結(jié)果如圖4E顯示，微膠囊化亞鐵血紅素肽溶液的兩個紫外吸收峰（ 280nm 和327nm ）幾乎未發(fā)生變化，吸光度變化小于0.1，表明其在貯存期間保持了較好的穩(wěn)定性。 280nm 的吸收峰與亞鐵血紅素肽中的芳香族氨基酸殘基（如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）相關(guān)，反映了肽鏈的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性； 327nm 的吸收峰與鐵配位中心（ Fe²⁺ ）及其周圍配體之間的電子轉(zhuǎn)移有關(guān)，穩(wěn)定的吸光度表明鐵離子及其配位環(huán)境未發(fā)生明顯變化。因此，微膠囊化亞鐵血紅素肽在自然光照和熱條件下均表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。

為了研究不同發(fā)色劑在植物基人造肉中的穩(wěn)定性，本研究對比了紫外光照射下，不同發(fā)色劑如動物源血紅蛋白（牛血紅蛋白）天然發(fā)色劑（甜菜紅）、亞鐵血紅素肽和制備的微膠囊化亞鐵血紅素肽的穩(wěn)定性。由圖4G、圖4H、圖4I可見，牛血紅蛋白、甜菜紅和未包埋的亞鐵血紅素肽的吸光度隨照射時間的增加而降低，表明這些發(fā)色劑的穩(wěn)定性較差，紫外光對其有較強的降解作用，導(dǎo)致其發(fā)色基團分解。圖4J中微膠囊化亞鐵血紅素肽在紫外光照射 5h 內(nèi)的吸光度變化較小，顯示出一定的穩(wěn)定性，表明微膠囊化處理有效提高了亞鐵血紅素肽的抗紫外光降解能力。這可能是由于微膠囊外殼的保護作用，減少了紫外光對亞鐵血紅素肽分子的直接損傷?？傊?，與其他發(fā)色劑（牛血紅蛋白、甜菜紅及未包埋的亞鐵血紅素肽）相比，微膠囊化亞鐵血紅素肽在紫外光照射下表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，具有更大的應(yīng)用潛力。

A：掃描電子顯微鏡圖;B：傅里葉紅外光譜圖;C：TG曲線;D：DTG曲線;E：紫外可見光譜圖;F：最大吸光度值變化；G：牛血紅蛋白紫外可見光譜圖；H：甜菜紅紫外可見光譜圖；I：亞鐵血紅素肽紫外可見光譜圖；J：微膠囊化亞鐵血紅素肽紫外可見光譜圖。

2.3.4生物相容性細胞毒性是評價制備材料安全性的重要指標之一，通過MCF-7細胞評估了微膠囊化亞鐵血紅素肽的安全性[28.35]。如圖5所示，高質(zhì)量濃度的微膠囊溶液（ 50mg/mL ）與MCF-7細胞孵育不同時間后，其細胞活力均可達到 80% 以上，表明所制備的微膠囊化亞鐵血紅素肽具有良好的生物相容性。

2.4微膠囊化亞鐵血紅素肽在3D打印人造肉中的應(yīng)用效果

2.4.1表觀性能變形率是判斷物料打印性能的指標之一，低變形率表明物料在擠出后可以自行支撐自重[21，26]。3D打印要求物料易于擠出，且擠出后必須能夠支撐自重不塌陷[36]。如圖6A所示，隨著谷骯粉添加量的增加，3D打印人造肉的變形率逐漸增大；在谷骯粉添加量低于 1.0g 時，打印樣品變形率幾乎為0，當添加量為 1.5g 時變形率顯著增高，添加量為 2.0g 時，變形率顯著高于 1.5g ，達到了 8%±0.5% ，這說明過量添加谷航粉容易導(dǎo)致3D打印樣品塌陷。表8質(zhì)地剖面分析（TPA）結(jié)果顯示，隨著谷粉含量的增加，3D打印人造肉的硬度逐漸降低，咀嚼性先增加后降低，彈性和膠黏性逐漸增大。這可能是由于谷骯粉中的醇溶蛋白和麥谷蛋白具有吸水性、持水性和黏彈性，其吸水率約為150%～200% ，谷航粉添加過量會導(dǎo)致打印物料的吸水性增大，導(dǎo)致3D打印樣品的變形率增大，易塌陷[37]。另外，根據(jù)表8中的色差分析，不同谷胱粉添加量對樣品色差的影響表明， ?L^*?a^*?b^* 和 ΔE 值與雞肉肉糜的色差差異較大。因此，選擇與雞胸肉肉糜硬度最為接近的谷骯粉添加量 （1.0g） 作為最佳添加量，以獲得最佳的3D打印效果。

