水稻苗期耐冷主效QTL的鑒定

水稻是世界上主要糧食作物之一，低溫是影響水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、品質(zhì)和限制水稻復(fù)種面積擴(kuò)大的主要因素之一。水稻最適宜生長溫度為 25～ 30^°C ，在其生長過程中極易受到冷害，即使在溫度適宜區(qū)種植水稻，連續(xù)的低溫也會對水稻的生長和產(chǎn)量造成影響。水稻冷害包括延遲型冷害、障礙型冷害和混合型冷害[1]，其中苗期是水稻延遲型冷害的關(guān)鍵時期，水稻苗期遭遇冷害，表現(xiàn)出葉片發(fā)黃、分蘗減少、根系活性降低等[2]。因此，尋找具有較強(qiáng)耐冷性優(yōu)勢的等位基因，最終提高植物的耐冷性是解決這一問題的關(guān)鍵。

近年來，對水稻苗期耐冷QTL的研究有了顯著進(jìn)展，確定了一系列影響耐冷性的關(guān)鍵基因座。qLTG3-1位于第3號染色體，被認(rèn)為與水稻種子萌發(fā)期的耐冷性相關(guān)。研究表明， qLTG3-1 影響種子的生長素和赤霉素代謝，提高種子在低溫下的發(fā)芽速率[3]。qCTS-9位于第9號染色體上，與苗期耐冷性有關(guān)。通過對不同種質(zhì)資源的分析，發(fā)現(xiàn) qCTS–9 可以增強(qiáng)水稻幼苗在寒冷環(huán)境下的抗逆性，減少冷害損傷[4]。此外， qCT-10 位于第10號染色體，與水稻幼苗期耐冷性相關(guān)。研究表明，攜帶 qCT-10 的水稻品種在低溫脅迫下具有更好的生長表現(xiàn)，并通過提高抗氧化酶活性，減輕氧化損傷[5]。qCTS6位于第6號染色體，影響水稻苗期耐冷性。該QTL調(diào)控孕穗和抽穗階段的冷害耐受性，特別是在幼苗期起到關(guān)鍵作用，有助于增強(qiáng)整體耐冷性。COLD1是G蛋白信號通路上的一個基因，位于第6號染色體，通過調(diào)控鈣離子的內(nèi)流，來調(diào)控冷信號傳導(dǎo)。該基因的功能可以顯著增強(qiáng)水稻幼苗的耐冷性，尤其是在低溫條件下[6]。這些耐冷QTL的研究不僅揭示了水稻苗期對寒冷氣候的適應(yīng)機(jī)制，還為育種提供了目標(biāo)基因。黑龍江省位于我國高緯度地區(qū)，冷害頻發(fā)。截至目前，影響該地區(qū)水稻資源中的耐冷基因位點(diǎn)并不明晰。黑龍江省五常市位于東北中部 （40^°N～45^°N） ）的世界黃金水稻帶上，培育的香稻品種稻花香2號，米粒飽滿、香味濃郁，是中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品[。龍粳21是稈強(qiáng)寡蘗型耐寒品種，于2008年審定推廣，是黑龍江省第二、第三積溫帶主栽品種[8]。

本研究通過以稻花香2號為母本，耐冷的龍粳21為父本，構(gòu)建群體材料，鑒定水稻苗期耐冷性，通過重測序分析，獲取關(guān)聯(lián)區(qū)間，并對區(qū)間內(nèi)的基因進(jìn)行變異分析和功能注釋。為進(jìn)一步揭示苗期耐冷的遺傳調(diào)控提供研究基礎(chǔ)。同時，研究水稻苗期耐冷性有助于了解水稻對低溫的生理和分子反應(yīng)，為未來培育更多高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)且抗逆的品種提供重要的數(shù)據(jù)支持。

材料與方法

1.1 材料

以稻花香2號為母本、耐冷的龍粳21為父本，構(gòu)建的包含530個 F_2：3 群體為研究材料。這些材料來自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)。試驗(yàn)于2023年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)盆栽場 （45^°74^′N，126^°71^′E） 進(jìn)行，采用盆栽方式種植。

