乳粉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌能力驗(yàn)證結(jié)果及關(guān)鍵環(huán)節(jié)分析

Ability Validation Results and Key Link Analysis of Listeria monocytogenes in Milk Powder

JIANGJiaxi，HUANGZhishen，WANGYaqiYINWeilu，LIANGeidan （Guangzhou Food Inspection Institute， Guangzhou 5114oo， China）

Abstract： The laboratory participated in the Listeria monocytogenes detection ability verification project led by the National Institutes for Food and Drug Control.It was implemented inaccordance with GB 4789.30—2016and verified by real-time fluorescence PCR.The results showed that Listeria monocytogenes was not detected in sample FC0220092，and Listeria monocytogenes was detected in sample FC0222010.The testresults wereconsistent with the results published by the National Institutes for Food and Drug Control，and satisfactory results were obtained.

Keywords： milk powder; Listeria monocytogenes; ability verification; key link analysis

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes，LM），簡稱單增李斯特氏菌，是一種高致病性食源性人畜共患病原體，因其極端環(huán)境適應(yīng)性與臨床危害性已成為全球公共衛(wèi)生安全的重要挑戰(zhàn)。該菌能在 -1.5～42^°C 生存，并且能在 4‰ 條件下仍保持繁殖能力。人類食用被單增李斯特氏菌污染的食物后，可能會(huì)引起腸胃病、腦膜炎、敗血癥、孕婦流產(chǎn)等疾病，感染后的病死率為 30%～70% ，嬰幼兒、孕婦、老年人等免疫力低下人群更容易感染該菌[1-3]。該菌在自然界中廣泛存在，主要污染魚、肉、蛋、奶以及海產(chǎn)品及制品、蔬菜沙拉、冷凍食品等，給食品安全帶來很大風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。我國2020—2022年國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，生鮮畜禽制品中單增李斯特氏菌陽性率高達(dá) 1.7%～3.4% ，顯著高于歐盟同期水平（ 0.8%～ 1.2% ），引起國家和相關(guān)部門的廣泛關(guān)注。因此，確保食品中單增李斯特氏菌檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確率，是食品檢測機(jī)構(gòu)能力建設(shè)的關(guān)鍵任務(wù)。

能力驗(yàn)證是評(píng)定和監(jiān)督實(shí)驗(yàn)室和檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)技術(shù)能力的重要方式之一，對(duì)實(shí)驗(yàn)室和檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)是一種有效的外部質(zhì)量保證活動(dòng)，也是內(nèi)部質(zhì)量控制技術(shù)的補(bǔ)充[。通過能力驗(yàn)證，能夠更加有效地評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室的檢測能力，不斷改進(jìn)和提升實(shí)驗(yàn)室的能力水平。本實(shí)驗(yàn)室承擔(dān)廣州市監(jiān)督抽檢餐飲、流通、生產(chǎn)環(huán)節(jié)各類食品的檢測任務(wù)，為了考核實(shí)驗(yàn)室單增李斯特氏菌檢測能力，積極參與中國食品藥品檢定研究院舉辦的能力驗(yàn)證活動(dòng)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

樣品由中國食品藥品檢定研究院提供，編號(hào)分別為FC02220092和FC02220010，樣品為白色球狀、真空包裝于西林瓶，對(duì)應(yīng)基質(zhì)為2袋奶粉，每份

單增李斯特氏菌（ATCC19115）、英諾克李斯特氏菌（ATCC33090）、斯氏李斯特氏菌（CICC21671）以及伊氏李斯特氏菌（CICC21663）、馬紅球菌（ATCC6939）與金黃色葡萄球菌（ATCC25923），標(biāo)準(zhǔn)菌株均來自國家食品安全菌種保藏中心。

李氏增菌肉湯基礎(chǔ)及配套試劑、革蘭氏染色液、血平板、單增李斯特氏菌生化鑒定試劑，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；李斯特菌顯色培養(yǎng)基，法國科馬嘉公司；PALCAM瓊脂基礎(chǔ)及配套添加劑，以及 0.6% 酵母膏的胰酪肺大豆瓊脂，北京陸橋公司；VITEK2鑒定卡，法國梅里埃公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒；天根生化科技公司； 2× TaqMan qPCR MasterMix，上海東洋紡公司；引物探針，北京六合一華大基因生物公司。

