超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定火麻啤酒中大麻酚、大麻二酚和四氫大麻酚

Determination of Cannabinol， Cannabidiol and Δ9 1 Tetrahydrocannabinol in Hemp Beer by Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHU Faze12， CHEN Yuemeng， XIAO Dexin4， ZHAO Yuwang'， CHEN Shunqin12， ZHANG Qiaojun1.2*

（1.Department or Forensic Medicine， Guizhou Medical University， Guiyang 55oo04， China; 2.School ofForensic

Medicine， Guizhou Medical University， Guiyang 55oo04， China; 3.Guiyang City Public Security Bureau Drug

Testing Center， Guiyang 550o08， China; 4.Guizhou Wanfu Xianyi Testing Technology Co.，Ltd.，Guiyang 550009， China; 5.School of Public Health， Guizhou Medical University， Guiyang 56l1o0， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of cannabinol （CBN），cannabidiol （CBD）， and Δ9 -tetrahydrocannabinol （THC） in hemp beer using ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. Method： The samples were extracted with ethyl acetate and subjected to gradient elution with water （containing 0.25% formic acid and 0.2% ammonium formate） and acetonitrile. Separation was performed on a Waters ACQUITY HSS T3 column. Detection was carried out using electrospray ionization in multiple reaction monitoring mode， with quantification by external standard method.Result： CBN，CBD，and THC showed good linear relationship in the range of ，and the correlation coefficient r value was greater than O.999. At the three addition levels of 1， 10ng?mL^-1 and 100ng?mL^-1 ，the sample recoveries were （20 72.9%～106.4% ， the matrix effect was -2.5%～11.3% ， the accuracy was -21.1%～-9.8% ， In the relative standard deviation （RSD）， the intra-day RSD was 2.3%～11.2% ，theinter-day RSDwas 3.5%～14.2% ，the detection limit was 0.5ng?mL^-1 ，and the quantification limit was 10ng?mL^-1 . Conclusion： This method is simple， rapid， sensitive， andrequires lessreagents in the pretreatment processItcan provide reliable technical support for the identification of illegal cannabis components in food safety supervision and public security drug enforcement.

Keywords： ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; cannabidiol; cannabinol; Δ 9-tetrahydrocannabinol; illegal addition

火麻，屬?？拼舐閷?，為一年生直立草本植物，其起源可追溯至錫金、不丹、印度及中亞等地區(qū)。在我國，火麻具有悠久的使用歷史，被列為“麻、麥、稷、黍、豆”五谷之一[1-2]?；鹇榍o皮纖維質(zhì)地堅韌，是制作麻布、紡線、繩索、漁網(wǎng)及紙的優(yōu)質(zhì)原料。此外，火麻還具有多種藥理功能，包括養(yǎng)護肝腎、延緩衰老、緩解頭痛、助眠、抗癌、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等[3]。因具有含油豐富、可食用、藥理活性突出等特點，火麻被廣泛開發(fā)為各類衍生產(chǎn)品，如大麻二酚（Cannabidiol，CBD）保健品、火麻油、火麻啤酒、巧克力、麻仁軟膠囊、醫(yī)用紗布和麻仁飼料等[4-5]

火麻中大麻素成分包括四氫大麻酚（△9-Tetrahydrocannabinol，THC）、大麻二酚、大麻酚（Cannabinol，CBN），是其主要的藥理活性物質(zhì)[。研究顯示，大麻二酚對人類子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞具有細胞毒性，可以顯著抑制細胞的增殖和遷移能力[7-8]；另有研究指出，大麻素對存在閾下失眠癥狀人群的睡眠質(zhì)量、失眠癥狀及健康相關(guān)生活質(zhì)量具有顯著改善作用[。然而，四氫大麻酚等成分也存在一定的毒性作用，如孕期接觸四氫大麻酚可能影響后代的心血管發(fā)育[10]。普通人群口服攝人大麻二酚分離物的可接受每日攝入量上限僅為0.43mg^.kg^-1 bw[11]。臨床前模型研究表明，產(chǎn)前大麻素暴露會對后代的學習記憶、行為技能、睡眠及注意力產(chǎn)生負面影響[12]。尤其需要關(guān)注的是，四氫大麻酚是火麻中對中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用最強的精神活性成分，具有成癮性和依賴性，長期使用會成癮和產(chǎn)生依賴[13]。因此，食品中不得超過工業(yè)大麻限量標準添加四氫大麻酚。目前，國際上主要根據(jù)四氫大麻酚和大麻二酚的含量及比值區(qū)別毒品大麻和工業(yè)大麻（ THClt;0.3% CBDgt;0.3% THC/CBDlt;1 ）[14]

