高效液相色譜法測定烏雞中氟喹諾酮類藥物殘留量

Detection of Fluoroquinolone Residues in Black-Boned Chicken Using High-Performance Liquid Chromatography

HUANG Ruihong （Chongzuo Aquatic and Livestock Technical Service Center， Chongzuo 532200， China）

Abstract： A high-performance liquid chromatography （HPLC） method was established for detecting residues offourfluoroquinolones in black-boned chicken.Thechicken samples were minced，homogenized，andextracted using a phosphate bufer solution，followed by purification with solid-phase extraction columns.The analytes were then quantified via HPLC.Results showed that under optimal experimental conditions，the linear relationships for ciprofloxacin，danofloxacin，enrofloxacin，andsarafloxacin were excellent，with correlation coficients R² ） exceeding 0.999. The method demonstrated detection limits of 0.474 6μg?kg^-1 to 4.849μg?kg^-1 and quantification limits of 0.943 6μg?kg^-1 to 10.070μg?kg^-1 for the four target analytes. At three spiked concentration levels， the average recoveries of the four fluoroquinolones ranged from 80.38% to 101.70% ，with relative standard deviations between 0.46% to 1.52% .These findings indicate that the method is accurate，sensitive，and reliable，meeting the requirements for veterinary drug residue analysis.It provides a technical reference for detecting restricted and banned fluoroquinolones in animal-derived food products at the grassroots level.

Keywords： high-performance liquid chromatography （HPLC）; fluoroquinolones; black-boned chicken; drug residues

烏雞是廣西食用農產品“治違禁控藥殘促提升”三年行動部署中11個重點治理的品種之一，容易出現(xiàn)氟喹諾酮類藥物殘留超標。氟喹諾酮類藥物是一類人工合成的廣譜抗菌劑，具有高抗菌活性、低毒性以及在生物體內良好的組織滲透性，因此被廣泛應用于水產養(yǎng)殖、家禽和牲畜的疾病防控[1]，但當藥物殘留進人食物鏈后，會給人們的健康帶來潛在風險。因此，建立可行的獸藥殘留分析方法才能更好地開展風險監(jiān)控。目前，檢測雞肉中氟喹諾酮殘留的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法、氣相色譜質譜法和高效液相色譜等，其中高效液相色譜法《動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測高效液相色譜法》（農業(yè)部1025號公告—14—2008）是我國現(xiàn)行的國家標準檢測方法[2]。本文旨在開發(fā)并優(yōu)化一種基于高效液相色譜的分析方法，用于定量分析烏雞組織中4種典型氟喹諾酮類抗生素的殘留量，為基層開展動物農產品中氟喹諾酮類檢測技術提供了參考。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

烏雞肌肉樣品，廣西崇左市某養(yǎng)殖場。乙腈、甲醇，均為色譜純，ThermoScientific公司；磷酸，成都金山；氫氧化鈉，國藥集團；三乙胺、磷酸二氫鉀，均為分析純，廣東光華科技；水（二級水）；鹽酸環(huán)丙沙星標準品（批號：H0101310，純度99.8% ）、甲磺酸達氟沙星標準品（批號：0201210，純度 94.2% ）、沙拉沙星標準品（批號：H0181604，純度 99.6% ）、恩諾沙星標準品（批號：H0081907，純度 99.7% ），中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

LC-20A高效液相色譜儀（配RF-20熒光檢測器）、 C₁₈ 固相萃取柱，島津；HY-5A型數(shù)顯搖床，常州國華；3K15高速冷凍離心機，Sigma公司；XSR205DU分析天平、超純水機，梅特勒；微孔濾膜（ 0.45μm ），島津。

1.2溶液配制

1.2.1磷酸/三乙胺溶液、磷酸鹽緩沖溶液和流動相的配制

① 移取濃磷酸 3.4mL ，加水稀釋至 1000mL 三乙胺調節(jié) pH 值至2.4，得到 0.05mol?L^-1 磷酸／三乙胺溶液。 ② 磷酸鹽緩沖溶液。稱取磷酸二氫鉀6.8g ，加水溶解至 500mL ， 5.0mol?L^-1 氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值為 7.0 （204號 ③ 流動相。將 0.05molL^-1 的磷酸／三乙胺溶液與乙腈溶液以體積比為 78：22 進行混合。

1.2.2 標準系列溶液的配制

① 混合標準儲備液。分別準確稱取恩諾沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、沙拉沙星3種標準品各 0.025g （以主含量計）以及甲磺酸達氟沙星 0.005g （以主含量計），用 0.03mol?L^-1 氫氧化鈉溶液充分溶解并定容至25mL ，得到濃度為 1.0mgmL^-1 的恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星及 0.2mg?mL^-1 的達氟沙星4種混合標準儲備液。 ② 混合標準工作液。準確移取混合標準儲備液 2.0mL ，用乙腈定容至 100mL ，混合均勻后得到混合標準中間液，再準確吸取 5.0mL 混合標準中間液，用乙腈定容至 100mL 混合均勻后得到環(huán)丙沙星、沙拉沙星、恩諾沙星的濃度為 1.0μg?mL^-1 及達氟沙星的濃度為 0.2μg?mL^-1 的混合標準工作液。 ③ 分別準確吸取混合標準工作液50、100、200、400、 500μL 和 700μL 于 10mL 容量瓶中，用流動相準確定容得到環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星濃度梯度為 5，10，20，40，50ngmL^-1 和 70ng?mL^-1 及達氟沙星濃度梯度為1、2、4、8、10ng?mL^-1 和 14ng?mL^-1 標準系列溶液。

