超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)保健品中的二氟拉松丙酸酯

Determination of Diflorasone Propionate in Health Products byUltra PerformanceLiquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

MA Xin， WU Junfa， PAN Zhiqi， QIN Yuxin （Guangzhou Inspectionand Testing Certification Group Co.，Ltd.，National Quality Inspection and Testing Center for Processed Food （Guangdong）， Guangzhou 511447， China）

Abstract： Objective： To establish an ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of diflurazone-17-propionateand diflulazone-2l-propionate in health products. Method： The samples were extracted by ultrasonication or vortexing of acetonitrile and 70% acetonitrile， eluted and separated by Waters BEH- ?C₁₈ column （100mm×2.1mm，3.0μm） ， and then determined by electrospray ionization source.Result： The linear relationship between the two diflularsone propionate esters was good in the range of 2.0～ 100.0μg?L^-1 ，and the correlation coefficient R²?0.9987. ，and the average recoveries were 72.3%～92.3% and the relative standard deviations were 4.43%～8.09% under the three spike levels.The limit of detection of solid tablets was 15μg?kg^-1 and the limit of quantification was 40μg?kg^-1 . The limit of detection and quantification of oil-based capsules was 30μg?kg^-1 and 100μg?kg^-1 .Conclusion： This method has short time， low solvent consumption， high recovery，sensitivity and precision，and can accurately analyze difulasone propionate in health care products.

Keywords： ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; health; simultaneous detection; diflulasone propionate

二氟拉松（Diflorasone）及其酯類作為一種高效的皮質(zhì)類固醇激素制劑，展現(xiàn)出卓越的抗炎、抗瘙癢特性，同時(shí)兼?zhèn)滹@著的免疫抑制與縮血管功能，因此在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用于治療多種頑固性與復(fù)雜性皮膚病[1-2]，為患者提供了有效的緩解與治療方案，顯著改善了患者的皮膚健康狀況。目前，二氟拉松在保健品范疇內(nèi)的長(zhǎng)期使用安全性尚缺乏充分評(píng)估。若長(zhǎng)期或過(guò)量攝入，可能誘發(fā)皮膚萎縮、褶皺形成、毛囊炎以及痤瘡等一系列不良皮膚反應(yīng)[3-5]，從而違背保健品保障健康的初衷。

對(duì)于皮質(zhì)類固醇激素的測(cè)定方法主要有液相色譜法[6-7]、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法[8-10]。其中，液相色譜法檢測(cè)成本低，但分離難度大、耗時(shí)較長(zhǎng)，且譜圖容易受到雜質(zhì)峰的干擾，影響分析效果，方法整體靈敏度普遍較低，對(duì)于含量為ppb級(jí)別的樣品難以檢出?；诖耍狙芯拷⒘瞬捎贸咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra-PerformanceLiquidChromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）測(cè)定保健品中二氟拉松-17-丙酸酯和二氟拉松-21-丙酸酯的方法，旨在為后續(xù)二氟拉松的系列化合物測(cè)定提供技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

保健食品：廣州市超級(jí)市場(chǎng)及跨境電商平臺(tái)。

二氟拉松 -17- 丙酸酯、二氟拉松-21-丙酸酯標(biāo)準(zhǔn)品：純度大于 98% ，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甲酸、甲醇、乙腈、正己烷及乙酸乙酯：色譜純，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.2儀器與設(shè)備

SCIEX 5500+ 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)SCIEX公司；LC-30AD液相色譜系統(tǒng)：日本島津公司；Milli-QAdvantageA10超純水系統(tǒng)：法國(guó)默克密理博公司；4k-15高速離心機(jī)：德國(guó)西格瑪公司；KQ-800DB超聲波清洗儀：昆山超聲儀器有限公司；MultiReax渦旋振蕩器：德國(guó)海道夫公司。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取二氟拉松-17-丙酸酯、二氟拉松-21-丙酸酯標(biāo)準(zhǔn)品各 10mg ，分別置于10mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，制成 1000mg^-L^-1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確移取二氟拉松-17-丙酸酯、二氟拉松-21-丙酸酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用乙腈配制得到質(zhì)量濃度為 10mg?L^-1 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：使用空白基質(zhì)提取液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制濃度為 2.0，5.0，10.0，20.0，50.0μgL^-1 和 100.0μg?L^-1 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 前處理方法

（1）固體保健食品。樣品粉碎過(guò)80目篩，備用。稱取 0.5g 樣品于 50mL 離心管中，加入 10mL 乙腈，渦旋振蕩 1min 。超聲提取 20min ， 10 000r?min^-1 離心 5min 。上清液經(jīng) 0.22μm 濾膜過(guò)濾，濾液作為供試品用UPLC-MS/MS測(cè)定。

（2）油基保健食品。稱取 0.2g 樣品于 50mL 離心管中，加入 2mL 正己烷，渦旋分散均勻后，加入5mL 的 70% 乙腈，渦旋振蕩 3min ， 10 000r?min^-1 離心 5min ，吸取下層溶液至 10mL 具塞比色管中，上層正己烷層用 5mL 的 70% 乙腈溶液重復(fù)提取一次，合并兩次溶液，加 70% 乙腈溶液定容至刻度，混勻，經(jīng) 0.22μm 濾膜過(guò)濾后，濾液作為供試品用UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.5 測(cè)定條件