A：谷胱粉添加量與人造肉變形率的關(guān)系;B;溫度對人造肉變形率的影響。圖柱上不同小寫字母表示不同處理間差異達顯著水平 （Plt;0.05） U

本研究探討了不同添加量的微膠囊化亞鐵血紅素肽溶液（ 8.8～22.0mL 對3D打印樣品性能的影響。隨著微膠囊化亞鐵血紅素肽溶液的增加，樣品的硬度呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，而彈性則呈現(xiàn)相反的變化。這可能是由于隨著添加量的增加，微膠囊化亞鐵血紅素肽增強了樣品的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，使得樣品網(wǎng)絡(luò)剛性增加，而使彈性受到一定抑制。但當添加量達到某一閾值（ 17.6mL ）后，分子間的相互作用趨于飽和，導(dǎo)致部分交聯(lián)點或分子團塊的形成，從而降低了材料的剛性和硬度，彈性回升。色差分析結(jié)果顯示，隨著微膠囊化亞鐵血紅素肽濃度的增加，L^* 值逐漸降低， ΔE 值逐漸增大，表明樣品顏色逐漸變暗，且與未添加微膠囊化亞鐵血紅素肽的樣品差異增大。 L^* 值的降低可能與微膠囊化亞鐵血紅素肽的深色特性有關(guān)，而 ΔE 值增大則反映微膠囊化亞鐵血紅素肽濃度升高時，樣品的顏色差異更為明顯。隨著人造肉3D打印溫度的升高（ ）， L^* 值、 ?a^* 值逐步增大（表8），變形率也逐漸上升（圖6B）。這是由于溫度升高導(dǎo)致豌豆蛋白的疏水基團暴露，增加了疏水性并提高了樣品的含水率，從而導(dǎo)致亮度（ L^* 值）增加。較高的溫度還促進了美拉德反應(yīng)，進一步加劇了色差的變化，使a^* 值和 b^* 值增大。進一步試驗結(jié)果表明，當豌豆蛋白粉與谷粉質(zhì)量比為 10：1 ，微膠囊化亞鐵血紅素肽溶液添加量 22.0mL，3D 打印溫度 35^qC 時，人造肉在色差、硬度、彈性等方面取得了較好的平衡，同時提升了樣品的穩(wěn)定性和感官質(zhì)量。因此，以上條件被認為是人造肉3D打印最佳條件。