1.3樣品前處理

① 烏雞肉樣品處理。取出欄烏雞肉樣品，絞碎后均質，裝入樣品瓶中備用。 ② 提取。準確稱取0 2.00±0.05 ）g樣品于 50mL 離心管中，加入 10mL 磷酸鹽緩沖溶液，渦旋混合 2min ，于 300r?min^-1 振蕩 10min ， 10 000r?min^-1 離心 5min ；收集上清液至新離心管，殘渣重復提取1次，合并兩次提取液并充分混勻， 10 000r?min^-1 離心 5min ，即得樣品液，待用。 ③ 凈化。依次用 2mL 甲醇和 2mL 磷酸鹽緩沖溶液活化固相萃取柱，取 5.0mL 制備的樣品液過柱， 1mL 流動相洗脫并擠干，收集洗脫液，經(jīng) 0.45μm 微孔濾膜過濾后進樣分析。

1.4檢測條件

色譜柱： C₁₈ （ 250mm×4.6mm ， 5μm ）；熒光檢測器參數(shù)設置為激發(fā)波長 280nm/ 發(fā)射波長 465nm 色譜柱恒溫 30^qC ，流動相流速 0.8mL?min^-1 ，進樣體積 20μL 。

2 結果與分析

2.14種氟喹諾酮類藥物的色譜圖

由圖1、圖2可知，4種氟喹諾酮類藥物峰型較好，且分離完全，保留時間處無明顯干擾峰出現(xiàn)。

2.2 線性范圍

由表1可知，環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星在質量濃度為 5～70ng?mL^-1 ，達氟沙星在質量濃度為 1～14ng?mL^-1 時， R² 均 gt;0.999 ，說明線性關系良好。

2.3 靈敏度檢測

樣品空白獨立測試11次，計算檢測結果的標準偏差（S），檢出限為樣品空白平均值 +3S 的檢測濃度，定量限為樣品空白平均值 +10S 的檢測濃度。結果顯示，達氟沙星方法檢出限為 0.474 6μg?kg^-1 定量限為 0.943 6μg?kg^-1 ；環(huán)丙沙星方法檢出限為4.849μg?kg^-1 ，定量限為 10.070μg?kg^-1 ；恩諾沙星方法檢出限為 2.332μg?kg^-1 ，定量限為 4.178μg?kg^-1 ：沙拉沙星方法檢出限為 2.193μg?kg^-1 ，定量限為（204號 。

2.4 回收率和精密度

稱取同一陰性樣品若干份，4種藥物分別添加3個水平，每個添加水平做3個平行樣。由表2可知，4種氟喹諾酮類藥物的加標回收率為 80.38% ＼～101.70% ，相對標準偏差為 0.46%～1.52% 。說明該檢測方法回收率穩(wěn)定，精密度能滿足檢測要求。

3結論與討論

與普通肉雞不同，烏雞的消化道、氣管、肌肉、腸系膜和骨膜等多個器官含有黑色素，對氟喹諾酮類藥物的代謝慢[3]。氟喹諾酮類藥物易與黑色素結合，恩諾沙星藥物對于烏雞肌肉、皮脂黑色素含量高的組織需要更長的休藥期[4-6?，F(xiàn)有關于恩諾沙星等藥物在雞體內代謝的研究數(shù)據(jù)主要來源于白羽肉雞模型，在烏雞中有適用局限性。

本研究采用高效液相色譜法測定烏雞中4種典型氟喹諾酮類獸藥殘留，烏雞中環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星藥物含量線性回歸方程 R² 均大于 0.999 ；4種藥物的方法檢出限為 0.4746～4.849μg?kg^-1 ，定量限為 0.9436～ 10.070μg?kg^-1 ，在3個添加量水平下，4種藥物的平均回收率為 80.38%～ 101.70% ，相對標準偏差為0.46%～1.52% 。結果表明，該方法的準確度高、靈敏度佳、穩(wěn)定性好，為基層農產品質量安全中氟喹諾酮類藥物殘留的日常檢測工作提供質量控制參考。

參考文獻

[1]朱莉萍，朱濤，武娜，等.高效液相色譜法測定豬肉中氟喹諾酮類藥物[J].肉類研究，2011，25（10）：29-31.

[2]中華人民共和國農業(yè)部.動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測高效液相色譜法：農業(yè)部1025號公告—14—2008[S].北京：中國農業(yè)出版社，2008.

[3]張璐，鞏忠福，張玉潔，等.烏雞中氟喹諾酮類藥物殘留現(xiàn)狀分析[J].中國獸藥雜志，2023，57（10）：79-82.

[4]趙琳，張大文，張瑞英，等.恩諾沙星在余干烏雞不同組織中的殘留消除規(guī)律研究[J食品安全質量檢測學報，2022，13（4）：1327-1333.

[5]ONOC，TANAKAM.Bindingcharacteristiesof fluoroquinosynthetie to synthetic levodopa melanin[J].J Pham Pharmacol，2003，55（8）：1127-1133.

[6]高志存，石露莎，余舒寧，等.動物源性食品中8種氟喹諾酮類藥物多殘留高效液相色譜檢測方法的建立[J]中國動物檢疫，2023，40（7）：116-120