1.2 耐冷性鑒定

將種子在 40°C 下處理約 36h 以打破休眠，然后在 30^°C 的去離子水中浸泡約 ^72h 進(jìn)行發(fā)芽處理。將發(fā)芽的種子移植到96孔PCR板中，在溫室環(huán)境（溫度白天 26^°C /夜間 光/暗循環(huán)和 80% 相對濕度）中培養(yǎng)幼苗。當(dāng)幼苗生長到三葉一心時，在培養(yǎng)箱中對其進(jìn)行 的低溫處理 10d [9]，并將所有530株 F_2：3 幼苗在28°C 下恢復(fù)生長 10d ，并調(diào)查植株存活率（以存活的總幼苗數(shù)/總株數(shù)）。試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 耐冷QTL分析

使用CTAB法進(jìn)行DNA的提取[10]，單獨(dú)種植并收集 F_2：3 個體的所有幼葉，進(jìn)行總基因組DNA提取。根據(jù) F_2：3 群體的存活率，選擇30個極端耐冷和30個極端冷敏感個體的基因組DNA作為兩個DNA池。使用Nanodrop200O分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）對分離的DNA進(jìn)行定量分析。將兩個混合樣本送廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行高通量測序。使用生物信息學(xué)工具處理測序數(shù)據(jù)，包括質(zhì)量控制、比對到參考基因組、變異檢測（SNPs和Indels）。比較兩個Bulk間的變異頻率差異，使用統(tǒng)計(jì)或生物信息學(xué)方法（GATK的SelectVariants工具）來分析與耐冷相關(guān)的區(qū)間[11]。

1. 4 候選基因的預(yù)測

通過比較耐冷和不耐冷水稻品種的基因組差異，鑒定與水稻苗期耐冷性相關(guān)的候選基因。這些基因包括轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)控蛋白和代謝調(diào)控相關(guān)基因等，可能參與水稻耐冷的調(diào)控機(jī)制。為了預(yù)測耐冷的候選基因，綜合考慮了以下3種策略。（1）使用親本的全基因組DNA重測序數(shù)據(jù)庫進(jìn)行候選基因預(yù)測，以比較QTL區(qū)域內(nèi)基因的DNA序列；（2）在QTL區(qū)域重點(diǎn)關(guān)注雙親之間具有非同義突變SNPs的基因；（3）利用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫對候選區(qū)間進(jìn)行注釋分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本耐冷性差異比較

親本幼苗生長到三葉一心時，在培養(yǎng)箱中對其進(jìn)行 9°C 的低溫處理10d，并將所有幼苗在28°C 下恢復(fù)生長10d，如圖1所示，稻花香2號葉片變黃枯萎，龍粳21冷處理后，葉片生產(chǎn)不受影響，耐冷性明顯強(qiáng)于稻花香2號。

2.2 水稻苗期耐冷主效QTL定位

本研究共鑒定到4個QTL區(qū)間，分別位于5號和7號染色體上，由表1和圖2、圖3可知，5號染色體發(fā)現(xiàn)了3個QTL，區(qū)間分別為 3.8Mb（4.4～ 8.2Mb）…1.2Mb（10.1-11.3Mb） 和 1.6Mb（12.2～ 13.8Mb ），7號染色體發(fā)現(xiàn)了1個QTL，區(qū)間為2.4Mb（2.8～5.2Mb） 。

在5號和7號染色體鑒定的4個QTL區(qū)間內(nèi)，共注釋到215個預(yù)測基因（5號染色體上的3個QTL區(qū)間上分別定位到76，40和32個對應(yīng)基因；7號染色體定位的1個QTL區(qū)間共計(jì)67個對應(yīng)基因）。通過SNP和Indel分析，篩選出63個基因在兩個親本間存在顯著遺傳差異（篩選條件：|ΔSNP-index|gt;0.3，Plt;0.01） 。

CDS區(qū)域差異基因32個：包含非同義突變28個、移碼突變3個及終止密碼子提前1個。例如，5號染色體區(qū)間內(nèi)的基因 LOC_-OsO5g12340 （編碼類受體激酶）存在非同義突變（ GA ，導(dǎo)致甘氨酸 $$ 谷氨酸），推測可能影響其激酶活性。

調(diào)控區(qū)域差異基因31個：主要分布于啟動子區(qū)18個和UTR區(qū)13個。例如，7號染色體區(qū)間內(nèi)的基因 （編碼bZIP轉(zhuǎn)錄因子）的啟動子區(qū)存在SNP（T變?yōu)镃），可能增強(qiáng)低溫響應(yīng)元件的結(jié)合能力。

