高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水果中酚酸

Determination of Phenolic Acids in Fruits by High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

RUANJiacheng，WANG Hao，YUANXuyan （Bureau Veritas Science and Technology Service （Xi'an） Co.，Ltd.， Xi'an 71oooo， China）

Abstract： Establish a detection method for phenolic acids in fruit using ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry The nine phenolic acids showed good linearity in the range of 0.5ngmL^-1 to 500.0ng?mL^-1 （R²gt;0.998） ，with detection limits as low as 0.10ng?mL^-1 to 0.25ng?mL^-1 and quantification limits between 0.33ng?mL^-1 to 0.83ng?mL^-1 . The recovery rate was 82.9% to 116.2% ，and the relative standard deviation was between 2.4% to 6.1% .Actual sample testing shows that there are differences in the composition and content of phenolic acidsamong the three fruits.Blueberries have the highest totalphenolic acid content，followed by strawberies，and grapefruit has the lowest.This method has high sensitivityand good accuracy，and the research results provide reference for fruit quality evaluation， nutritional analysis， and functional food development.

Keywords： high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; fruits; phenolic acid

酚酸是水果中常見的次生代謝產(chǎn)物，影響水果色澤、風(fēng)味和品質(zhì)，具有抗氧化等生物活性，對人體健康有益。隨著人們生活水平的提高，消費者對水果營養(yǎng)價值愈發(fā)關(guān)注，精準(zhǔn)測定水果中酚酸的種類和含量，成為食品科學(xué)與營養(yǎng)學(xué)研究熱點。分光光度法和薄層色譜法雖操作簡便，但靈敏度欠佳，難以分析復(fù)雜基質(zhì)中的痕量酚酸，同時對多種酚酸的定性、定量分析有局限性。高效液相色譜雖分離能力強，但面對結(jié)構(gòu)相似的酚酸，定性準(zhǔn)確性受限[1]。高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合了高效液相色譜法的高分離性能與串聯(lián)質(zhì)譜法的高靈敏度、高選擇性，可實現(xiàn)酚酸的精準(zhǔn)分析。

1材料與方法

1.1材料與試劑

藍(lán)莓、草莓、葡萄柚，購自本地大型果蔬市場;9種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度 ?98% ），Sigma-Aldrich公司。甲醇、乙腈，色譜純，F(xiàn)isherScientific公司；甲酸、鹽酸，分析純，上海安譜科技公司；實驗用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

WatersAcquityUPLC超高效液相色譜儀，Agilent公司；XevoTQ-S三重四極桿質(zhì)譜儀，Sciex公司；漩渦振蕩器，杭州米歐儀器有限公司；高速離心機，日立公司；超聲清洗器，寧波新芝生物科技有限公司；氮吹儀，北京優(yōu)晟；固相萃取裝置，上海靳瀾儀器制造有限公司；高精度電子天平，Mettler公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

挑選果實飽滿、無病蟲害和機械損傷的藍(lán)莓、草莓、葡萄柚，用超純水沖洗晾干，備用。稱取2.00g 水果樣品，加入含抗壞血酸和乙二胺四乙酸的80% 甲醇溶液，渦旋振蕩、超聲提取后離心，取上清液。殘渣用 4mol?L^-1NaOH 溶液水解，鹽酸調(diào)節(jié)pH 值，乙酸乙酯萃取，氮吹濃縮。用初始流動相溶解殘渣，過有機濾膜后待上機測定[2]。

1.3.2 固相萃取凈化

選用OasisHLB固相萃取柱，依次用甲醇、超純水活化，使樣品溶液以 1～2mImin^-1 的流速通過[3]。用 5% 甲醇水溶液淋洗除雜，甲醇洗脫目標(biāo)酚酸，氮吹濃縮后用初始流動相溶解，過濾后供高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

1.3.3 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱選用WatersAcquityUPLCBEHCl8柱，柱溫 35^°C 。流動相A為 0.1% 甲酸水溶液，B為乙腈，采用梯度洗脫，流速 0.3mL?min^-1 ，進(jìn)樣體積 2μL 。質(zhì)譜采用電噴霧離子源，負(fù)離子掃描和多反應(yīng)監(jiān)測模式，通過優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)品溶液確定各酚酸的檢測參數(shù)[4-5]。

1.3.4 方法學(xué)驗證

配制濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0ngmL^-1 和 500.0ngmL^-1 的酚酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照1.3.3的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在已知酚酸含量的水果樣品中添加低濃度（ sng^.g^-1. ）、中濃度（ 50ng?g^-1 ）、高濃度（ 200ng?g^-1 ）的酚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測定6次，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RelativeStandardDeviation，RSD），評估準(zhǔn)確度和精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。9種酚酸在 0.5～ 500.0ng?mL^-1 時， R² 均大于0.998，說明線性關(guān)系良好。以3倍信噪比（ S/N=3 ）計算方法檢出限，以10倍信噪比（ S/N=10 ）計算定量限，檢出限為 0.10～ 0.25ng?mL^-1 ，定量限為 0.33～0.83ng?mL^-1 車

2.2 回收率和精密度

由表2可知，在低、中、高3個加標(biāo)水平下，9種酚酸的回收率在 82.9%～ 116.2% ，RSD在2.4%～6.1% 。表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，能滿足水果中酚酸含量測定要求。

2.3 實際樣品測定

采用優(yōu)化后的方法對藍(lán)莓、草莓、葡萄柚中的酚酸含量進(jìn)行測定，每個水果品種重復(fù)測定3次，結(jié)果取平均值，具體數(shù)據(jù)見表3。藍(lán)莓中總酚酸含量最高，草莓次之，葡萄柚最低。不同水果中酚酸的組成和含量存在差異，可能與水果品種、生長環(huán)境、采摘時間等因素有關(guān)。

3結(jié)論

本文建立了高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定水果中9種酚酸含量的分析方法。通過對樣品前處理、色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化，該方法在 0.5～500.0ng?mL^-1 時，相關(guān)系數(shù) R² 均大于0.998，說明線性關(guān)系良好，檢出限為 0.10～0.25ng?mL^-1 ，定量限為 0.33～ 0.83ng?mL^-1 ，回收率在 82.9%～ 116.2% ，RSD在2.4%～6.1% ，具有良好的線性范圍、靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度。實際樣品測定結(jié)果表明，藍(lán)莓、草莓、葡萄柚3種水果中酚酸的組成和含量存在明顯差異藍(lán)莓中總酚酸含量最高，主要得益于其豐富的兒茶素和阿魏酸含量；草莓和葡萄柚的總酚酸含量相對較低。這些差異為水果品質(zhì)評價、營養(yǎng)分析以及功能性食品開發(fā)提供了重要的參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]嚴(yán)俊安，譚洪興，唐增煦，等.高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水果中13種酚酸[J].衛(wèi)生研究，2024，53（5）：790-796.

[2]周春紅，田毅，劉暢，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水果及其制品中9種禁用色素[J].現(xiàn)代食品，2024（19）：173-178.

[3]鐘永生，萬承波，朱欽，等.超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定食用農(nóng)產(chǎn)品（水果）中14種甜味劑含量[J].食品科技，2024，49（4）：315-321.

[4]劉超烽，林志藩，周玉玲.超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法快速測定熱帶水果飲料中的胭脂蟲紅[J]食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2023，14（15）：113-118.

[5]張敏，黃京平，趙文，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中24種酚酸和黃酮類化合物[J]分析測試學(xué)報，2022，41（11）：1636-1643.