2.4.2滋味、氣味為研究3D打印人造肉的適口性，本研究對比了有無添加微膠囊化亞鐵血紅素肽的3D打印樣本與雞胸肉肉糜在滋味和氣味方面的相似程度，3D打印條件為：豌豆蛋白粉：谷胱粉（質(zhì)量比 ）=10：1，3D 打印溫度 ，微膠囊化亞鐵血紅素肽添加量為 0mL 和 22mL 。電子鼻測試結(jié)果如圖7A所示，不含微膠囊化亞鐵血紅素肽的人造肉與添加微膠囊化亞鐵血紅素肽的人造肉中烷烴類、酮、醇類等物質(zhì)響應(yīng)值與雞胸肉肉糜無顯著性差異，氮氧化物、有機硫化物和無機硫化物響應(yīng)值顯著增大（ （Plt;0.05） 。添加微膠囊化亞鐵血紅素肽后有機硫化物的響應(yīng)值最高（響應(yīng)值為4.586），其次是氮氧化物（響應(yīng)值為4.288）。其中，有機硫化物賦予人造肉芳香氣味[38]，不含微膠囊化亞鐵血紅素肽的人造肉和添加微膠囊化亞鐵血紅素的人造肉中有機硫化物響應(yīng)值相對于雞肉肉糜分別增加了0.86和2.50，可見微膠囊化亞鐵血紅素肽的添加可使人造肉中芳香氣味顯著增強。電子舌測試結(jié)果如圖7B所示，5種口味類別中，2種3D打印人造肉的滋味與雞胸肉肉糜幾乎沒有差別，所有傳感器響應(yīng)值為-30＼～40，其中咸味響應(yīng)值約為38，其次鮮味響應(yīng)值約為11.5，酸味響應(yīng)值約為8.5，苦澀味為負值，說明本研究開發(fā)的人造肉能夠較好模擬真實雞胸肉肉糜的滋味。

A：電子鼻雷達圖;B：電子舌柱狀圖。a為不含微膠囊化亞鐵血紅素肽的人造肉樣品，b為添加微膠囊化亞鐵血紅素肽的人造肉樣品，c為雞胸肉肉糜樣本。

2.4.3微觀結(jié)構(gòu)由圖8可見，3D打印人造肉形成了致密的交聯(lián)結(jié)構(gòu)。相對于未添加微膠囊化亞鐵血紅素肽的人造肉（圖8A），添加微膠囊化亞鐵血紅素肽的人造肉（圖8B）的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更致密。雞胸肉肉糜（圖8C）的肌肉纖維狀態(tài)相比于雞胸肉（圖8D）較為稀疏。由此可見，添加微膠囊化亞鐵血紅素肽3D打印人造肉致密的層狀結(jié)構(gòu)更能模擬出真實雞胸肉的纖維結(jié)構(gòu)。

A：未添加微膠囊化亞鐵血紅素肽的人造肉;B：添加微膠囊化亞鐵血紅素肽的人造肉;C：雞胸肉肉糜;D：雞胸肉。

3結(jié)論

本研究以利用率極低的禽血為材料，研究了亞鐵血紅素肽的酶解法提取和微膠囊化制備工藝，結(jié)合3D打印技術(shù)，將其應(yīng)用于植物基人造肉發(fā)色中，開發(fā)了肉色穩(wěn)定、質(zhì)構(gòu)和適口性良好的植物基人造肉。通過優(yōu)化酶解雞血血紅蛋白的單因素試驗和正交試驗，選取堿性蛋白酶， pH8.5 ，總添加量100000U，反應(yīng)溫度 50% ，在料液比 1：10 （質(zhì)量比），酶解6h條件下， Fe²⁺ 濃度為 22.11μmol/L 。通過微膠囊化亞鐵血紅素肽的單因素試驗和正交試驗，選取 β 環(huán)糊精添加量 1.5g ，芯壁比 1：1 （體積比），壁材料含量 6% ，此時包埋率達 94.88% 。開發(fā)了3D打印人造肉的不同配方，研究了谷胱粉、微膠囊化亞鐵血紅素肽的添加量和3D打印溫度對植物基人造肉質(zhì)構(gòu)特性和色差的影響。當豌豆蛋白粉：谷胱粉 τ=10： 1（質(zhì)量比）時，添加微膠囊化亞鐵血紅素肽溶液后，在3D打印溫度為 35^°C 時，制備的人造肉具有較高的穩(wěn)定性、較好的適口性，能模擬雞肉肉糜的色澤和滋味。本研究制備的微膠囊化亞鐵血紅素肽不僅可作為安全穩(wěn)定的人造肉發(fā)色劑，還實現(xiàn)了雞血副產(chǎn)物的高價值利用，為人造肉肉色模擬和加工提供了新的思路與實現(xiàn)方式，未來可以根據(jù)產(chǎn)品的目標特性進一步熟化人造肉安全發(fā)色技術(shù)。

參考文獻：

[1]張智霞，馬鑫淼，許慧，等.人造肉技術(shù)的研究現(xiàn)狀及展望

[J].食品工業(yè)科技，2024，45（17）：416-425.