功能候選基因12個：優(yōu)先選擇CDS區(qū)域存在結(jié)構(gòu)變異且注釋與耐冷機(jī)制相關(guān)的基因，如能量代謝相關(guān)酶（如淀粉磷酸化酶）、膜脂代謝調(diào)控蛋白（如磷脂酶D）。

表達(dá)候選基因8個：聚焦調(diào)控區(qū)存在變異且注釋為轉(zhuǎn)錄因子（如MYB、NAC家族）或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的基因，推測其通過調(diào)控低溫響應(yīng)通路發(fā)揮作用。

GO富集：CDS差異基因顯著富集于“能量代謝過程” （GO_：0006118，P=2.1×10^-5 ）和“膜脂重塑” （GO_：0010587，P=3.4×10^-4 ）；調(diào)控差異基因主要參與低溫響應(yīng) （GO_：0009409，P=1_： 8×10^-3 ）及ROS清除（GO：0019430， P=4 .2×10^-3 ）。

KEGG通路：CDS差異基因富集于“淀粉與蔗糖代謝”（ ko00500 ）和“脂肪酸降解”（ ko000071） ；調(diào)控差異基因集中于“MAPK信號通路\"（ko04016）和\"植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)” （ko04075） 。

2.3 GO注釋分析結(jié)果

通過對上述區(qū)間進(jìn)行功能注釋，發(fā)現(xiàn)GO分析中生物過程包括代謝過程、細(xì)胞過程、單一組織過程、對刺激的反應(yīng)、發(fā)展過程、多細(xì)胞生物過程、定位、生物調(diào)節(jié)、復(fù)制、生物過程調(diào)控、信號器、細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生、生殖過程、生長、多生物體過程、習(xí)性，其中代謝過程的基因數(shù)量最多，習(xí)性過程基因數(shù)量最少。細(xì)胞成分包括細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞器、膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞器部分、大分子絡(luò)合物、胞外區(qū)，其中細(xì)胞的基因數(shù)量最多，胞外區(qū)基因數(shù)量最少。分子功能包括結(jié)合、催化活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、結(jié)構(gòu)分子活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、分子功能調(diào)節(jié)劑、分子傳感器活性，其中結(jié)合功能的基因數(shù)量最多，分子傳感器活性基因數(shù)量最少（圖4）。

2.4 KEGG代謝通路注釋

KEGG注釋顯示，富集程度最高的代謝包括全局圖與概覽圖、碳水化合物代謝、核苷酸代謝、萜類和聚酮化合物的代謝、氨基酸代謝、輔因子和維生素的代謝、其他次生代謝物的生物合成、脂代謝、能量代謝、聚糖生物合成與代謝和其他氨基酸的代謝。其中全局與概述圖譜基因數(shù)量最多，其他氨基酸的代謝基因數(shù)量最少。遺傳信息過程包括翻譯、折疊、分類、降解、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和修復(fù)。其中翻譯所含基因數(shù)量最多，復(fù)制和修復(fù)基因數(shù)量最少。環(huán)境信息過程包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞過程包括運(yùn)輸和分解代謝，有機(jī)系統(tǒng)包括環(huán)境適應(yīng)（圖5）。

3討論

水稻苗期是營養(yǎng)生長的關(guān)鍵期，然而，易受低溫影響，位于高緯度的黑龍江省和高海拔的云南省等地，水稻苗期冷害是造成水稻減產(chǎn)的重要因素之一[12-13]。此外，在華南和長江中下游的雙季稻區(qū)，降溫或持續(xù)低溫陰雨天氣，也常造成秧苗不同程度受損[14]。因此，水稻苗期冷害已成為制約產(chǎn)量的重要因素之—[15]。

水稻受低溫脅迫，生理和生化上易發(fā)生改變，從而影響生長和產(chǎn)量。前人研究表明，包括滲透調(diào)節(jié)[16]、抗氧化系統(tǒng)[17]、膜脂成分變化[18]、冷馴化[19]等過程參與了水稻耐冷調(diào)節(jié)過程，這些耐冷生理機(jī)制的相互作用使得水稻在寒冷環(huán)境中能夠更好地生存和生長。Liu等[20]對低溫和控溫條件下的水稻轉(zhuǎn)錄組和脂質(zhì)組進(jìn)行了綜合分析，轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，脂質(zhì)代謝（包括膜脂和脂肪酸代謝）可能是影響水稻耐寒性的重要因素。