1.5.1 色譜條件

Waters BEH- ?C₁₈ 色譜柱（ 100mm×2.1mm ，3.0μm ）；流動(dòng)相A為 0.1% 甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流速為 0.3mL?min^-1 ；色譜柱柱溫： 40% ：進(jìn)樣量： 5μL ；洗脫方式：梯度洗脫。洗脫程序： 0～ 4.0min ， 70%20%A ； 4.0～7.0min ， 20% 0%A ： 7.0～9.0min ， 0%A ： 9.0～9.5*min ， 0%70% A； 9.5～13.0min ， 70%A 。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；監(jiān)測(cè)模式：正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MultipleReactionMonitoring，MRM），監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)參數(shù)見表1。電噴霧電壓：5500V ；氣簾氣壓： ；霧化氣壓力： 50psi 輔助氣壓力： 50psi ；離子源溫度： 500°C 。

2 結(jié)果與分析

2.1測(cè)定條件及參數(shù)的確定

用乙腈配制 1mg?L^-1 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用直接注射的方式注入離子源，對(duì)母離子形態(tài)進(jìn)行初步掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種二氟拉松丙酸酯在正和負(fù)離子模式下均有響應(yīng)，而正離子模式的響應(yīng)比負(fù)離子更強(qiáng)，其中加氫模式的響應(yīng)大于加銨和加鈉，因此最終選擇 [M+H]⁺ 為母離子，同時(shí)在流動(dòng)相中加入甲酸，以促進(jìn)離子化。兩種二氟拉松丙酸酯的提取離子流圖見圖1。

2.2不同溶劑回收率考察

使用甲醇、乙腈、乙酸乙酯以及不同比例的乙腈溶液對(duì)不同的基質(zhì)樣品進(jìn)行提取，考察不同溶劑對(duì)回收率的影響。油基基質(zhì)因?yàn)橛偷母蓴_，提取難度較大，回收率相對(duì)固體樣品也較低，因此需要使用乙腈水作為溶劑提取，以此來(lái)提高提取溶液的極性，從而減少脂溶性雜質(zhì)的提取。由表2可知，對(duì)于固體片劑樣品，乙腈的回收率明顯比甲醇和乙酸乙酯高，說(shuō)明兩種二氟拉松丙酸酯的極性和乙腈最接近。對(duì)于油基膠囊樣品來(lái)說(shuō)，純甲醇和純乙腈的提取效果明顯較低，進(jìn)一步使用不同比例的乙晴溶液進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn) 70% 的乙腈溶液對(duì)目標(biāo)物的回收率最高，因此最終使用該比例對(duì)油基樣品進(jìn)行提取。

2.3提取方式的選擇

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)比了超聲提取、渦旋振蕩提取和水平振搖提取3種提取方式對(duì)目標(biāo)物質(zhì)回收率的影響。由表3可知，對(duì)于固體片劑，超聲提取的回收率最高，渦旋振蕩與之相當(dāng)；油基膠囊由于體系中分為液液兩相，超聲方式難以使其充分混合，故渦旋振蕩的提取效率更佳。最終選擇超聲提取方式提取固體片劑樣品，渦旋振蕩的方式提取油基膠囊樣品。

2.4線性方程和檢出限、定量限

使用空白基質(zhì)曲線配制不同濃度的二氟拉松丙酸酯混合標(biāo)準(zhǔn)，采用UPLC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定，對(duì)應(yīng)的濃度和測(cè)得的定量離子峰面積用于擬合曲線方程；按照儀器3倍和10倍信噪比測(cè)得檢出限與定量限，得到的相關(guān)結(jié)果見表4。可以看出，各目標(biāo)物質(zhì)在 2.0～ 100.0μgL^-1 線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù) R² 均 ?0.9987 。固體片劑檢出限為 15μg?kg^-1 ，定量限為 40μg?kg^-1 。油基膠囊檢出限為 30μg?kg^-1 ，定量限為 100μg?kg^-1 。

2.5 回收率

為驗(yàn)證測(cè)定方法的準(zhǔn)確性，對(duì)片劑和魚油膠囊進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。以其樣品類型對(duì)應(yīng)的定量限的1倍、2倍和10倍進(jìn)行添加，結(jié)果見表5?？梢钥闯?，兩種二氟拉松丙酸酯的平均回收率在 72.3% ＼～92.3% ，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在 4.43%～8.09% ，說(shuō)明該方法回收率和重復(fù)性均能達(dá)到檢測(cè)要求。

表3不同提取方式的回收率結(jié)果 單位： %

3結(jié)論

實(shí)驗(yàn)分別用乙腈和 70% 的乙晴水溶液對(duì)保健品片劑和油基膠囊進(jìn)行提取，以甲酸水溶液和乙腈作為流動(dòng)相體系，二氟拉松-17-丙酸酯和二氟拉松-21-丙酸酯峰型良好，且響應(yīng)較強(qiáng)；選擇不同的碎片離子進(jìn)行定量分析，降低了色譜的分析要求；方法的回收率、靈敏度和精密度高，可準(zhǔn)確測(cè)定不同類型保健品中的二氟拉松丙酸酯。

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