近年來，隨著火麻研究的不斷深入，其衍生產(chǎn)品逐漸進入人們的日常生活。其中，火麻啤酒顛覆傳統(tǒng)啤酒釀造原料，創(chuàng)新性地加人了工業(yè)大麻火麻，廣受歡迎。然而，目前市面上的火麻啤酒品質(zhì)參差不齊，包括國產(chǎn)火麻啤酒和通過跨境電商等渠道流入國內(nèi)的產(chǎn)品，其四氫大麻酚等精神活性成分的含量缺乏有效監(jiān)管[15]。更有不法分子非法添加高劑量四氫大麻酚至火麻啤酒中，使消費者產(chǎn)生成癮和依賴，進而獲取暴利，嚴重威脅消費者健康，甚至可能引發(fā)食品安全事件。因此，建立火麻啤酒中四氫大麻酚、大麻二酚、大麻酚成分的檢測方法，對于火麻啤酒的安全檢測和質(zhì)量監(jiān)管具有重要意義。

目前，四氫大麻酚、大麻二酚、大麻酚的常見分析方法包括高效液相色譜法[16-17]、膠體金免疫層析法[18]、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法[19]、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法[20-29]。其中，高效液相色譜法靈敏度低，受樣品干擾較大，不適合痕量分析；氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法需要對樣品進行衍生化處理，該過程中耐酸、耐熱性差的大麻素類化合物如大麻二酚可能分解，造成檢測結(jié)果不準確，且操作煩瑣、耗時；液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法不需要衍生化處理，對樣品不會造成破壞，耗時短、靈敏度高、準確性高，已成為大麻素類化合物定性定量分析的主流方法。然而，目前尚缺乏針對火麻啤酒中四氫大麻酚、大麻二酚和大麻酚系統(tǒng)分析方法的報道。基于此，本研究基于超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了火麻啤酒中四氫大麻酚、大麻二酚、大麻酚的分析檢測方法，該方法具有較強的實用價值，可為食品安全監(jiān)管以及公安禁毒領(lǐng)域鑒定非法大麻成分提供重要的方法參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

大麻酚標準品、大麻二酚標準品、四氫大麻酚標準品（ 1.0mgmL^-1 ），上海市刑事科學技術(shù)研究院;甲醇、乙醇、乙晴（色譜純），德國默克公司；異丙醇（色譜純）、甲酸（質(zhì)譜純），賽默飛世爾科技公司；乙酸乙酯（含量 ?99.5% ），國藥集團化學試劑有限公司；甲酸銨（色譜純），美國希格瑪公司；超純水。

1.2儀器設(shè)備

ACQUITYUPLC/SCIEX5500三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，美國Waters公司；ACQUITYHSST3色譜柱，美國Waters公司；氮吹儀，英國Biotage公司；超聲波清洗器，德國埃爾瑪公司；離心機，德國賽默飛世爾科技公司；渦旋混合器，廣東省科寅實驗室設(shè)備有限公司；Milli-Q純水儀，德國默克公司。

1.3儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：WatersACQUITYHSST3（ 100mm× 2.1mm ， 1.8μm ）；柱溫： 40°C ；進樣量： 1μL ：流速： 0.35mL?min^-1 ；流動相：A為（含 0.25% 甲酸、0.2% 甲酸銨， u/ν ）水溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序：0～4min ： 60%95%B . 4～6min ： 95%B . 6～ 6.5min ： 95%60%B ； 6.5～10min ： 60% 。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧正離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式；氣簾氣： 40psi ；碰撞氣：9psi；噴霧電壓： 5500V ；離子源溫度： 500°C ；噴霧氣：35psi ；輔助加熱氣： 70psi ；碰撞氣：氮氣；優(yōu)化后的定性定量離子對的碰撞電壓、裂解電壓見表1。