1.2儀器與設(shè)備

高壓滅菌鍋，廈門致微公司；生化培養(yǎng)箱，德國賓得公司；VITEK2COMPACT全自動(dòng)微生物鑒定儀器，法國梅里埃公司；生物顯微鏡，德國徠卡公司；ⅡI級(jí)A2型1376生物安全柜、NANODROPONE超微量分光光度計(jì)，美國ThermoFisherScience公司；96CFXtouch實(shí)時(shí)熒光PCR儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的處理

按照作業(yè)指導(dǎo)書的要求，對(duì)樣品進(jìn)行如下處理在生物安全柜中，將 225mLLB₁ 增菌液倒入無菌均質(zhì)袋，采用無菌操作打開西林瓶，將小球加入 LB₁ 增菌液中，待小球完全溶解后，將與西林瓶編碼一致的奶粉基質(zhì)樣品加入 LB₁ 增菌液中，進(jìn)行充分均質(zhì)，確保樣品均勻，該樣品對(duì)應(yīng)的待檢量為 25g 。陽性對(duì)照增菌液通過將標(biāo)準(zhǔn)菌株單增李斯特氏菌（ATCC19115）加入 LB₁ 增菌液中制備，陰性對(duì)照增菌液則是將標(biāo)準(zhǔn)菌株英諾克李斯特氏菌（ATCC33090）加入LB₁ 中制備?？瞻讓?duì)照增菌液不加入任何試劑和菌株。

1.3.2 增菌與分離

參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》（GB4789.30—2016）[7開展前增菌，取培養(yǎng) 24h 后的 LB₁ 增菌液0.1mL 轉(zhuǎn)種于 10mLLB₂ 增菌液內(nèi)，然后用接種環(huán)取培養(yǎng)后 LB₂ 增菌液劃線于李斯特顯色平板和PALCAM瓊脂平板， LB₁ 和 LB₂ 增菌液于 （ 培養(yǎng) 24h ，李斯特顯色平板和PALCAM瓊脂平板于（ 36±1 ） °C 培養(yǎng) 48h 。

1.3.3 生化鑒定

挑取李斯特氏菌顯色平板和PALCAM平板的可疑菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，并開展木糖和鼠李糖的初步生化試驗(yàn)，對(duì)木糖檢測結(jié)果為陰性、鼠李糖檢測檢測結(jié)果陽性的菌落，再利用VITEK2compact系統(tǒng)開展生化鑒定、染色鏡檢、溶血及協(xié)同溶血試驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)。

1.3.4實(shí)時(shí)熒光PCR檢測

取 LB₁ 培養(yǎng)液 2mL 于 2.0mL 無菌離心管中，離心去除培養(yǎng)基，依照細(xì)菌DNA快速提取試劑盒操作DNA提取，并利用超微量紫外分光光度計(jì)對(duì)核酸進(jìn)行濃度和質(zhì)量測定，確?；蚪MDNA的 OD₂₆₀/ OD₂₈₀ 均在 1.7～2.0 ， -20^°C 保存?zhèn)溆谩?/p>

參考《出口食品中食源性致病菌檢測方法實(shí)時(shí)熒光PCR法》（SN/T1870—2016）[單增李斯特氏菌的引物探針序列，正向引物序列為5’-ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG-3’，反向引物序列為 5^° -CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT-3’探針序列為5’-CGCGACCGAAGCCAACTA-3’其中探針的 5^° 端標(biāo)記FAM， ₃? 端標(biāo)記TAMRA。

采用實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)單增李斯特氏菌進(jìn)行檢測，反應(yīng)體系 25μL ：預(yù)混液 12.5μL ，正反向引物1μL ，探針（ 10μmol?L^-1 ） 1μL ，模板DNA 2μL ，補(bǔ)水至 25μL 。反應(yīng)條件： ，1個(gè)循環(huán); 個(gè)循環(huán)，收集熒光信號(hào)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)采用陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、空白對(duì)照進(jìn)行質(zhì)量控制，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)2次。