[2]國家統(tǒng)計局.2023中國統(tǒng)計年鑒［M].北京：中國統(tǒng)計出版 社，2023.

[3] 焦新麗.消費者對人造肉購買意愿的影響因素及構(gòu)型研究 [D].無錫：江南大學，2022.

[4] 昝夢瑩.我國畜禽肉類產(chǎn)品市場分析與對策建議[J].西北農(nóng) 林科技大學學報（社會科學版），2021，21（3）：149-155.

[5] 唐偉挺，余曉盈，鄒苑，等.人造肉的研究現(xiàn)狀、挑戰(zhàn)及展望 [J].食品研究與開發(fā)，2022，43（6）：190-199.

[6] BROUCKEK，PAMEL EV，COILLIEEV，et al.Cultured meat andchallengesahead：areview on nutritional，technofunctional and sensorial properties，safetyand legislation[J].Meat Science， 2023，195：109006.

[7] WENY X，CHAO C，CHEQT，et al.Development of plantbased meat analogs using 3D printing：status and opportunities[J]. Trends in Food Scienceamp; Technology，2023，132：76-92.

[8] 趙鑫銳，張國強，李雪良，等.人造肉大規(guī)模生產(chǎn)的商品化技術(shù) [J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2019，45（11）：248-253.

[9] 張國強，趙鑫銳，李雪良，等.動物細胞培養(yǎng)技術(shù)在人造肉研究 中的應(yīng)用[J].生物工程學報，2019，35（8）：1374-1381.

[10]ZHENGYY，SHIYF，ZHUHZ，et al.Quality evaluation of cultured meat with plantprotein scafld[J].Food Research International，2022，161：111818.

[11]KANTANENK，OKSANENA，EDELMANNM，etal.Physical properties of extrudates with fibrous structures made of faba bean protein ingredients using high moisture extrusion[J].Foods，2022， 11（9）：1280.

[12］江睿生，王娜，王治力，等.不同大豆分離蛋白性質(zhì)及其制備 人造肉表觀品質(zhì)的研究[J].中國糧油學報，2022，37（11）： 124-132.

[13]FUS，MAYR，WANGYN，etal.Contentsand correlationsof Nε-（carboxymethyl）lysine，Nε-（carboxyethyl）lysine，acrylamide andnutrientsin plant-based meat analogs[J].Foods，2O23，12 （10）：1967.

[14]LYUXY，YINGDY，ZHANGPZ，et al.Effect of whole tomato powder or tomato peel powder incorporationonthecolor，nutritional，and textural properties of extruded high moisture meat analogues [J].Food and Bioprocess Technology，2023，17（1）：231-244.

[15]RYUKK，KANGYK，JEONGEW，etal.Applications of various natural pigments to a plant-based meat analog[J].LWT-Food Science and Technology，2023，174：114431.

[16]MAERE HD，CHOLLET S，BRABANTERDJ，et al. Influence of meat source， pH and production time on zinc protoporphyrin IX formation asnatural colouring agentinnitrite-free dry fermented sausages[J].Meat Science，2018，135：46-53.

[17］吳瑤.雞血中血紅蛋白的提取純化及性質(zhì)的研究［D].沈 陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學，2020.

[18]LIQ，ZHANGL T，LIY，et al.Decolorization of porcine hemoglobin hydrolysates：the role of peptide characteristics and pH values[J]. Journal of Food Science，2023，88（8）：3410-3421.

[19]PIERRE SR S，RAJASEKHARAN D，DARWIN E C，et al. Discovering the mechanicsofartificial and realmeat[J].Computer Methods in Applied Mechanics and Engineering，2023，415：116236.