1.3.3 標準溶液的配制

0.1mg?mL^-1 混合標準溶液：移取濃度均為1.0mg?mL^-1 的大麻酚、大麻二酚和四氫大麻酚標準溶液各 1mL 加人 10mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度線，配制成濃度為 0.1mg?mL^-1 的混合標準物質(zhì)儲備液，密封， -18°C 保存?zhèn)溆谩?/p>

100ngmL^-1 標準工作溶液：移取上述 0.1mgmL^-1 標準物質(zhì)儲備溶液 100μL 加入 10mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，配制成濃度為 1μg?mL^-1 的標準物質(zhì)工作溶液；移取 1μg?mL^-1 的標準物質(zhì)工作溶液 1mL 加人 10mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度線，搖勻、配制成濃度為 100ng?mL^-1 的標準物質(zhì)工作溶液，密封， -18°C 保存?zhèn)溆谩?/p>

5ng?mL^-1 標準工作溶液：移取 100ng?mL^-1 標準物質(zhì)工作溶液 500μL ，加人 10mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度線，配制成濃度為 5ng?mL^-1 的標準物質(zhì)工作溶液，密封， -18°C 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4樣品前處理

取火麻啤酒樣品 1mL 于 10mL 具塞離心管中，加入 4mL 乙酸乙酯溶液，渦旋混勻 3min 4 200r?min^-1 離心 5min 后，取上清液至試管中氮吹至近干后加入 0.5mL 甲醇復(fù)溶，過 0.22μm 濾膜后測定，外標法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1色譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

配制 10ng?mL^-1 含3種目標化合物的樣品，分別比較Phenomenex TitankF5（ 100mm^×2.1mm 1.8μm ）、WatersACQUITYHSST3（ 100mm× 2.1mm ， 1.8μm ）和AgilentEclipse Plus C₁₈ （ 100mm^× 2.1mm ， 1.8μm ）色譜柱對3種目標化合物的分離效果，以選擇洗脫能力最佳的色譜柱。結(jié)果表明，AgilentEclipse Plus C₁₈ 色譜柱對3種目標化合物選擇性不好，分離能力低于PhenomenexTitankF5與WatersACQUITYHSST3色譜柱；與WatersACQUITYHSST3色譜柱相比，3種目標物在PhenomenexTitankF5中分離效果較差，具有較寬的峰寬和較差的峰形，即不能提供更高的分辨率和更好的定量結(jié)果。因此，后續(xù)研究采用WatersACQUITYHSST3色譜柱進行。

2.1.2 流動相選擇

對比流動相為水（含 0.25% 甲酸、 0.2% 甲酸銨，u/ν ）-甲醇、水（含 0.25% 甲酸、 0.2% 甲酸銨， u/ν ）-乙腈、水－甲醇時，3種目標化合物的色譜峰。結(jié)果顯示，水－甲醇為流動相時，四氫大麻酚色譜峰出現(xiàn)較強的拖尾；水（含 0.10% 甲酸、 0.2% 甲酸銨，u/ν ）-乙晴為流動相時，部分化合物色譜峰有分叉現(xiàn)象，峰形不好；水（含 0.25% 甲酸、 0.2% 甲酸銨，u/ν ）-甲醇為流動相進行梯度洗脫時，色譜峰較對稱，峰形較好，結(jié)果見圖1。

2.2提取方式的選擇

以加標陰性樣品（ 10ng?mL^-1 ）為待測樣品進行分析，分別比較直接進樣，乙醚、乙酸乙酯作為提取劑對3種目標化合物回收率的影響，結(jié)果見圖2。采用直接進樣進行分析時，3種目標化合物的回收率為 56%～65% 。這可能是因為火麻啤酒基質(zhì)較為復(fù)雜，直接進樣使樣品基質(zhì)效應(yīng)較強，導致回收率變低。乙醚作為提取劑提取時，3種目標化合物的回收率為58%～74% 。采用乙酸乙酯提取時，3種目標化合物的回收率為 86%～98% 。采用乙酸乙酯提取回收率高于乙醚，可能是因為乙醚極性強于乙酸乙酯，提取過程將基質(zhì)中的大部分物質(zhì)轉(zhuǎn)移進乙醚層，導致3種目標化合物的回收率偏低。因此，實驗選擇乙酸乙酯作為提取劑分析待測物質(zhì)。