2 結(jié)果與分析

2.1增菌培養(yǎng)和平板分離結(jié)果

LB₂ 增菌液劃線接種于李斯特氏菌屬顯色平板和PALCAM平板上的菌落形態(tài)特征見表1和圖1，樣品FC02220092在顯示平板上為藍(lán)色圓形菌落、無暈圈，在PALCAM平板為灰綠色圓形菌落；而樣品FC02220010在顯示平板為藍(lán)色圓形菌落、有白色暈圈，在PALCAM平板為灰綠色圓形菌落，初步判定樣品FC02220010可能含有單增李斯特氏菌，但為了防止漏檢，對(duì)兩個(gè)編號(hào)的樣品均開展生化鑒定。

2.2生化鑒定結(jié)果分析

從樣品FC02220092、FC02220010的顯示平板和PALCAM平板中分別挑選5個(gè)典型或可疑菌落于TSA-YE平板中進(jìn)行純化培養(yǎng)，然后開展木糖、鼠李糖初步生化鑒定，結(jié)果符合開展VITEK生化鑒定、溶血實(shí)驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)以及鏡檢，結(jié)果見表2。綜合VITEK鑒定、革蘭氏染色結(jié)果、溶血和協(xié)同溶血試驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果，樣品FC02220092未檢出單增李斯特氏菌，而樣品FC02220010檢出單增李斯特氏菌，陰陽性對(duì)照生化鑒定結(jié)果符合質(zhì)量控制的要求。

2.3實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果

對(duì)樣品FC02220092、FC02220010、陰陽性對(duì)照、空白對(duì)照的 LB₁ 增菌液進(jìn)行DNA提取，然后按照1.3.4的體系和條件開展實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，檢測結(jié)果見圖2。樣品FC02220010有明顯的S型擴(kuò)增曲線，而FC02220092未獲得S型擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、空白對(duì)照結(jié)果符合質(zhì)量控制要求，說明樣品FC02220092未檢出單增李斯特氏菌，而樣品FC02220010檢出單增李斯特氏菌。

2.4 結(jié)果報(bào)告

根據(jù)國標(biāo)法和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果，可判定樣品FC02220092未檢出單增李斯特氏菌，樣品FC02220010檢出單增李斯特氏菌。檢測結(jié)果與中國食品藥品檢定研究院公布的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說明本實(shí)驗(yàn)室成功通過單增李斯特氏菌能力驗(yàn)證。

3結(jié)論與討論

能力驗(yàn)證是檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，能夠有效監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室檢測過程中人、機(jī)、料、法、環(huán)等要素的可靠性和結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過參加能力驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)室可以有效提高檢測能力水平。本研究采用國家標(biāo)準(zhǔn)法和實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)2個(gè)能力驗(yàn)證樣品進(jìn)行單增李斯特氏菌檢測，兩種檢測方法的結(jié)果完全符合，樣品FC02220092的檢測結(jié)果未檢出單增李斯特氏菌，樣品FC02220010檢出單增李斯特氏菌，且能力驗(yàn)證最終獲得滿意評(píng)價(jià)。

在進(jìn)行單增李斯特氏菌能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)注意以下幾個(gè)方面。 ① 提前做好實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需的培養(yǎng)基，并按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》（GB4789.28—2024）對(duì)其進(jìn)行技術(shù)驗(yàn)收。 ② 實(shí)驗(yàn)操作必須在生物安全柜內(nèi)，兩個(gè)樣品的處理需形成空間隔離或時(shí)間隔離，避免交叉污染。 ③ 重點(diǎn)關(guān)注李斯特氏菌屬顯色平板的菌落形態(tài)。PALCAM平板無法區(qū)分李斯特氏菌屬的細(xì)菌，而單增李斯特氏菌在顯色平板形成藍(lán)綠色并具有白色暈圈的特征性菌落，從肉眼上較容易觀察[9]。 ④ 溶血實(shí)驗(yàn)過程中做好陰陽性對(duì)照，穿刺不要觸到底部，避免瓊脂破裂造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果假陽性。⑤ 采用多種鑒定方法開展能力驗(yàn)證試驗(yàn)，本次能力驗(yàn)證綜合運(yùn)用傳統(tǒng)培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)熒光PCR方法，兩種方法檢測結(jié)果完全相符，確保了結(jié)果的可靠性。

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