本研究共定位到4個QTL區(qū)間，分別位于5號和7號染色體上，5號染色體定位到3個QTL，區(qū)間分別為 （10.1～11.3Mb） 和 1.6Mb（12.2～13.8Mb） ，7號染色體定位到1個QTL，區(qū)間為 2.4Mb（2.8～ 5.2Mb ）。蘆楚涵[21]研究發(fā)現(xiàn)，在水稻1號和7號染色體上連鎖到和性狀相關(guān)的QTL分別為qSH7 、qRL1、qRL7-1、qRL7-2、 qSR1 ！ qSR7-1 、qSR7-2 ，其中， qSH7 為主效QTL，與本研究苗期耐冷基因所在位置相同。張立娜[1]研究以新葉作為鑒定指標(biāo)，在第2號、第4號、第6號、第7號、第11號染色體鑒定到5個QTL，LOD在 3.4～ 9.9之間，貢獻(xiàn)率在 3.6%～12.0% 之間，其加性效應(yīng)均來自于吉冷1號，其中在第7號染色的定位與本研究相同。張斌22]研究發(fā)現(xiàn)第5號染色體上檢測到的QTL最多，本研究也在5號染色體上發(fā)現(xiàn)了耐冷位點(diǎn)，但和本研究發(fā)現(xiàn)的不是一個區(qū)間。冷響應(yīng)耐冷基因存在于多條染色體上。Andaya[23]等對水稻的苗期進(jìn)行耐冷性鑒定，在眾多基因座中篩選出1個主要的耐冷性QTL，被定于12號染色體上，命名為qCTS12。

綜上所述，耐冷基因在每個染色體上都存在，將目前研究對比可知，控制水稻苗期耐冷性的QTL在不同遺傳背景條件下具有一定的重演性[24]。

4結(jié)論

本研究通過構(gòu)建的DNA混池，在5號染色體和7號染色體上檢測到4個影響水稻苗期耐冷性的QTL。5號染色體發(fā)現(xiàn)了3個QTL，區(qū)間分別為 3.8Mb（4.4～8.2Mb），1.2Mb（10.1～ 11.3Mb ）和 1.6Mb（12.2～13.8Mb），7 號染色體發(fā)現(xiàn)了一個QTL，區(qū)間為 。功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，這些區(qū)間內(nèi)的基因主要參與了能量代謝。本研究為水稻苗期耐冷基因挖掘，進(jìn)一步展開耐冷資源篩選奠定了理論基礎(chǔ)。

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Identification of Main Effect QTL for Cold Tolerance in Rice Seedling Stage

HE Jiahua，MAO Honglin，ZOU Jinghui， ZHANG Xiangyu， YANG Luomiao （College of Agriculture，Northeast Agricultural University，Harbin 15oo30，China）

Abstract：Cold damage to rice seedlings at the seedling stage can lead to seedling death or growth stagnation， which seriously afects the yield and quality of rice. Screening cold-tolerant resources and analyzing their coldtolerance mechanisms are conducive to cold-tolerant breeding in rice. In this study，we used thecold-sensitive variety Daohuaxiang 2 as the female parent and the cold-tolerant variety Longjing 21 as the male parent to derive an F_2：3"population comprising 53o lines，from which 3O extreme cold-tolerant and 3O extreme coldsensitive individuals were selected to construct two DNA pools for resequencing analysis. Two QTL intervals on chromosome 5 and chromosome 7 were identified by SNP-index method. Three peaks were identified on chromosome 5，spanning 3.8Mb （4.4—8.2 Mb），1.2 Mb （10.1—11.3 Mb），and 1.6Mb （12.2-13.8Mb） ， and one peak was identified on chromosome 7，spanning 2.4 Mb （2.8-5.2Mb ），and functional annotation analyses revealed that genes within these intervals mainly involved in energy metabolism，and this study lays the foundation for subsequent exploration of cold tolerance gene mining in rice.

Keywords：rice;seedling stage;cold resistance;QTL