實驗進一步比較了乙酸乙酯用量為 2，4，6mL 時，加標陰性樣品中3種目標化合物的回收率。結(jié)果顯示，乙酸乙酯用量為 2mL 時3種目標化合物的回收率為68% ，用量為 4mL 和 6mL 時目標化合物的回收率高于 70% 。考慮到成本及對環(huán)境的影響，選擇 4mL 乙酸乙酯對樣品中目標化合物進行提取。

2.3標準曲線線性范圍、檢出限及定量限

在陰性火麻啤酒樣品中分別添加適量的3種待測目標化合物，使樣品中目標化合物濃度分別為1、2、5、10、20、 和 100ng?mL^-1 （每個濃度點平行配制3份），上機測定，以目標物定量離子對峰面積為縱坐標，標準添加樣品中目標物濃度為橫坐標繪制標準曲線，線性回歸得到回歸方程，見表2。結(jié)果顯示，在 1～100ng?mL^-1 內(nèi)，大麻酚、大麻二酚和四氫大麻酚3種目標物的相關(guān)系數(shù) （r） 均 ?0.999 ，線性關(guān)系良好。

分別移取若干份陰性火麻啤酒樣品，添加系列低于定量限值的3種待測目標化合物，配制低于定量限值的不同濃度的待測樣品進行分析。以信噪比（S/N）?3 作為方法檢出限，以信噪比 （S/N）≥10 作為方法定量限，結(jié)果見表2。

2.4精密度與準確度

分別在空白樣品中添加低（ ）、中（ 10ng?mL^-1 ）、高（ 100ng?mL^-1 ）3個濃度的混合標準溶液制備待測樣品，平行制備6份。當天測定6份平行樣品，計算相對標準偏差（RelativeStandardDeviation，RSD）評價方法的日內(nèi)精密度及準確度，其中準確度用偏倚表示。對以上樣品平行分析 5d 計算RSD評價方法的日間精密度。結(jié)果顯示，3個濃度水平下， RSD_（HPJ） 為 2.3%～ 11.2% ，準確度為 -21.1%～-9.8% ， 為 3.5%～ 14.2% ，說明該方法準確度和精密度良好，符合痕量分析要求。3種目標化合物的精密度、準確度結(jié)果見表3。

分析檢測

2.5 加標回收率與基質(zhì)效應(yīng)

用甲醇將濃度為 的3種待測目標化合物工作溶液分別稀釋成濃度為1、10、100ng?mL^-1 大麻酚、大麻二酚和四氫大麻酚混合標準品溶液，分別重復(fù)進樣6次，得到濃度均值 （A） ；取6份不同基質(zhì)的陰性火麻啤酒樣品，分別添加適量1 000ng?mL^-1 3 種待測目標化合物工作溶液，使其濃度分別為1、10、 100ng?mL^-1 ，上機檢測，每個濃度平行制備6份進樣分析，得到濃度均值 （B） ；取

6份不同基質(zhì)的陰性火麻啤酒樣品，提取后濃縮后分別添加適量 100ng?mL^-13 種待測目標化合物標準物質(zhì)工作溶液，使其濃度分別為1、10、 100ng?mL^-1 ，上機檢測，每個濃度平行制備6份進樣分析，得到濃度均值 （C ）。其中，提取回收率 （%）=B/C×100% ，基質(zhì)效應(yīng) 。結(jié)果顯示，提取回收率為 72.9%～ 106.4% ，基質(zhì)效應(yīng)為 -2.5%～11.3% 說明該方法的穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性好，符合痕量分析要求。方法提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見表4。

3結(jié)論

本研究首次建立了火麻啤酒中四氫大麻酚、大麻二酚和大麻酚的超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜分析檢測方法。結(jié)果表明，大麻酚、大麻二酚和四氫大麻酚在 線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù) r 值均大于0.999，在1、10、 100ngmL^-13 個添加水平下，樣品提取回收率為 72.9%～ 106.4% ，基質(zhì)效應(yīng)為 -2.5%～ 11.3% ，準確度為 -21.1%～-9.8% ， 為 2.3%～11.2% RSD_（??） 為 3.5%～14.2% 檢出限為 0.5ng?mL^-1 ，定量限為 1.0ng^.mL^-1 。方法各項參數(shù)均滿足痕量分析要求，填補了火麻啤酒中大麻酚、大麻二酚和四氫大麻酚檢測方法的空白，具有較強的實用價值，可為食品安全監(jiān)管中非法大麻成分的檢測提供參考。

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