[20]CHENYP，F(xiàn)ENGX，BLANKI，etal.Strategies to improve meatlike properties of meat analogs meeting consumers’expectations [J].Biomaterials，2022，287：121648.

[21]WEBB D，LI YH，ALAVI S.Chemical and physicochemical features of common plant proteins and their extrudates for use in plant-based meat[J].Trends in Food Science amp; Technology， 2023，131：129-138.

[22]KO HJ，WENY X，CHOI JH，et al.Meat analog production through artificial muscle fiber insertion using coaxial nozzle-assisted three-dimensional food printing[J].Food Hydrocolloids，2021， 120：106898.

[23] KIM S M， WEN Y X， KIM H W，et al. Textural and sensory qualities of low-calorie surimi with carrageenan inserted asa protein substitute using coaxial extrusion 3D food printing[J]. Journal of Food Engineering，2022，333：111141.

[24］林曉楠.亞鐵血紅素寡肽的制備及其微膠囊化[D].廣州：華 南農(nóng)業(yè)大學，2018.

[25］秦春青.酶解鵝血提取血紅素及其補鐵效果和微膠囊化的研 究[D].重慶：西南大學，2017.

[26]KIMSM，KIMHW，PARKHJ.Preparation and characterization of surimi-based imitation crab meat using coaxial extrusion thredimensional food printing[J].Innovative Food Scienceamp; Emerging Technologies，2021，71：102711.

[27］唐開永，周鴻翔，田婭玲，等.低濃度小分子多肽含量測定方法 的比較研究[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（16）：144-148.

[28]HANTT，HUANGY，GAO TY，etal.Fabrication of nitrogendoped graphene quantum dots based fluorescent probeand its application for simultaneous，sensitive and selective detectionof umamiamino acids[J].Food Chemistry，2023，404：134509.

[29]XUEDJ，JIANGS，ZHANG M，etal. The efficiency and safety evaluationofhemoglobin hydrolysateasa non-heme iron fortifier [J].Food Science and Human Wellness，2024，13（2） ：999-1010.

[30］吳文錦，汪蘭，孫靜，等.雞血血紅蛋白酶法提取血紅素工 藝優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā)，2021，42（9）：90-96.

[31]JARZEBSKI M，WIERUSZEWSKI M，KOSCINSKI M，et al. Heme iron as potential iron fortifier for food application-characterization by material techniques[J].Reviews on Advanced Materials Science，2023，62（1） ：128.

[32］李豇.幾種血紅素復(fù)合材料的制備及應(yīng)用研究[D].邯鄲： 河北工程大學，2020.

[33]FERNANDEZ-LOPEZ J，PONCE-MARTINEZ A J，RODRIGUEZPARRAGA J，et al. Beetroot juices ascolorant in plant-based minced meat analogues：color，betalain composition and antioxidant activity as affected by juice type[J].Food Bioscience，2023，56：103156.

[34]RUEDT C， GIBIS M， WEISS J. Meat color and iridescence：origin， analysis，and approaches to modulation[J]. Comprehensive Reviews inFood ScienceandFood Safety，2023，22（4）：3366-3394.

[35］BANACH M，KHAIDAKOV B，KOREWO-LABELLED，et al. Thechemical and cytotoxic properties of sambucus nigra extractsa natural food colorant[J]. Sustainability，2021，13（22）：12702.

[36]KANG TW，CHOI RY，KIMIW，etal. Evaluation of feasibility of tenebrio molitor larval fractions as a meat analog using 3D printing[J].Innovative Food Science amp; Emerging Technologies，2023， 89：103446.

[37］曲敏，王宇，朱秀清，等.谷骯粉基共混黏合體系的構(gòu)建及 在素肉餅中的應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)工程學報，2022，38（19）：285-294.

[38]YANG LY，ZHANG TY，LIH，et al.Control of beany flavor from soybean protein raw material in plant-based meat analog processing[J].Foods，2023，12（5）：923.